JPS62223197A - アルフア−１−抗プロテア−ゼ精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、本明細書にてアルファー１−抗トリプシンと
称するヒト・アルファー１−抗プロチアーゼの精製に関
する。

発明の背景 アルファー１−抗トリプシン（ＡＡＴ）は、血清および
他の種々の体液中に存在するアルファー１−グロブリン
である。肝臓にて合成された時、成熟ＡＡＴは約５００
００〜５５０００ダルトンの分子量を有する糖タンパク
質である。ＡＡＴによって抑制されるタンパク質分解酵
素は、トリプシン、キモトリプシン、膵臓エラスターゼ
、皮膚コラーゲン、レニンおよびワロキナーゼならびに
多形核リンパ球のプロテアーゼを包含する。遺伝的に獲
得されたヒトのＡＡＴの欠失は、種々の病理学的症状、
特に、肺気腫および肝疾患に関係している。例えば、モ
ース、ニュー・イングランド・ジャーナル・オフ・メデ
イシン（Ｍｏｒｓｅ　、Ｎ、Ｅｎｇ。

Ｊ、Ｍｅｄ、）、２９９（１９）　、１０４５−１０４
８（１９７８）およびｌ担（２０）、１０９９−１１０
５（１９７８）；トビンら、アルキブズ・オフ・インタ
ーナル・メデイシン（Ｔｏｂｉｎ　ｅｔ　ａＬ、、Ａｒ
ｃｈ、Ｉｎｔ、Ｍｅｄ、）、１４３（７）。

１３４２−１３４８（１９８２）；　およびカレルら、
ネイチャー（Ｃａｒｒｅｌ、１　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔ
ｕｒｅ）、２９８（５８７２）。

３２９−３３４（１９８２）参照。

エラスターゼは、肺組織を分解するプロテア−ゼである
。抑制されなければ、その活性により肺気腫を生じうる
。例えば、ガデツクら、アメリカン・レビュー・オフ゛
・レスピラトリー・デイズイーズ（Ｇａｄｅｋ　ｅｔ　
ａｌ、、Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐＨｒ。

Ｄｉｓ、）、１２７．５４５（１９８３）およびグレイ
サーら、アメリカン・レビュー・オフ・レスピラトリー
・デイズイーズ（Ｇｌａｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｍ、
Ｒｅｖ。

Ｒｅ５ｐＨｒ、　Ｄｉｓ、）　、　１２７．５４°７−
５５３（１９８３）　　は、ＡＡＴが肺気腫の治療に有
用でありうることを示している。

その治療的有用性のゆえに、および遺伝的なＡＡＴの欠
失患者の補欠治療法のようなある種の徴候に対して比較
的多量を必要とするため、研究者は、ＡＡＴを多量に製
造する方法を探索してきた。従来、そのような方法とし
ては、血漿からのＡＡＴの精製があった。

多量の加工した遺伝子産生物を産生ずるそのような方法
を約束するために、近年の努力は、形質転換した微生物
または細胞、特にイー・コリおよび酵母におけるＡＡＴ
の産生に焦点が当てられている。数人の研究者は、その
ような努力が成功したことを報告した。しかし、医薬的
適用に有用なそのような組替え型ＡＡＴの精製のための
実用的方法は得られていない。

本発明の目的は、血清からのＡＡＴまたは組替え型微生
物、酵母もしくは細胞、特に組替え型細芳および酵母か
らのＡＡＴの大規模に実施できる改良精製法を提供する
ものである。

ローレルら、ジャーナル・オフ・クロマトグラフィー（
Ｌａｕｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇ、）。

里、５３〜６１（１９８３）は、チオール−ジスルフィ
ド交換クロマトグラフィーを用いてＡＡＴを単離するこ
とを開示している。

発明の要約 本発明は、１）ＡＡＴの不純溶液をイオン交換吸着剤に
接触させ、そこから該ＡＡＴを溶出し、２）１）からの
溶出液をチオール−ジスルフィド交換吸着剤に接触させ
、そこから該ＡＡＴを溶出し、３）２）からの溶出液を
固体担体に結合させたヘパリンに接触させ、４）３）か
らの溶出液を亜鉛−キレート吸着剤に接触させ、そこか
ら該ＡＡＴを溶出し、５）４）からの溶出液をイオン交
換吸着剤に接触させ、そこから該ＡＡＴを溶出すること
を特徴とするＡＡＴの不純溶液からのＡＡＴの精製法を
提供するものである。

