CN104624171A - 一种聚合物接枝型疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法。以亲水性多孔微球为层析基质,通过活化反应活化层析基质,然后在活化层析基质表面进行甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合反应,得到聚合物接枝层析基质,最后偶联疏水性电荷诱导配基,得到聚合物接枝的疏水性电荷诱导层析介质。本发明所开发的层析介质,兼有聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝链和疏水性电荷诱导功能配基,配基密度高,在高流速下对抗体等目标蛋白的动态载量明显提高,同时具有非盐依赖的吸附特性,通过改变溶液pH至弱酸性即可实现解吸和回收。新型介质的制备过程简便,接枝反应过程中无需严格除氧,催化剂和配体用量少。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚合物接枝型疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法,属于高分子化学领域中的自由基聚合技术及生物化工领域中的蛋白质层析分离技术。
背景技术
随着杂交瘤技术、细胞生物学和基因工程等上游技术的进步,抗体及相关医用蛋白得到了迅速发展。抗体具有靶向性强、特异性高和毒副作用小的特点,广泛应用于肿瘤及自身免疫病等重大疾病治疗、体外诊断与检测,成为当前生物技术药物的重点发展方向。目前通过动物哺乳细胞培养,抗体表达量可以达到5g/L以上,但是抗体下游分离纯化过程成本较高,成为了抗体药物快速发展的瓶颈。
抗体产品纯度要求较高,还必须保持生物活性,分离纯化的难度较大。离子交换层析和疏水相互作用层析等技术虽然可以分离抗体,但是特异性和选择性较差,分离步骤多,影响抗体纯度和活性收率。基于蛋白A或蛋白G的亲和层析,是目前抗体分离的关键技术,选择性高、特异性强,但介质价格昂贵,吸附容量有限,且蛋白类亲和配基易被降解而脱落,重复使用次数有限,洗脱条件受限,因此操作成本较高。1998年,Burton和Harding(Burton and Harding,J.Chromatogr.A,1998,814:71)提出了疏水性电荷诱导层析(Hydrophobiccharge-induction chromatorgraphy,HCIC)新方法,有效地结合了疏水、亲硫、氢键和静电等多种相互作用,在pH中性条件下,配基不带电荷,可以通过疏水等相互作用与目标蛋白结合,通过调节溶液pH,使配基带上电荷,通过静电排斥作用与目标蛋白解离,从而实现洗脱。HCIC具有对目标蛋白选择性高、洗脱条件温和、介质再生简单等优点,可以有效调控对目标蛋白的吸附与解吸,显示出良好的应用前景。专利(US Patent 5,652,348)描述了以巯基杂环化合物作为配基的HCIC介质及其制备方法。专利(US Patent 5,719,269;US Patent7,144,743)也报道了HCIC介质的制备工艺。中国专利(CN101279243;CN101279244;CN101284224)报道了在HCIC介质空间臂中引入砜基来提高介质对抗体的选择性及相关制备方法。中国专利(CN104096544;CN104117345)报道了以氨基苯并咪唑为配基以及色氨酸和氨基苯并咪唑为双功能基团的疏水性电荷诱导HCIC介质。这些HCIC介质主要以疏水相互作用与抗体结合,配基密度不高,且配基仅分布于基质孔道的表面,吸附性能有限,层析分离过程的操作流速较低。因此,开发聚合物接枝型HCIC新型介质,提高动态载量、操作流速和过程处理量,对于抗体的规模化分离有着重要的意义。
原子转移自由基聚合技术(ATRP)形成于20世纪90年代(J.Am.Chem.Soc.1995,117:5614;Chem.Rev.2001,101:2921),是一种活性可控自由基聚合方法,利用电子转移再生活化剂的原子转移自由基聚合反应(ARGET-ATRP)是最近开发的一种新技术(Langmuir.2007,23:4528),可提高催化剂活性,降低催化剂及配体使用量,并可在少量氧气的环境下反应。因此,本发明针对HCIC介质的特殊要求,采用ARGET-ATRP新方法,在多孔微球基质的内部孔道形成聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝,并将HCIC偶联到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝上,制备聚合物接枝的HCIC新型介质,提高配基的偶联效率和密度,改善配基在基质内的空间排布,提高抗体的吸附容量和吸附速率,有利于层析介质在高流速下实现抗体的高效吸附,相关内容国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法。
以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质包括层析基质、聚合物接枝链和配基,所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球,聚合物接枝链为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯,配基为2-巯基-1-甲基咪唑。
层析介质的结构组成为:
所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性多孔微球。所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
所述的层析基质表面羟基经活化和聚合反应形成的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝。
