CN109678969A - 一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法 - Google Patents

一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种CTLA4‑Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括：发酵液预处理、亲和层析及复合型阴离子交换层析。本发明提供的方法通过亲和层析和复合型阴离子交换层析两步即可完成对CTLA4‑Ig融合蛋白的纯化，而且能够兼顾活性、纯度、得率三个维度，亲和层析用于捕获融合蛋白，复合型阴离子交换层析用于精细纯化蛋白，最终获得质量合格的CTLA4‑Ig融合蛋白，该方法相对现有技术提供的纯化方法而言，简化了纯化工艺，缩短了纯化时间，在最适宜的实验条件下结合实验操作方法获得了产率较高的活性融合蛋白，大大节省了纯化成本。

Description

一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法。
背景技术
细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)是免疫球蛋白超家族的成员，也是T细胞上的一种跨膜受体，CTLA4与CD28共同享有B7分子配体，且CTLA4与配体的亲和力比CD28更高，通过与抗原递呈细胞上的CD80和CD86结合，抑制T细胞的激活。激活的T-细胞与类风湿性关节炎(RA)发病机制相关。且大量存在于RA患者的关节滑膜中，T-细胞完全激活至少需要得到来自抗体原递呈细胞的2种信号传导，其中T-细胞上的CD28与抗原递呈细胞上的CD80或CD86的相互作用就是共刺激信号传导的关键步骤。CTLA4通过与抗原递呈细胞上CD80和CD8结合，进而阻断两者与T-细胞上的CD28的相互作用，从而抑制T-细胞的激活。
CTLA4-Ig是由CTLA4细胞外功能区和人IgG2-Fc段组成的融合蛋白，其通过抑制共刺激分子CD28和CD80/CD86活化T细胞的第二刺激信号，阻断B7-1和B7-2与T细胞表面上的CD28的功能性相互作用，从而抑制T细胞活化，进而抑制免疫应答。因此，CTLA4-Ig融合蛋白常用于治疗对传统的治疗类风湿性关节炎药物或TNF拮抗剂无效的中、重度类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)，可延缓疾病带来的结构性损伤进程，改善患者躯体功能，减轻患者体征和症状。
由于CTLA4-Ig融合蛋白药用价值的重要性，很多企业投入大量成本生产CTLA4-Ig融合蛋白，为了能够得到高质量的融合蛋白产品，CTLA4-Ig融合蛋白的纯化工艺尤为重要，但是由于CTLA4-Ig融合蛋白结构的特殊性，CTLA4-Ig融合蛋白的等电点较低，与细胞的核酸和残留DNA相近，为目的蛋白的纯化增加了困难，造成蛋白纯化得率低、宿主DNA和残留核酸超标等问题，此外，唾液酸的含量与该融合蛋白的活性相关，去除低唾液酸的CTLA4-Ig融合蛋白也会导致目的蛋白回收率进一步的降低。因此，给CTLA4-Ig融合蛋白的纯化带来了技术问题，使得很难兼顾活性、纯度、得率三个维度，难以形成适合于作为CTLA4-Ig融合蛋白的规模化制备工艺，这将给下游纯化工作带来困难。
目前，针对CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，国外已经上市的药物阿巴西普的原研单位百时美施贵宝(BMS)公司针对该产品申请了发明专利(申请号为US20090252749A1)，在该专利中公开的纯化方法采用亲和蛋白A层析、阴离子交换层析和疏水层析纯化目的蛋白。但是三步纯化工艺的回收率低、经济成本高以及疏水层析所用到高盐有使蛋白失去活性的风险。此外，基因泰克公司申请的专利CN200880119331.X公开了一种抗VEGF单克隆抗体的纯化方法，在该蛋白的纯化工艺中同样采用三步纯化工艺，通过离子交换替代亲和蛋白A层析从而节约生产成本，但阳离子层析作为第一步层析，最大的问题在于样品pH值和电导率值的调节，一方面引入了浓缩换液的额外步骤，降低纯化回收率；另一方面在最终调节过程中往往会产生沉淀从而造成样品的损失。同时，阳离子的动态载量低于亲和蛋白A层析，反而导致成本的增加。为此，急需开发一种专门针对CTLA4-Ig融合蛋白纯化的方法。本发明所述的CTLA4-Ig融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种操作简单、成本低，且能够保证蛋白活性及纯度，有效提高CTLA4-Ig融合蛋白纯化回收率的纯化方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，并回收滤液；
S2、亲和层析：
用3-5CV的缓冲液Ⅰ以65-100cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，将所述滤液以65-100cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
使用缓冲液Ⅲ以65-100cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
S3、复合型阴离子交换层析：
用3-5CV的缓冲液Ⅳ以65-100cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，将所述洗脱液以65-100cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以65-100cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
本发明提供了专门针对CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，通过一步深层过滤和两步层析过滤的方法能够保证纯化蛋白活性的基础上，提高纯化效率和纯度，大大降低得到的蛋白液中宿主蛋白(HCP)、残留proteinA、DNA、多聚体、低唾液酸蛋白等多种污染物的含量，从而达到显著提高目的蛋白纯度的目标，本发明中，深层过滤用于去除细胞及碎片，亲和层析用于捕获融合蛋白，复合型阴离子交换层析用于精细纯化蛋白，最终获得质量合格的CTLA4-Ig融合蛋白；该方法与现有方法相比，通过该方法能够在最短时间内采用最少步骤的纯化工艺得到最高产率的活性蛋白质，操作简单，而且成本较低，能够满足实验工作者对CTLA4-Ig融合蛋白的纯化要求。
