CN104250298B - 一种艾塞那肽高效分离纯化方法 - Google Patents
一种艾塞那肽高效分离纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的在于提供一种具有高选择性的艾塞那肽高效纯化分离方法，该方法采用二维的分离纯化方法：采用极性共聚的方法将具有特异性的静电作用引入到没有特异性的单纯依靠疏水作用的反相色谱中，即反相/阴离子交换（RP/SAX）混合模式和反相/阳离子交换（RP/SCX）混合模式，并通过对缓冲盐种类、浓度、pH条件的优化以及流动相梯度条件的优化，使样品具有适当的保留，并且可以达到良好分离。
Description
技术领域
本发明属于化学合成多肽的分离与纯化技术领域，具体涉及一种艾塞那肽纯化分离方法。
背景技术
多肽是由20种氨基酸以不同的组成和排列方式通过肽键（酰胺键）相互连接而成的化合物，除了是组成蛋白质的基本结构单元，同时也是生物体内的重要活性物质，在生物界中分布较为广泛。在生命活动当中，涉及到各种毒素、激素。抗菌肽、信息素、细胞因子等的生物活性多肽广泛参与分子识别信号传导、酶活调节、免疫调节以及细胞分化等过程；生物活性多肽的开发和利用越来越受到科学家的重视，在医药、食品、化妆品等行业中的应用日益广泛，尤其是医药行业当中，已经有大量的生物活性多肽通过了临床试验并投放市场，如降血糖的艾塞那肽、治疗乙型肝炎的胸腺肽、咖啡肽等等；
研究表明，艾塞那肽是一种由39个氨基酸组成的多肽，其结构与人的胰高血糖素（Glucagou）有48%的同源性，与人的GLP-1（胰高血糖素样肽-1）有53%的同源性。艾塞那肽是胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂，是促胰岛素分泌肽（Exendin-4）的化学合成类多肽，是一种新型的治疗糖尿病的药物；艾塞那肽不仅能够起到降低血糖的作用，同时不但不引起患者体重的增加反而可以降低其体重，因此，在今后的一段时间内，艾塞那肽在糖尿病的治疗当中将会占据着举足轻重的地位。
多肽样品组成比较复杂，含量低，不同组分之间丰度差异比较大，由于液相色谱峰容量的限制，基于单维的色谱分离方法和技术已经不能满足多肽分离的需要；近年来，二维甚至多维高效液相色谱已经成为多肽分离纯化的发展主流，经过20多年的研究，学者们已经构建了多种二维或者多维高效液相色谱系统用于多肽的分离纯化及制备；主要有离子交换-反相液相色谱（IEX-RPLC）、体积排阻-反相液相色谱（SEC-RPLC）、以及亲水-反相液相色谱（HILIC-RPLC）等等；这些二维模式多肽的分离分析及纯化制备过程当中显示了极大的分离能力。
在离子交换-反相的二维分离体系当中，离子交换色谱依据样品所带电荷的不同而导致与固定相的作用力不同从而实现分离，而反相色谱依据疏水作用力实现对样品的分离，由于两者的作用机理相互独立，因此具有良好的正交性；这种二维的分离模式也是目前多肽纯化中使用较为广泛的分离技术；体积排阻色谱依据被分离组分的分子大小而实现分离，亲水色谱根据亲水性的不同实现对不同组分的分离，这二者与反相色谱也有一定的正交性，适合于多肽的分离纯化；目前还没有报道将二维正交的反相/阴离子交换混合模式色谱（RP/SAX）和反相/阳离子交换（RP/SCX）混合模式分离纯化方法应用于艾塞那肽的纯化分离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高选择性的艾塞那肽纯化分离方法，该方法采用二维的分离纯化方法：采用极性共聚的方法将具有特异性的静电作用引入到没有特异性的单纯依靠疏水作用的反相色谱中，即反相/阴离子交换（RP/SAX）混合模式和反相/阳离子交换（RP/SCX）混合模式，并通过对缓冲盐种类、浓度、pH条件的优化以及流动相梯度条件的优化，使样品具有适当的保留，并且可以达到良好分离。
本发明提供的艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于，采用二维正交分离纯化体系对艾塞那肽粗品进行分离纯化，采用极性共聚的方法将具有特异性的静电作用引入到没有特异性的单纯依靠疏水作用的反相色谱中，即RP/SAX混合模式和RP/SCX混合模式。
本发明所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：所述RP/SAX混合模式色谱中，RP为直链正烷基结构，SAX为一种季铵基基团，RP/SAX的结构式为式Ⅰ：
其中，R1为C2～C6的烷基中的一种，R2为C1～C8的烷基中的一种；
所述RP/SCX混合模式色谱中，RP为直链正烷基结构，SCX为一种磺酸基基团，RP/SCX的结构式为式Ⅱ：
其中R3为C1～C6烷基中间的一种，R4为C1～C8烷基或苯基的一种。
本发明所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：在RP/SAX混合模式色谱中，直链正烷基结构与季铵基比例为1:100～100:1在RP/SCX混合模式色谱中，直链正烷基键合基团与磺酸基键合基团的比例为1:100～100:1。