所述的配基为经2-溴异丁酰溴活化和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝后偶联的2-巯基-1-甲基咪唑。
所述的层析介质的配基密度为70-1000μmol/g介质。
所述的以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法包括如下步骤:
1)将层析基质用丙酮替换其中所含水分,抽干,在抽干层析基质中加入10~20倍层析基质质量的无水四氢呋喃、0.1-2倍层析基质质量的2-溴异丁酰溴、0.11-2.2倍层析基质质量的无水三乙胺和0.005-0.1倍层析基质质量的4-二甲氨基吡啶,先0℃下冰浴2~3h,然后30℃下活化12-24小时,抽滤,用丙酮和去离子水洗涤得到活化层析基质;
2)将活化层析基质和0.05~1.0倍活化层析基质质量的甲基丙烯酸缩水甘油酯、10~20倍活化层析基质质量的80%异丙醇溶液(v/v)、0.001~0.01倍活化层析基质质量的溴化铜、0.002~0.02倍活化层析基质质量的抗坏血酸、0.002~0.02倍活化层析基质质量的五甲基二乙烯三胺混合,进行表面引发的自由基聚合反应,50℃反应12~24小时,抽滤,用丙酮和去离子水交替洗涤,得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的层析基质;
3)将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的层析基质和0.02-0.4倍层析基质质量的2-巯基-1-甲基咪唑和0.5-1M碳酸钠缓冲液混合,碳酸钠缓冲液的pH为10-12,50℃下150rpm摇床中反应8-24小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质。
本发明研制的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质,既保留了传统疏水性电荷诱导层析的优点,又通过利用电子转移再生活化剂的原子转移自由基聚合反应实现可控合成,优化了配基的偶联效率和空间排布,提高了抗体的吸附容量和吸附速率,有利于层析介质在高流速下实现抗体的高效吸附。主要具有以下优点:(1)接枝反应条件温和,无需严格除氧,催化剂及配体使用量较低,得到的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝链分布较均一;(2)配基偶联效率高,密度可控;(3)抗体吸附容量大,亲和力强,饱和吸附容量可达90mg/g介质,解离常数为0.2mg/ml;(4)吸附速率快,有效扩散系数高达7.0×10-11m2/s,在高流速下具有较高的动态载量;(5)具有非盐依赖的吸附特征,在较宽的电导率范围(0-100mS/cm)内,吸附容量基本保持不变,无需对料液进行稀释或加盐处理,可以直接捕获蛋白;(6)洗脱方便,通过调节溶液pH至5附近,可实现完全洗脱,避免过酸、过碱或高盐等对蛋白结构产生不良影响或活性损失;(7)介质的配基稳定,清洗再生方便,重复利用率高。本发明的关键在于引入了聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝,提高了疏水性电荷诱导层析介质在高流速下对抗体等目标蛋白的动态载量,显示出良好的抗体规模化分离应用前景。
附图说明
图1是实施例1中所得到的聚合物接枝型新介质与未接枝层析介质对人免疫球蛋白G(IgG)的静态吸附等温线(pH 7.0),二者的功能配基相同,基质相同,配基密度分别为445和100μmol/g gel,区别主要在于聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝链。
图2是实施例1所得到的聚合物接枝型新介质与未接枝层析介质及商业化疏水性电荷诱导介质MEP HyperCel对人免疫球蛋白G(IgG)的穿透曲线(pH 7.0,线性流速300cm/h),其中所用聚合物接枝型新介质与未接枝层析介质与图1相同。
具体实施方式
以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质包括层析基质、聚合物接枝链和配基,所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球,聚合物接枝链为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯,配基为2-巯基-1-甲基咪唑。
层析介质的结构组成为:
所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性多孔微球。所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
所述的层析基质表面羟基经活化和聚合反应形成的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝。
所述的配基为经2-溴异丁酰溴活化和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝后偶联的2-巯基-1-甲基咪唑。
所述的层析介质的配基密度为70-1000μmol/g介质。
以下通过实施例对本发明作进一步的描述:
实施例1