进一步的，步骤S1中，所述深层过滤中所述CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量≤200L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力≤3.5bar。本发明在步骤S1中限定了深层过滤的具体过滤条件，例如膜面积，操作压力等，该实验条件下能够有效去除细胞碎片和有形物，为层析过滤提供基础。
进一步的，步骤S1中，过滤后的所述滤液在2-8℃的温度下保存，且保存天数≤5天。为了能够保证蛋白活性，深层过滤后的融合蛋白需要在2-8℃的温度下保存最多不超过5天，温度过高或过低或者存放时间超过5天则活性无法保证，所以为了提高纯化效果，需要严格监控温度和存放时间。
进一步的，步骤S2中，所述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure。本发明在亲和层析柱中选择Mabselect Sure作为介质可以捕获滤液中的抗体，与传统的亲和层析介质相比，Mabselect Sure具有稳定性好、Protein A脱落少等优点。
进一步的，步骤S2中，所述缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.2-7.7，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为15-20mS/cm；
缓冲液Ⅰ主要用于冲洗非特异性结合的杂质，缓冲液Ⅰ中含有的磷酸二氢钠和氯化钠能够保证蛋白的稳定性，150mmol/L的氯化钠可以防止融合蛋白从层析柱中流穿，从而使柱子能够结合目的蛋白，洗脱除去杂蛋白，此外，为了适应CTLA4-Ig融合蛋白的等电点，通过大量实验验证，pH为7.2-7.7缓冲液Ⅰ能够满足纯化需求，而且在该pH范围内，缓冲液的缓冲能力较高，同时根据pH设定电导率为15-20mS/cm能够提高纯化效率。
优选的，所述缓冲液Ⅰ还包括3mmol/L甘氨酸钠、10mmol/L EDTA；缓冲液Ⅰ中还含有甘氨酸钠和EDTA，其中，甘氨酸钠属于表面活性剂，主要起到保护蛋白不被破坏，同时促进蛋白溶解性的作用，此外，EDTA为金属螯合剂，能够与镁离子结合防止目标蛋白质被所含的金属蛋白酶分解，有效保护融合蛋白。
优选的，所述缓冲液Ⅰ还包括5mmol/L的半乳糖。半乳糖可以增加缓冲液粘度，具有促溶解的作用，有助于防止蛋白聚集，保证了融合蛋白的稳定性。
进一步的，步骤S2中，所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.2-7.7，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为40-60mS/cm；缓冲液Ⅱ主要用于淋洗作用，所以缓冲液Ⅱ选择含有500mmol/L的氯化钠的高盐溶液进行淋洗，此外，缓冲液Ⅱ中含有的磷酸二氢钠能够提高融合蛋白的稳定性，为蛋白纯化提供基础。
优选的，所述缓冲液Ⅱ还包括5mmol/L的山梨糖醇、10mmol/L的尿素、10mmol/L的柠檬酸钠。缓冲液Ⅱ中加入的山梨糖醇能够进一步提高融合蛋白的稳定性，防止蛋白聚集。此外，尿素和柠檬酸钠的加入可以屏蔽蛋白间的离子相互作用，帮助蛋白溶解，防止蛋白聚集，充分淋洗，提高了蛋白纯度。
进一步的，步骤S2中，所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.4-3.8；缓冲液Ⅲ为洗脱液，加入适当的精氨酸，使抗体的稳定性提高，减少多聚体的产生，既不影响融合蛋白的活性，同时可以提高蛋白溶解性，可大大提高产品的回收率。
优选的，所述缓冲液Ⅲ还包括6mmol/L的聚乙二醇，添加的聚乙二醇辅助精氨酸作为稳定剂和促溶剂，大大提高了回收率。
进一步的，步骤S3中，所述复合层析柱的介质为capto adhere。复合层析柱介质选择使用capto adhere能够用于精细纯化蛋白，对残留的DNA具有显著的去除效果，确保最终蛋白液的残留DNA符合质量标准。
进一步的，步骤S3中，所述缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.7-7.1，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为23-28mS/cm。
缓冲液Ⅳ中含有的Tris-HCl不仅不影响蛋白活性，而且具有可靠的缓冲能力，此外与氯化钠配合，能够促进蛋白的溶解，此外，200mmol/L的氯化钠与蛋白部分结合，具有保护蛋白不易变性的有点，同时起到蛋白淋洗的作用。
进一步的，步骤S3中，所述缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.7-7.1，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为95-100mS/cm。低浓度的氯化钠可以促进蛋白溶解，进一步提高蛋白的纯化效果。
本发明的有益效果如下：本发明提供的方法采用亲和层析和复合型阴离子交换层析两步即可完成对CTLA4-Ig融合蛋白的纯化，而且能够兼顾活性、纯度、得率三个维度，亲和层析用于捕获融合蛋白，复合型阴离子交换层析用于精细纯化蛋白，最终获得质量合格的CTLA4-Ig融合蛋白，该方法相对现有技术提供的纯化方法而言，简化了纯化工艺，缩短了纯化时间，在最适宜的实验条件下结合实验操作方法获得了产率较高的活性融合蛋白，大大节省了纯化成本。
附图说明
图1为本发明实施例14提供的纯化方法纯化后的CTLA4-Ig融合蛋白SEC-HPLC液相分析的纯度图谱；
图2为本发明实验一中各实施例纯度的柱形图；
图3为本发明实验二中各实施例回收率的柱形图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为200L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为3.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在8℃的温度下保存，且保存天数为5天。