発明の詳細 な説明の方法は、各工程がそれぞれタンパク質精製の標
準方法に従って行なわれる一連の吸着工程からなる。各
工程は、一般的な意味において、標準的タンパク質精製
法であるが、特定の順序の特定の工程は、処理工程の無
数の可能性および有効かつ効率的な精製法を達成するた
めの無数の順序から選択しなければならない。

本発明の方法によって精製するＡＡＴは、血清由来ＡＡ
Ｔと同一とすることができる。本発明は、また、変種Ａ
ＡＴ分子、すなわち、ある種の組替え型ＤＮＡ由来ＡＡ
Ｔタンパク質にあてはまるような２次または３次構造に
おいて天然ＡＡＴから変化したＡＡＴ分子に適用するこ
とができる。チオール−ジスルフィド交換工程において
ジスルフィド結合を形成する変種ＡＡＴの能力が顕著な
悪影響を受けない場合、もとの構造と異なる変種ＡＡＴ
分子も使用することができる。有用な変種ＡＡ、　Ｔ分
子には、例えば、カートニーら（Ｃｏｕｒｔｎ、ｅｙｅ
ｔａｌ、、）、ヨーロッパ特許出願第１１４７７７号、
カートニーら、ネイチャー（Ｃｏｕｒｔｎ、ｅｙ　ｅｔ
　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ）、３１３．１４９（１９８５）およびボ
レンら（Ｂｏｌ、１ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）　　、ＤＮＡ
、　　２．２５５　（１９８３）に開示されているもの
が包含される。

本発明の方法の工程は、好ましくは、クロマトグラフィ
一工程、すなわち、バッチ法よりもむしろ吸着剤に通す
連続流動法として行なわれる。本発明の方法に用いられ
る吸着剤は、種々のＡＡＴ含有溶液を通し、それによっ
てリガンドと接触させてＡ　Ａ　Ｔまたは１もしくは２
以上の不純物を吸着する固体担体マトリックスからなる
。そのような公知の固体担体としては、ガラス、シリカ
、アルミナおよびジルコニアならびにアガロース、セル
ロース、デキストラン、ポリアミド、ポリアクリルアミ
ドおよび二官能性アクリレートと種々のヒドロキシル化
モノマーのビニルコポリマーのような有機担体が包含さ
れる。商業的に入手できる担体としては、アフィーゲノ
ノ、セファデックｐＨＰ−２０のようなＨＰ樹脂、ＸＡ
Ｄ樹脂、セファロース■などが包含される。

該方法は、ＡＡＴの不純溶液、すなわち、ＡＡＴが純度
２５％以下、代表的には純度１０−１５係以下の溶液に
用いられる。そのような溶液としては、例えば、血清、
ＡＡＴが分泌されている生産細菌または他の細胞の培養
からの培地またはＡＡＴが溶解している細菌または酵母
宿主からの抽出物がある。好ましくは、粗製細菌または
酵母抽出物を、例えば、選択的硫酸アンモニウム沈殿、
ついでポリアルキレングリコールの使用などによる不純
タンパク質の再可溶化または選択的沈殿によって部分的
に精製する。ＡＡＴ含有血清の調製法は公知である。可
溶化タンパク質を含有する細菌または他の細胞の抽出物
の調製法またはそのような抽出物中のタンパク質の可溶
化法も公知である。例えば、イー・コリ形質転換体は遠
心分離によって集められ、０．５■／　ｒｒＬｇのリゾ
チームおよび１０ｑ／ｍｅのＤＮＡアーゼを補足した１
／１０容のＴＥＳ緩衝液（５０ｍ　Ｍ　トリス（ｐＨ８
）、５ｍＭＥＤＴＡおよび２５％シュークロース）中ｏ
℃にて３０分間溶菌する。ついで、トリトンＸＩ　００
を加えて０１％の最終濃度にする。該懸濁液を０℃にて
１５分間インキュベートし、ついでＩＭＭｇｃｚ２　ｆ
添加り、　テ８０　ｍＭ　Ｍｇ＋＋にする。この懸濁液
を２５℃で５分間インキュベートする。