本发明所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：所述二维正交分离纯化体系中，第一维使用反相/阴离子交换分离纯化体系，即RP/SAX；第二维使用反相/阳离子交换分离纯化体系，即RP/SCX。
本发明所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：第一维分离纯化体系流动相为，A相：缓冲盐，B相：水，C相：高氯酸钠，D相：乙腈。
其中：
A相缓冲盐选自a、b或c，其中：
a、磷酸三乙胺缓冲盐（TEAP，下同）浓度50-200mM，pH5.0-8.0；
b、甲酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH5.0-8.0；
c、乙酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH5.0-8.0；
C相高氯酸钠水溶液的浓度为100-1000mM；
D相乙腈含量变化特征在于：0-240min，5%～80%。
本发明所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：第二维分离纯化体系流动相为，A相：缓冲盐，B相：水，C相：高氯酸钠，D相：乙腈。
其中：
A相缓冲盐选自a、b或c，其中：
a、磷酸三乙胺缓冲盐（TEAP），浓度50-200mM，pH2.0-5.0；
b、甲酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH2.0-5.0；
c、乙酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH2.0-5.0；
C相高氯酸钠水溶液的浓度为100-1000mM；
D相乙腈含量变化特征在于：0-240min，5%～80%。
本发明还提供了所述分离纯化方法的色谱操作参数：
进样量：100μL-1000mL；
流速：0.5-300.0mL/min；
柱温：15-60°C；
色谱柱内径：4.6-100mm；
色谱柱柱长：250-1000mm。
本发明所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于具体步骤如下：
1）、称取适量艾塞那肽粗品，用Tris盐-甲醇溶解，配制成浓度为100mg/mL的溶液，用0.22m滤膜过滤，待用；
2）、一维使用阴离子交换-反相分离：色谱柱内径4.6-100mm，色谱柱柱长：250-1000mm，流速0.5-300.0mL/min，柱温15-60°C，进样量1μL～1000mL；流动相中添加50-200mM的缓冲盐和浓度为100-1000mM的高氯酸纳，乙腈为强洗脱溶剂，等度或梯度条件洗脱，按峰形收集馏分，馏分使用低温离心浓缩冻干；
3）、二维使用阳离子交换-反相混合模式色谱柱分离；色谱柱内径4.6-100mm，色谱柱柱长：250-1000mm，流速0.5-300.0mL/min，柱温15-60°C，进样量1μL～1000mL;流动相中添加50-200mM的缓冲盐、浓度为100-1000mM的高氯酸纳，乙腈为强洗脱溶剂，梯度条件洗脱，按峰形收集馏分，馏分使用低温离心浓缩冻干。
本发明具有如下优点：
1.高选择性：针对当前多肽分离纯化遇到的问题，本发明提出使用二维分离纯化方法，艾塞那肽混合组分在色谱柱上得到较好分离，有效解决了单一疏水作用或离子交换作用选择性不足的问题。
2.载样量大，易于实现工业化生产。
3.高重复性：实验操作简单可控，易实现自动化，过程稳定，重复性好。
附图说明
图1第一维分离纯化色谱图；
图2第二维分离纯化色谱图。
具体实施方式
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
艾塞那肽粗品100mg，溶于1mL Tris-甲醇溶液中，进样量100μL。
第一维使用RP/SAX柱（4.6×250mm），RP/SAX结构（式Ⅰ）中，R1为乙基，R2为正辛烷基，直链正烷基结构与季铵基比例为1:100。柱温60°C，流速0.5mL/min。A相为磷酸三乙胺缓冲盐（TEAP，下同）（200mM）、pH=6.0，B相为水，C相为高氯酸钠水溶液（1000mM），D相为乙腈；其中A：10%，C:5%；0-60min，B:80%～5%，D:5%～80%；紫外检测器，检测波长214nm；按峰形收集馏分，得到的馏分低温离心浓缩冻干后用纯水溶解；