S2、亲和层析：用5CV的缓冲液Ⅰ以100cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以100cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.7，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为20mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.7，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为60mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以100cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.8。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以100cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以100cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以100cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为7.1，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为28mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为7.1，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为100mS/cm。
实施例2
本发明实施例2提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例3
本发明实施例3提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为80L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为1bar，并回收滤液，过滤后的滤液在2℃的温度下保存，且保存天数为1天。
S2、亲和层析：用3CV的缓冲液Ⅰ以65cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以65cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.2，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为15mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.2，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为40mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以65cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.4。
S3、复合型阴离子交换层析：用3CV的缓冲液Ⅳ以65cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以65cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以65cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.7，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为23mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.7，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为95mS/cm。
实施例4
本发明实施例4提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠、3mmol/L甘氨酸钠、10mmol/L EDTA，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例5
本发明实施例5提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠、3mmol/L甘氨酸钠、10mmol/L EDTA、5mmol/L的半乳糖，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例6
本发明实施例6提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠、5mmol/L的山梨糖醇、10mmol/L的尿素、10mmol/L的柠檬酸钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例7
本发明实施例7提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠、3mmol/L甘氨酸钠、10mmol/L EDTA，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠、5mmol/L的山梨糖醇、10mmol/L的尿素、10mmol/L的柠檬酸钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例8
本发明实施例8提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠、3mmol/L甘氨酸钠、10mmol/L EDTA、5mmol/L的半乳糖，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠、5mmol/L的山梨糖醇、10mmol/L的尿素、10mmol/L的柠檬酸钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例9
本发明实施例9提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠、6mmol/L的聚乙二醇，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例10