１５０００　ｒｐｍにて１ｏ分間遠心分離した後、上清
を集める。硫酸アンモニウムを該上清に加え、該溶液ｉ
１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。

該Ａ　Ａ、　Ｔは、５０〜７５％硫駿アンモニウムフラ
クション中に検出される。この沈殿を緩衝液（５０ｍＭ
トリス（ｐＨ８）、２５ｍＭ　ＮａＣＪ）中に再可溶化
し、同じ緩衝液に対して透析する。

本発明の方法の第１工程は、脂質および大部分の核酸を
除去するために温和な洗浄剤の存在下で行なわれるイオ
ン交換工程である。イオン交換カラム、好ましくは、Ｄ
ＥＡＥ−アガロースのようなりＥＡＥカラムを少量の洗
浄剤を含有するリン酸塩緩衝液を用いて約中性ｐＨ１好
ましくはｐＨ６，５になるまで平衡にする。ＡＡＴの不
純溶液を該カラムに流した後、該カラムを平衡緩衝液で
洗浄する。ついで、該ＡＡＴを平衡緩衝液中の塩、好ま
しくは約１５０−２５０　ｍＭ　ＮａＣ２で溶出する。

該塩溶出液を濾過または透析などによって濃縮する。エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　）ｆ約２０ｍＭの最
終濃縮物に加え、該ｐＨｆ的中性、例えば、）ｐＨ７〜
約ｐＨ１０、好ましくはｐＨ８〜９に上昇させる。

第２工程において、工程１）からの濃縮溶出物をチオー
ル−ジスルフィド交換吸着剤に接触させる。

そのような方法に用いられる固定化ヒト・カッパ（Ｋ）
＠鎖は、ローレルら、ジャーナル・オフ・り０７トグラ
フイー（Ｌａｕｒｅ　ｌ　ｌ　ｅ　ｔ　ａ　１．　、　
Ｊ　、Ｃｈｒａｍｔｏｇ、）２７８．５３〜６１（１９
８３）に記載されている。還元剤、好ましくは、４−ニ
トロフェニルジスルフィド−３，３′−ジカルボン酸お
よび／またはベーターメルカプトエタノールを用いてジ
スルフィド結合を開裂させ固体担体に結合している該に
軽鎖からＡＡＴを溶出する。該溶出液を濃縮し、脱塩し
、ｐＨ７−８に調整する。

ついで、工程２）からの濃縮溶出液を大部分の残留リポ
タンパク質を吸着するイオン強度にてヘパＩＪ　７−ア
ガロースカラムのような固体担体に結合したヘパリンに
接触させる。流出液、すなわち、この吸着剤からの溶出
液は、該ＡＡＴを含有する。

第４工程において、ヘパリン工程からの溶出液を、好ま
しくはアガロースカラムなどの亜鉛−キレートカラムの
ような固定化Ｚｎ２＋イオンに接触させて、選択的にＡ
ＡＴを吸着させる。該ｐＨを６以下、例えば、５．５に
下げるかまたはヒスチジンで段階的に溶出することによ
って該ＡＡＴを溶出させる。酸溶出後、該ｐＨを直ちに
およそ中性、すなわちｐＨ６，５−７，５に再調整する
。ついで、該溶出液を透析して溶出剤を除去する。

第５工程において、該ＡＡＴ溶液を第２イオン交換吸着
剤、好ましくはアミ／ヘキシルアガロースカラムに接触
させる。塩濃度勾配法（１５０−２５０ｍＭＮａｃｌ　
）を用いてＡＡＴを特異的に溶出する。純枠なＡＡＴ溶
出液を透析および濃縮、好ましくは凍結乾燥などにより
脱塩する。