第二维使用RP/SCX柱（4.6×250mm），RP/SCX（式Ⅱ）结构中，其中R3为正己烷基，R4为苯基，直链正烷基结构与季铵基比例为1:100；柱温60°C，流速0.5mL/min。A相为TEAP（200mM）、pH=2.0，B相为水，C相为高氯酸钠水溶液（100mM），D相为乙腈；其中A：10%；D：30%；0-40min，B:50%～10%，D:10%～50%；；紫外检测器，检测波长214nm；按峰形收集馏分，得到的馏分低温离心浓缩冻干即得艾塞那肽纯品。经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率87.2%；
实施例2
艾塞那肽粗品100mg，溶于1mL Tris-甲醇溶液中，进样量100μL。
第一维使用RP/SAX柱（4.6×250mm），RP/SAX结构（式Ⅰ）中，R1为正丁基，R2为正辛烷基，直链正烷基结构与季铵基比例为100:1。柱温40°C，流速1.0mL/min。A相为TEAP（200mM）、pH=8.0；B相为水，C相为高氯酸钠水溶液（1000mM），D相为乙腈；其中A：10%，C:5%；0-40min，B:80%～5%，D:30%～55%；紫外检测器，检测波长214nm；按峰形收集馏分，得到的馏分低温离心浓缩冻干后用纯水溶解；
第二维使用RP/SCX柱（4.6×250mm），RP/SCX结构（式Ⅱ）中，其中R3为正辛烷基，R4为正丁烷基，直链正烷基结构与季铵基比例为100:1；柱温40°C，流速1.0mL/min。A相为TEAP（200mM）、pH=5.0，B相为水，C相为高氯酸钠水溶液（1000mM），D相为乙腈；其中A：10%；D：30%；0-40min，B:30%～5%，C:30%～55%；紫外检测器，检测波长214nm；按峰形收集馏分，得到的馏分低温离心浓缩冻干即得艾塞那肽纯品；第一维、第二维分离纯化色谱图见图1、图2。经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率87.2%；
实施例3
艾塞那肽粗品100mg，溶于1mL Tris-甲醇溶液中，进样量100μL。
第一维使用RP/SAX柱（4.6×250mm），RP/SAX结构（式Ⅰ）中，R1为正己烷基，R2为甲基，直链正烷基结构与季铵基比例为1:1。柱温15°C，流速1.0mL/min。A相为TEAP（200mM）、pH=5.0，B相为水，C相为高氯酸钠水溶液（1000mM），D相为乙腈；其中A：20%，C:5%；0-40min，B/D:B:30%～30%，D:10%～45%；紫外检测器，检测波长214nm；按峰形收集馏分，得到的馏分低温离心浓缩冻干后用纯水溶解；
第二维使用RP/SCX柱（4.6×250mm），RP/SCX结构（式Ⅱ）中，其中R3为正辛烷基，R4为苯基，直链正烷基结构与季铵基比例为1:1；柱温15°C，流速0.5mL/min。A相为TEAP（200mM）、pH=3.0，B相为水，C相为高氯酸钠水溶液（200mM），D相为乙腈；其中A：10%；D：30%；0-40min，B/C:50/10→10/50；紫外检测器，检测波长214nm；按峰形收集馏分，得到的馏分低温离心浓缩冻干即得艾塞那肽纯品。经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率85%。
实施例4
艾塞那肽粗品2g，溶于2mL Tris-甲醇溶液中，进样量2mL。
第一维使用RP/SAX柱（20×250mm），RP/SAX结构（式Ⅰ）中，R1为乙基，R2为正辛烷基，直链正烷基结构与季铵基比例为1:100。柱温40°C，流速20mL/min。A相为TEAP（200mM）、pH=6.0，B相为水，C相为高氯酸钠水溶液（1000mM），D相为乙腈；其中A：10%，C:5%；0-60min，B:80%～5%，D:5%～80%；紫外检测器，检测波长214nm；按峰形收集馏分，得到的馏分低温离心浓缩冻干后用纯水溶解；
第二维使用RP/SCX柱（20×250mm），RP/SCX结构（式Ⅱ）中，其中R3为正己烷基，R4为苯基，直链正烷基结构与季铵基比例为1:100；柱温40°C，流速20mL/min。A相为TEAP（200mM）、pH=2.0，B相为水，C相为高氯酸钠水溶液（100mM），D相为乙腈；其中A：10%；D：30%；0-40min，B:50%～10%，D:10%～50%；；紫外检测器，检测波长214nm；按峰形收集馏分，得到的馏分低温离心浓缩冻干即得艾塞那肽纯品。经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率80%；
实施例5
与实施例1不同之处在于：第一维分离纯化中A相为TEAP缓冲盐，浓度50mM；C相高氯酸钠浓度500mM；经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率86%。
实施例6
与实施例1不同之处在于：第二维分离纯化中A相为TEAP缓冲盐、pH5.0，C相高氯酸钠浓度500mM；经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率60%。
实施例7