本发明实施例10提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠、3mmol/L甘氨酸钠、10mmol/L EDTA，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠、6mmol/L的聚乙二醇，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例11
本发明实施例11提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠、5mmol/L的山梨糖醇、10mmol/L的尿素、10mmol/L的柠檬酸钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠、6mmol/L的聚乙二醇，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例12
本发明实施例12提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠、3mmol/L甘氨酸钠、10mmol/L EDTA、5mmol/L的半乳糖，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠、6mmol/L的聚乙二醇，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例13
本发明实施例13提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠、3mmol/L甘氨酸钠、10mmol/L EDTA，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠、5mmol/L的山梨糖醇、10mmol/L的尿素、10mmol/L的柠檬酸钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠、6mmol/L的聚乙二醇，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
实施例14
本发明实施例14提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞(CHO细胞为CHO DG44细胞，购买自Thermo Fisher公司，货号为A1100001)发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量为150L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力为2.5bar，并回收滤液，过滤后的滤液在5℃的温度下保存，且保存天数为3天。
S2、亲和层析：用4CV的缓冲液Ⅰ以80cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，填料动态载量为20mg/mL，将所述滤液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠、3mmol/L甘氨酸钠、10mmol/L EDTA、5mmol/L的半乳糖，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm；
所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠、5mmol/L的山梨糖醇、10mmol/L的尿素、10mmol/L的柠檬酸钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm；
使用缓冲液Ⅲ以80cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠、6mmol/L的聚乙二醇，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.6。
S3、复合型阴离子交换层析：用3-5CV的缓冲液Ⅳ以80cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，复合层析柱的介质为capto adhere，将所述洗脱液以80cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以80cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为25mS/cm；
缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.9，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为98mS/cm。
对照例1
本发明对照例1采用申请号为US20090252749A1，国外已经上市的药物阿巴西普的原研单位百时美施贵宝(BMS)公司提供的CTLA4-Ig融合蛋白的三步纯化方法，包括亲和蛋白A层析、阴离子交换层析和疏水层析纯化。
对照例2
本发明对照例2提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，该方法在实施例4的基础上，仅对缓冲液I进行了调整，方法步骤和步骤参数全部相同，具体的，缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠、10mmol/L EDTA，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为18mS/cm。
对照例3
本发明对照例3提供了一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，该方法在实施例6的基础上，仅对缓冲液Ⅱ进行了调整，方法步骤和步骤参数全部相同，具体的，所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠、10mmol/L的柠檬酸钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.4，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为50mS/cm。
实验一、CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法纯度分析实验