所望により、この方法から得られたＡＡＴＫさらに例え
ば固定化アンヒドロキモトリプシンまたは固定化抗体を
用いたＡＡＴまたはタンパク質不純物に対するアフイニ
テイクロマトグラフイーなどによる精製工程に付して痕
跡の不純物を除去することができる。

実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、これらに限定されるものではない。

実施例１ 酵母からの成熟ＡＡＴの精製 前記カベシンら、プロシーディンゲス・オフ・−ズ・オ
フ・ザ・ユナイテッド・マブ・アメリカ（Ｃａｂｅｚｏ
ｎ　ａｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ。

ｔＪｓＡ）、８１．６５９４〜６５９８（１９８４）ト
同様に酵母ａｒｇ　３プロモーターのコントロールの下
、組換え型プラスミド発現成熟ヒ１−ＡＡＴを用イテペ
プチダーゼ欠失ニス・セレビシアエ（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株１０Ｓ４４２１ｅｕ２−３　
。

Ｊｅｕ　２−１１２　、　ｐｅｐ４−３　）およびＴＣ
ＹＩ（ｕｒａ　３　、　／ｅｕ　２欠夫）中にＡＡＴを
発現させる。

予備沈殿：　５０　ｍＭ　ト’Ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）中の２０　ｒｒ）Ｍ　ｎ−メルカプトエタノー
ル、５ｍＭＥＤＴＡ、１　ｍＭ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆおよび
１　ｍＭベンズアミジン（全量２．０〜２．ｓＪ）の存
在下にエタノール／ドライアイスで冷却した３　０００
　ｒ、ｐ、ｍ紹 のダイノーミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉ　ｌ　ｌ　）　餠給速
度５　ｌ！／ｈ　）へ にて約１．５〜２Ｋｇの酵母の細胞膜を機械的に破壊し
た後、撹拌下、該粗製抽出物のｐＨをＩＮ塩酸にて６．
５に調整する。固体ポリエチレングリコール１０００ｒ
ｒ７％まで加える。２時間インキュベーションした後、
この粗製抽出物を１６０００ｇにて５時間遠心分離する
。超音波処理下７％ＰＥＧ１００Ｏ含有２０ｒｎＭリン
酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）ＩＥ中で沈殿した溝母膜（約
５００ｍ１りを再懸濁し、少なくとも５時間再遠心分離
する。両方の上清を貯蔵しく約３ｅ）、トリトンＷＲ１
３３９を０，１チまで加え、該ｐＨを６．５に調整する
。全イオン強度を測定し、蒸留水で希釈して７０　ｍＭ
のＮａ（Ｊ？当量単位に調整する。

ＤＥＡＥ−クロマトグラフイー二ついで、細胞小器官お
よびリポタンパクの部分的に減少したＡＡＴ含有抽出物
（本明細書におし・てはα１−ＰＩ）を６００　ａｖｈ
の流量にて０．１％トリトンおよび０゜０１％ＮａＮ３
を含有する２　０　ｍＭ　’Ｊシン塩緩衝液（ｐＨ６，
５）で平衡にした調製ＤＥＡＥ−セファロース・ファー
スト・フローカラム（５Ｘ２６ｃｍ）に付す。該溶出液
の吸光度（２８０ｎｍ　）が２．０以下に低下するまで
該カラムを最初の緩衝液で洗浄した後（約１０ｒ）、α
１−ＰＩ含有タン／Ｎ１１クフラクションＩ＋初の緩衝
液に加えたＮａＣ１１５０ｍＭで段階的に溶出する。残
留固着化合物をそれぞれ１ＭＮａＣ２および０．５　Ｍ
　ＮａＯＨ４ごて段階的に溶出し、その後膣カラムを最
初の緩衝液で再度平衡にする。該α１を’Ｉフラクシヨ
ンを約４００ｒｎｅまで濃縮した後、ＥＤＴＡを２０　
ｍＭまで加え、固体トリス粉末にて該ｐＨを８．５まで
上昇させる。