与实施例1不同之处在于：第一维分离纯化中A相为甲酸三乙胺缓冲盐，浓度200mM，pH6.0。经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.25%，回收率70%。
实施例8
与实施例1不同之处在于：第一维分离纯化中A相为乙酸三乙胺缓冲盐，浓度200mM，pH8.0。经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率78%。
实施例9
与实施例1不同之处在于：第一维分离纯中RP/SAX（式Ⅰ）结构中，R1为正己烷基，R2为甲基，直链正烷基结构与季铵基比例为1:1；经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率90%。
实施例10
与实施例4不同之处在于：第一维分离纯化A相为TEAP缓冲盐、浓度100mM、pH6.0，高氯酸钠水溶液浓度100mM；经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.15%，回收率89%。
实施例11
与实施例4不同之处在于：第二维分离纯化A相为TEAP缓冲盐、浓度100mM、pH5.0，高氯酸钠水溶液浓度500mM；经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率83%。
实施例12
与实施例4不同之处在于：第一维A相为乙酸三乙胺缓冲盐、浓度100mM、pH5.0；经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率76%。
实施例13
与实施例4不同之处在于：第二维A相为甲酸三乙胺缓冲盐、浓度100mM、pH5.0；经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率70%。
实施例14
与实施例2不同之处在于：第二维A相为乙酸三乙胺缓冲盐、浓度100mM、pH2.0；经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率73%。
实施例15
与实施例1不同之处在于：第二维A相为甲酸三乙胺缓冲盐、浓度100mM、pH2.0；经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率78%。
实施例16
艾塞那肽粗品32g，溶于320mL Tris-甲醇溶液中，进样量320mL。
第一维使用RP/SAX柱（50×1000mm），RP/SAX（式Ⅰ）结构中，R1为乙基，R2为正辛烷基，直链正烷基结构与季铵基比例为2:1。柱温40°C，流速130mL/min。A相为TEAP（200mM）、pH=6.0，B相为水，C相为高氯酸钠水溶液（1000mM），D相为乙腈；其中A：10%，C:5%；0-240min，B:80%～5%，D:5%～80%；紫外检测器，检测波长214nm；按峰形收集馏分，得到的馏分低温离心浓缩冻干后用纯水溶解；
第二维使用RP/SCX柱（50×1000mm），RP/SCX结构（式Ⅱ）中，其中R3为正己烷基，R4为苯基，直链正烷基结构与季铵基比例为2:1；柱温40°C，流速20mL/min。A相为TEAP（200mM）、pH=2.0，B相为水，C相为高氯酸钠水溶液（100mM），D相为乙腈；其中A：10%；D：30%；0-120min，B:50%～10%，D:10%～50%；；紫外检测器，检测波长214nm；按峰形收集馏分，得到的馏分低温离心浓缩冻干即得艾塞那肽纯品。经过二维的分离纯化，艾塞那肽的纯度大于99%，单杂小于0.2%，回收率75%；
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于，采用二维正交液相色谱分离纯化体系对艾塞那肽粗品进行分离纯化，采用极性共聚的方法将具有特异性的静电作用引入到没有特异性的单纯依靠疏水作用的反相色谱中，即二维正交体系分别采用反相/阴离子交换RP/SAX混合模式填料和反相/阳离子交换RP/SCX混合模式填料为固定相；
所述RP/SAX混合模式色谱中，RP为直链正烷基结构，SAX为一种季铵基基团，RP/SAX的结构式为式Ⅰ：
其中，R1为C2～C6的烷基中的一种，R2为C1～C8的烷基中的一种；
所述RP/SCX混合模式色谱中，RP为直链正烷基结构，SCX为一种磺酸基基团，RP/SCX的结构式为式Ⅱ：
其中R3为C1～C6烷基中间的一种，R4为C1～C8烷基或苯基的一种。
2.按照权利要求1所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于：在RP/SAX混合模式色谱中，直链正烷基结构与季铵基比例为1:100～100:1在RP/SCX混合模式色谱中，直链正烷基键合基团与磺酸基键合基团的比例为1:100～100:1。
3.按照权利要求1或2所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于：所述二维正交分离纯化体系中，第一维使用反相/阴离子交换分离纯化体系，即RP/SAX；第二维使用反相/阳离子交换分离纯化体系，即RP/SCX。