分别采用本发明实施例2和实施例4-14及对照例1-3提供的纯化方法纯化CTLA4-Ig融合蛋白，纯化过程中，多次进行纯度检测，经过纯化后，检测最终蛋白液中得到的CTLA4-Ig融合蛋白的纯度，通过凝胶色谱技术手段，分析蛋白液中寡聚体、单体含量以及降解产物含量，同时，所获得的蛋白液采用SEC-HPLC方法检测纯度，并记录数据，此外，通过反向色谱方法分析样品中唾液酸含量，检测结果如下：
其中，质量标准要求NANA(mol:mol)＞8.0，且NGNA(mol:mol)＜1.0
通过上述实验结果表明，如图2所示，实施例1与对照例1相比，本发明通过两步层析后蛋白液中残留HCP已经达到质量标准(≤100ppm)，确保最终产品的残留HCP符合质量标准。与对照例1相比，本发明提供的纯化方法能够同时降低宿主蛋白(HCP)、残留proteinA、DNA、多聚体、低唾液酸蛋白等多种污染物的含量，从而达到显著提高CTLA4-Ig融合蛋白的目标，此外还说明了，复合离子交换层析对残留DNA有显著地去除效果，确保最终原液的残留DNA符合质量标准。此外，纯化过程中使用GE公司新一代亲和层析介质Mabselect Sure捕获发酵液中抗体，与传统的亲和层析介质相比，Mabselect Sure具有稳定性好、Protein A脱落少等优点。因此，亲和层析洗脱的过程样品中残留Protein A的含量不仅已经达到质量标准(≤10ppm)，终产品中残留Protein A量远低于对照例1提供的纯化方法。此外，在缓冲液Ⅲ中加入精氨酸，比对照例1中传统工艺方法更能降低蛋白聚体产生，提高蛋白单体含量。
此外，本发明中提供的滤液流速范围经过大量实验筛选得到，在该范围内，其能够缩短纯化时间，而且针对填料的利用度较高。
同时，实施例4和实施例6与对照例2和对照例3相比，本发明选择的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ中任何一种成分的缺失或增加都有可能导致除杂不理想，纯化效果差，蛋白纯度降低，本发明选择的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ能够有效降低蛋白聚体产生，同时用于冲洗非特异性结合的杂质，此外，实施例4和实施例6分别与实施例2相比，实施例4中加入的甘氨酸钠和EDTA能够促进蛋白溶解，防止目标蛋白质被所含的金属蛋白酶分解，有效保护融合蛋白，提高蛋白纯度，实施例6中加入的山梨糖醇起到还原剂的作用，防止蛋白聚集，同时实施例6中加入的尿素和柠檬酸钠可以屏蔽蛋白间的离子相互作用，帮助蛋白溶解，防止蛋白聚集，充分淋洗，提高了蛋白纯度，有效去除杂质。
实施例9与实施例2相比，实施例9的缓冲液Ⅲ中加入聚乙二醇能够有效去除杂质，提高蛋白纯度。
实施例5与实施例4相比，实施例5的缓冲液Ⅰ中加入的半乳糖具有促溶解的作用，可以增加缓冲液粘度，有助于防止蛋白聚集，防止蛋白流失，提高了蛋白的纯度，有效去除杂质，回收效果好。
实施例7、8、10、11、12与实施例4、5、6、9相比，缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ和缓冲液Ⅲ的不同组合使用，对杂质去除效果相对单一的缓冲液相比，纯化效果较好。
最后，通过上述表格可以看出，实施例14的纯化效果最佳，CTLA4-Ig融合蛋白的纯度可以达到99％以上，如图1所示，同时回收率能够达到80％以上，通过与实施例13相比，该实施例中缓冲液任意更换将影响纯化效果。
实验二、CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法纯化蛋白活性、回收率分析实验
分别采用本发明实施例2和实施例4-14及对照例1-3提供的纯化方法纯化CTLA4-Ig融合蛋白，纯化前统计发酵液中抗体融合蛋白数(g)，通过以下公式计算蛋白回收率：
回收率＝纯化后抗体蛋白数(g)/起始纯化前抗体数(g)*100％；
同时检测最终得到的蛋白液中CTLA4-Ig融合蛋白的的生物学活性。CTLA4-Ig融合蛋白是通过抑制共刺激分子CD28和CD80/CD86活化T细胞的第二刺激信号，阻断B7-1和B7-2与T细胞表面上的CD28的功能性相互作用，从而抑制T细胞活化，进而抑制免疫应答。本发明使用ELISA手段，分析CTLA4-Ig融合蛋白与CD28和CD80/CD86的特异性结合能力，以评价结合活性效果。使用GraphPad Prism软件(版本5.00)的非线性回归(Nonlinear Regression(curve fit))中Sigmoidal dose-response(variable slope)进行数据回归分析，具体测试结果如下。检测结果如下：
如上述表格及图3所示，本发明实施例2与对照例1相比，本发明提供的两步层析纯化方法在特定缓冲液的结合下能够使CTLA4-Ig融合蛋白回收率达到70％，远远高于对比文件1中对CTLA4-Ig融合蛋白的回收率，纯化效果显著，且实施例2得到的蛋白活性远远高于对照例1得到的蛋白活性，为此可以说明，本发明将纯化步骤大大简化的前提下提高了纯化效率，且能够在大大缩短纯化时间的同时保证回收率。
需要强调的是，本发明实施例1中选择的缓冲液的pH范围是根据CTLA4-Ig融合蛋白的等电点筛选得到的，在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子正负电荷相等，净电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物，本发明在等电点的基础上，筛选得到上述实施例中限定的pH范围，在该范围内能够保证缓冲液的缓冲能力，防止蛋白聚集，有效保证蛋白回收率和蛋白活性。
实施例4、实施例6分别与对照例2和对照例3相比，本发明选择的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ中任何一种成分的缺失或增加都有可能导致回收率降低，本发明中选择的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ能够有效降低蛋白聚体产生，防止蛋白流失或聚集，提高蛋白回收率，缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ中任意缺失一种成分将直接导致回收率降低；同时与实施例2相比，实施例4的缓冲液Ⅰ中加入的甘氨酸钠和EDTA能够起到对蛋白保护的效果，防止蛋白被破坏，有效促进蛋白溶解，同时EDTA能够与镁离子结合防止目标蛋白质被所含的金属蛋白酶分解，有效保护融合蛋白，提高融合蛋白的回收率。实施例6与实施例2相比，实施例6的缓冲液Ⅱ中加入的山梨糖醇能够防止蛋白聚集，尿素和柠檬酸钠的加入可以屏蔽蛋白间的离子相互作用，帮助蛋白溶解，防止蛋白聚集，保证了蛋白回收率，同时保证了蛋白活性。