チオール−交換クロマトグラフイー二前工程で得られた
少し濃縮した物質をプロムシアンカ゛ンプリング後セフ
ァロース４Ｂ上に不溶化したヒト・イムノグロブリン軽
鎖、遺伝子型Ｋからなる樹脂上ニ付す。前記のように、
ヒトに一軽鎖は、ペンスージョーンズ症候群に罹患して
いる骨髄腫患者の尿から単離できる。数バッチ分の濃縮
尿をＤＥＡＥ−セファロースカラムに付した後、ｌ　０
０ｍＭＥＤＴＡ含有ＩＭトリ含有塩酸緩衝液（ｐＨ８，
５）中の飽和濃度のビス−（４−ニトロフェニル）ジス
ルフィド−３，３′−ジカルボン酸（ＤＴＮＢ）ととも
に室温で４日間該に一鎖をインキュベートする。この方
法は、該に鎖に存在するＣ−末端システィン間のジスル
フィド結合の形成の際に生じるダイマーを有効に解離し
、チオール官能基からの保護基を導入する。セファデッ
クスＧ−２５クロマトグラフイーによって過剰のＤＴＮ
ＢおよびＴＮＢを分離した後、該保護に一鎖を５００　
ｍｌのセファロース４Ｂに結合し、使用する直前にＣＮ
Ｂｒで活性化する。この方法において、β−メルカプト
エタノール（β−５Ｈ）とのジスルフィド架橋の完全還
元の際に該樹脂から解離したＴＮＢの吸光度（４１２ｎ
ｍ）から計算して、ゲル１　ｍｌ当り０４モルのチオー
ルを導入する。

該α１−ＰＴ溶液を２００ｍＭＮａＣ２，２０ｍＭＥＤ
ＴＡ、０．１％トリトンおよび００１％ＮａＮ３を含有
する５　０　ｍＭ　ト’Ｊス塩酸緩衝液で平衡にした不
溶化に一鎖のカラム（２，６×９４ｃｍ）に１００ｍｒ
ｈの流欧で通す。該流出液を２０　ｍＭβ−ＳＨで処理
してジスルフィド架橋含有Ｔ　Ｎ　Ｂおよび可溶化タン
パク質を還元し、該クロマトグラフィー緩衝液に対して
透析し、それに活性炭を加えてＴＮＢの除去を促進する
。ついで、この流出液（α１−ＰＩが全て消失してはい
ない）を最初の流出について記したよう−に核力ラムに
再度通ｔ。

それぞれの通過後、該カラムを最初の緩衝液で洗浄し、
α１−ＰＩ含含有タンパクツフラクション、特に、つぎ
の平衡ニ ーＳ−３−ＴＮＢ＋タンパク質ＳＨニーＳ−５−Ｐ＋Ｔ
Ｎ’Ｂ−５Ｈを逆転させ、そのため数種のタンパク質、
とりわけα□−ＰＩを解離させる過剰（７）ＴＮＢ（最
初の緩衝液中１　’１ｋｌＯ’）　Ｄ　Ｔ　Ｎ　Ｂ　十
０２５■／ｒｎｅのジチオスレイトール）にて溶出する
。

ついで、最初の緩衝液に加えた２　０　ｍＭβ−８Ｈを
用いてジスルフィド架橋を完全還元することによって全
溶出を行なう。使用前に、最初の緩衝液中のＤ　Ｔ　Ｎ
　Ｂ　１　”Ｉｙ勺を通して該カラムを再活性する。

特に、溶出したα１−ＰＩＩ有フラクションを２０ｍＭ
β−３Ｈで還元し、２０　ｍＭ　’Ｊシン塩緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）に対して透析し、それに活性炭を加える。

別法として、還元後、該溶出液をアミコンＤＣ２濃縮器
中で１５０ａＪに濃縮し、２０ｍＭ’Ｊン酸塩緩シン（
ｐＨ７，５）で平衡にしだカラム（５×５０　ｃｍ　）
中のセファデックスＧ−２５クロマトグラフイーにより
脱塩する。