4.按照权利要求3所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于：第一维分离纯化体系流动相为，A相：缓冲盐，B相：水，C相：高氯酸钠，D相：乙腈。
5.按照权利要求4所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于，在第一维分离纯化体系中：
A相缓冲盐选自a、b或c，其中：
a、磷酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 5.0-8.0；
b、甲酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 5.0-8.0；
c、乙酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 5.0-8.0；
C相高氯酸钠水溶液的浓度为100-1000mM；
D相乙腈含量变化特征在于：0-240min，5％～80％。
6.按照权利要求3所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于：第二维分离纯化体系流动相为，A相：缓冲盐，B相：水，C相：高氯酸钠，D相：乙腈。
7.按照权利要求6所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于：在第二维分离纯化体系中：
A相缓冲盐选自a、b或c，其中：
a、磷酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 2.0-5.0；
b、甲酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 2.0-5.0；
c、乙酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 2.0-5.0；
C相高氯酸钠水溶液的浓度为100-1000mM；
D相乙腈含量变化特征在于：0-240min，5％～80％。
8.按照权利要求1～2、4～7任一所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法其色谱操作参数如下：
进样量：100μL-1000mL；
流速：0.5-300.0mL/min；
柱温：15-60℃；
色谱柱内径：4.6-100mm；
色谱柱柱长：250-1000mm。
9.按照权利要求1～2、4～7任一所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于具体步骤如下：
1)、称取适量艾塞那肽粗品，用Tris盐-甲醇溶解，配制成浓度为100mg/mL的溶液，用0.22m滤膜过滤，待用；
2)、一维使用阴离子交换-反相分离：色谱柱内径4.6-100mm，色谱柱柱长：250-1000mm，流速0.5-300.0mL/min，柱温15-60℃，进样量1μL～1000mL；流动相中添加50-200mM的缓冲盐和浓度为100-1000mM的高氯酸纳，乙腈为强洗脱溶剂，等度或梯度条件洗脱，按峰形收集馏分，馏分使用低温离心浓缩冻干；
3)、二维使用阳离子交换-反相混合模式色谱柱分离；色谱柱内径4.6-100mm，色谱柱柱长：250-1000mm，流速0.5-300.0mL/min，柱温15-60℃，进样量1μL～1000mL；流动相中添加50-200mM的缓冲盐、浓度为100-1000mM的高氯酸纳，乙腈为强洗脱溶剂，梯度条件洗脱，按峰形收集馏分，馏分使用低温离心浓缩冻干。
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| CN201310256359.0A CN104250298B (zh) | 2013-06-25 | 2013-06-25 | 一种艾塞那肽高效分离纯化方法 |
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Denomination of invention: Efficient separation purification method for exenatide Effective date of registration: 20180420 Granted publication date: 20180206 Pledgee: Zhejiang Tailong commercial bank Taizhou branch of Limited by Share Ltd Pledgor: ZHEJIANG ACCHROM TECHNOLOGIES CO., LTD. Registration number: 2018330000086 |