实施例9与实施例2相比，实施例9的蛋白回收率高于实施例2，说明了实施例9的缓冲液Ⅲ中加入聚乙二醇能够提高蛋白溶解性，提高蛋白回收率。
实施例5与实施例4相比，实施例5的融合蛋白回收率较高，说明了实施例5的缓冲液Ⅰ中加入的半乳糖具有促溶解的作用，可以增加缓冲液粘度，有助于防止蛋白聚集，保证了融合蛋白的稳定性，提高回收率，同时保证了蛋白活性。
实施例7、8、10、11、12与实施例4、5、6、9相比，缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ和缓冲液Ⅲ的不同组合使用，对杂质去除效果与单一的缓冲液相比，CTLA4-Ig融合蛋白的回收率高。
最后，通过上述表格可以得出，实施例14提供的方法对于CTLA4-Ig融合蛋白的回收率、活性均较高，纯化效果最佳，CTLA4-Ig融合蛋白的纯度可以达到99％以上，同时回收率将达到90％以上，通过与实施例13相比，该实施例中缓冲液任意更换将影响纯化效果。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技有限公司
<120> 一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> PRT
<213> CTLA4-Ig融合蛋白()
<400> 1
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355

Claims (10)

1.一种CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、发酵液预处理：将CHO细胞发酵产生的CTLA4-Ig融合蛋白发酵液进行深层过滤，并回收滤液；
S2、亲和层析：
用3-5CV的缓冲液Ⅰ以65-100cm/h的流速对亲和层析柱进行平衡，将所述滤液以65-100cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅰ第一次进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅱ进行第二次冲洗，最后再次使用所述缓冲液Ⅰ进行第三次冲洗，直至电导率曲线降至基线后，停止冲洗；
使用缓冲液Ⅲ以65-100cm/h的流速对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集洗脱液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集；
S3、复合型阴离子交换层析：
用3-5CV的缓冲液Ⅳ以65-100cm/h的流速对复合层析柱进行平衡，将所述洗脱液以65-100cm/h的流速进行上样，上样结束后，首先使用所述缓冲液Ⅳ进行冲洗，待紫外信号平稳后，然后使用缓冲液Ⅴ以65-100cm/h的流速对所述复合层析柱进行洗脱，当所述紫外信号上升至50mAU时收集蛋白液，当所述紫外信号降至70mAU时结束收集。
2.如权利要求1所述的CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述深层过滤中所述CTLA4-Ig融合蛋白发酵液的过滤量≤200L/m2膜面积，且所述深层过滤中的操作压力≤3.5bar。
3.如权利要求1或2所述的CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，过滤后的所述滤液在2-8℃的温度下保存，且保存天数≤5天。
4.如权利要求1所述的CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S2中，所述亲和层析柱的介质为Mabselect Sure。
5.如权利要求1所述的CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S2中，所述缓冲液Ⅰ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、150mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅰ的pH为7.2-7.7，且所述缓冲液Ⅰ的电导率为15-20mS/cm；
优选的，所述缓冲液Ⅰ还包括3mmol/L甘氨酸钠、10mmol/L EDTA；优选的，所述缓冲液Ⅰ还包括5mmol/L的半乳糖。
6.如权利要求1所述的CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S2中，所述缓冲液Ⅱ包括25mmol/L的磷酸二氢钠、500mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅱ的pH为7.2-7.7，且所述缓冲液Ⅱ的电导率为40-60mS/cm；
优选的，所述缓冲液Ⅱ还包括5mmol/L的山梨糖醇、10mmol/L的尿素、10mmol/L的柠檬酸钠。
7.如权利要求1所述的CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S2中，所述缓冲液Ⅲ包括0.4mol/L的精氨酸、20mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅲ的pH为3.4-3.8；
优选的，所述缓冲液Ⅲ还包括6mmol/L的聚乙二醇。
8.如权利要求1所述的CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述复合层析柱的介质为capto adhere。
9.如权利要求1所述的CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述缓冲液Ⅳ包括50mmol/L的Tris-HCl、200mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅳ的pH为6.7-7.1，且所述缓冲液Ⅳ的电导率为23-28mS/cm。
10.如权利要求1所述的CTLA4-Ig融合蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述缓冲液Ⅴ包括50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的氯化钠，所述缓冲液Ⅴ的pH为6.7-7.1，且所述缓冲液Ⅴ的电导率为95-100mS/cm。
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