ヘパリン−アガロース−クロマトグラフィｍ：りロマト
グラフイー的に脱塩したα、−ｐｒ溶液の透析物を２０
　ｍＭ　’Ｊシン緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡にしたヘ
パリン−アガロースカラム（２，６Ｘ３６１）に付し、
７０　ａＩｙｈの流士にて最初の緩衝液で洗浄する。こ
の工程の流出液を貯蔵し、その後使用する。該カラムに
結合したタンパク質をＩＭＮａＣｌで溶出し、廃棄する
。５回の繰返しのたびに２ＭＮａ５ＣＮの溶液を通して
、非特異的相互作用によって該アガロースに付着した分
子を解離させる。

Ｚｎ−キレート・クロマトグラフイー二前工程の流出液
を収集したフラクションのプールとして、あるいは該ヘ
パリン−アガロースカラムの出口を直結することにより
Ｚｎ２＋イオンで荷電し、かつ、２０　ｍＭリン酸塩緩
衝液（ｐＨ７，５）テ平衡させたキレート化セファロー
スのカラム（２，６×１９ｃｍ）の人口に入れる。

該カラムを完全に荷電した後、それを０．５ＭＮａＣＪ
鯰有する２　５　ｍ、Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）
で洗浄する。該ｐＨを５．５に低下させた後または該洗
浄緩衝液中のヒスチジン（０〜２５ｒｒＩＭ）で濃度勾
配法溶出によって主にα、−ＰＩの特定の溶出液を得る
。ついで、０．２　Ｍ　ト’Ｊスー塩酸緩衝液（ｐ）（
８，０）中の５０ｍＭＥＤＴＡにて非選択的溶出を行な
い、それから該カラムをＺｎＣｊ？２で再度平衡にする
。酸溶出液の場合、該溶出液の収集の間に該試１験管に
存在するＩ　Ｍ　トＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　
１ａＪで該ｐＨｆ約７まで直ちに上昇させる。ついで、
貯蔵した溶出液を２５　ｍＭ　！Ｊシン塩緩衝液（ｐＨ
６，５）、２５　ｍＭ　ＮａＣｅに対して透析する。

ＡＨ−セフアロースクロマトグラフイー二マタ少し不純
物が混入しているα１−ＰＩ溶液をイオン交換剤として
用いられる２５ｍＭＪン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）、２
５ｍＭ　ＮａＣ１で平衡にしたアミ／−へキシルアガロ
ースカラム（２，６／１８ｃｍ）（ＡＩ（−セファロー
ス、ファルマシア、ストックホルム、スエーデン）に付
す。吸着したタンパク質を５０ａｌ／ｈ　　の流量にて
最初の緩衝液中（７ＪａＣ１の線形濃度勾配法（２５か
ら３００ｍＭ）（全容量６０（１＋ｅ）によって溶出す
る。純粋なα１−ＰＩ含有フラクションを貯蔵し、５ｍ
Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）、１５ｍＭ　ＮａＣ１に対
して透析し、凍結乾燥する。凍結乾燥前に最初の体積の
１／１゜の精製α１−ＰＩを蒸留水に溶解して、生物活
性の維持に適したイオン強度を有する１０倍に濃縮した
試料を得る。

実施例２ 種々のＡＡＴ分子の精製および活性 実質的に前記実施例１の方法により、つぎのＡＡＴ分子
を精製する。

■、５Ｎ−宋端アミノ酸が欠失し、かつ、イー・コリ中
に発現したＡＡＴ： ２、イー・コリ中に発現した成熟Ａ　Ａ　Ｔ　（Ｎ　−
ｇｌｕの代わりにＮ　−ｒｒｅｔを有し、かつ、８位の
ａｌａを欠失している）； ３、酵母中に発現した成熟ＡＡＴ（Ｎ−ｇｌｕの代わり
にＮ−兜ｔを有する）； ４、ヒト血漿からのＡＡＴ イー・コリ形質転換体を溶菌して細胞抽出物を得、それ
から実質的に前記の精製と同様にして硫酸アンモニウム
でＡＡＴを沈殿させる。

ＡＡＴは、常法により血漿から得られる。

標準トリプシン抑制検定にて、本発明の方法により精製
した４種のＡＡＴタンパク質の活性を血清から得た標準
ＡＡＴ調製物の活性と比較する。

該検定は、トリプシンに対するα１−抗トリプシンの抑
制能力を測定する。該検定は、色原体基質５２４４４（
Ｌ−ピログルタミルグリシル−Ｌ−フルギニン、ｐ−ニ
トロアニリド塩酸塩、カビ、ダイアグツステイカ、スト
ックホルム、スエーデン（Ｋａｂｉ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ））を用い
るマイクロテストからなる。該ポリスチレンマイクロテ
ストプレートを１％ウシ血清アルブミンとともに１時間
インキュベートし、蒸留水で充分に洗浄する。種々の濃
度のα１−抗トリプシンを所定量のトリプシンと２００
μｒ最終反応容量の０．１Ｍ１−リス−塩酸（ｐＨ８，
２）１０．１５　ＭＮａ（Ｊｌｏ、０１　Ｍ　Ｅ　Ｄ　
Ｔ　Ａ　／　０．５％ポリエチレングリコール（Ｍｒ６
０００）中３７℃にて２０分間インキュベートする。試
料をゆっくり室温に冷却し、ついて色原体基質（０，０
０３Ｍ５２４４４水溶液２０μで　）にさらす。室温に
て５分後、５０％酢酸５０μｅを用いて反応を止める。

４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロ−ＥＬＩＳＡオー
トマチック・リーダー（ダイナチック（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ）ＡＭＩ　２０　）にて読む。トリプシンおよびα１
−抗トリプシンの両方について補正曲線を決定する。検
定す乞試料を反応緩衝液にて連続的に希釈する゛。

つぎの表に示した結果は、本発明の方法が、そのプロテ
アーゼ抑制活性に悪影響を及ぼすことなく変種ＡＡＴ分
子を含む種々の源からのＡＡＴの精製に用いることがで
きるということを明らかにし−Ｃ（、、る。試料１．２
．３および４は前記と同意義である。

微生物産生精製ＡＡＴまたは貯蔵ヒト血漿から得た精製
ＡＡＴの活性検定 田トリプシン活性の抑制チを括弧内に示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）１）ＡＡＴの不純溶液をイオン交換吸着剤に接触
   させ、そこから該ＡＡＴを溶出し、２）工程１）からの
   溶出液をチオール−ジスルフィド交換吸着剤に接触させ
   、そこから該ＡＡＴを溶出し、３）工程２）からの溶出
   液を固体担体に結合させたヘパリンに接触させ、４）工
   程３）からの溶出液を亜鉛−キレート吸着剤に接触させ
   、そこから該ＡＡＴを溶出し、５）工程４）からの溶出
   液をイオン交換吸着剤に接触させ、そこから該ＡＡＴを
   溶出することを特徴とするＡＡＴの不純溶液からのＡＡ
   Ｔの精製法。
2. （２）それぞれの工程をクロマトグラフィー法にて行な
   い、かつ、工程１）において、洗浄剤の存在下に該溶液
   をＤＥＡＥイオン交換カラムに接触させ、１５０−２５
   ０ｍＭＮａＣｌを用いてそこから該ＡＡＴを溶出し、工
   程２）において、工程１）からの溶出液を固定化ヒトに
   軽鎖カラムに接触させ、還元剤を用いてそこから該ＡＡ
   Ｔを溶出し、工程４）において、工程３）からの溶出液
   をＺｎ−キレートカラムに接触させ、該ｐＨを６以下に
   下げることによつてまたは結合したＡＡＴをヒスチジン
   と接触させ、直ちに該ｐＨを６．５〜７．５に調整する
   ことによつてそこから該ＡＡＴを溶出し、工程５）にお
   いて、工程３）からの溶出液をアミノ−ヘキシルイオン
   交換カラムに接触させ、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ〜２５０
   ｍＭ）を用いてそこから該ＡＡＴを溶出することを特徴
   とする前記第（１）項の精製法。