取抽干琼脂糖凝胶10g,用丙酮替换所含水分,然后加入100ml无水四氢呋喃、5ml 2-溴异丁酰溴、5.5ml无水三乙胺和0.25g 4-二甲氨基吡啶,0℃下冰浴2h,然后30℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌活化12小时,抽滤,用丙酮和去离子水洗涤得到活化基质;然后将活化基质、2ml甲基丙烯酸缩水甘油酯、100ml80%异丙醇溶液(v/v)、0.03g溴化铜、0.06g抗坏血酸和0.06ml五甲基二乙烯三胺混合,进行表面引发的自由基聚合反应,50℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌反应12小时,抽滤,用丙酮和去离子水交替清洗,去除共聚物,得到聚合物接枝的基质;接着将接枝基质和0.8g 2-巯基-1-甲基咪唑以及1M碳酸钠缓冲液(pH 11)混合,50℃下150rpm摇床中反应24小时;最后将介质抽滤,用去离子水洗涤,得到以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC介质,配基密度为445μmol/g介质。
实施例2
取抽干琼脂糖凝胶10g,用丙酮替换所含水分,加入100ml无水四氢呋喃、1ml 2-溴异丁酰溴、1.1ml无水三乙胺和0.05g 4-二甲氨基吡啶,0℃下冰浴2h,然后30℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌活化12小时,抽滤,用丙酮和去离子水洗涤得到活化基质;然后将活化基质、0.5ml甲基丙烯酸缩水甘油酯、100ml 80%异丙醇溶液(v/v)、0.01g溴化铜、0.02g抗坏血酸和0.02ml五甲基二乙烯三胺混合,进行表面引发的自由基聚合反应,50℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌反应12小时,抽滤,用丙酮和去离子水交替清洗,去除共聚物,得到聚合物接枝的基质;接着将接枝基质和0.2g 2-巯基-1-甲基咪唑以及1M碳酸钠缓冲液(pH11)混合,50℃下150rpm摇床中反应8小时;最后将介质抽滤,用去离子水洗涤,得到以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC介质,配基密度为70μmol/g介质。
实施例3
取抽干琼脂糖凝胶10g,用丙酮替换所含水分,加入200ml无水四氢呋喃、1ml 2-溴异丁酰溴、1.1ml无水三乙胺和0.05g 4-二甲氨基吡啶,0℃下冰浴3h,然后30℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌活化24小时,抽滤,用丙酮和去离子水洗涤得到活化基质;然后将活化基质、2ml甲基丙烯酸缩水甘油酯、100ml 80%异丙醇溶液(v/v)、0.03g溴化铜、0.06g抗坏血酸和0.06ml五甲基二乙烯三胺混合,进行表面引发的自由基聚合反应,50℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌反应12小时,抽滤,用丙酮和去离子水交替清洗,去除共聚物,得到聚合物接枝的基质;接着将接枝基质和0.8g 2-巯基-1-甲基咪唑以及1M碳酸钠缓冲液(pH 10)混合,50℃下150rpm摇床中反应24小时;最后将介质抽滤,用去离子水洗涤,得到以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC介质,配基密度为200μmol/g介质。
实施例4
取抽干琼脂糖凝胶10g,用丙酮替换所含水分,加入100ml无水四氢呋喃、2ml 2-溴异丁酰溴、2.2ml无水三乙胺和0.1g 4-二甲氨基吡啶,0℃下冰浴2h,然后30℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌活化12小时,抽滤,用丙酮和去离子水洗涤得到活化基质;然后将活化基质、2ml甲基丙烯酸缩水甘油酯、200ml 80%异丙醇溶液(v/v)、0.03g溴化铜、0.06g抗坏血酸和0.06ml五甲基二乙烯三胺混合,进行表面引发的自由基聚合反应,50℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌反应24小时,抽滤,用丙酮和去离子水交替清洗,去除共聚物,得到聚合物接枝的基质;接着将接枝基质和0.8g 2-巯基-1-甲基咪唑以及0.5M碳酸钠缓冲液(pH12)混合,50℃下150rpm摇床中反应24小时;最后将介质抽滤,用去离子水洗涤,得到以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC介质,配基密度为290μmol/g介质。
实施例5
取抽干琼脂糖凝胶10g,用丙酮替换所含水分,然后加入100ml无水四氢呋喃、10ml 2-溴异丁酰溴、11ml无水三乙胺和0.5g 4-二甲氨基吡啶,0℃下冰浴2h,然后30℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌活化12小时,抽滤,用丙酮和去离子水洗涤得到活化基质;然后将活化基质、10ml甲基丙烯酸缩水甘油酯、100ml 80%异丙醇溶液(v/v)、0.1g溴化铜、0.2g抗坏血酸和0.2ml五甲基二乙烯三胺混合,进行表面引发的自由基聚合反应,50℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌反应12小时,抽滤,用丙酮和去离子水交替清洗,去除共聚物,得到聚合物接枝的基质;接着将接枝基质和4g 2-巯基-1-甲基咪唑以及1M碳酸钠缓冲液(pH 11)混合,50℃下150rpm摇床中反应24小时;最后将介质抽滤,用去离子水洗涤,得到以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC介质,配基密度为1000μmol/g介质。
实施例6
取抽干琼脂糖凝胶10g,用丙酮替换所含水分,然后加入200ml无水四氢呋喃、20ml 2-溴异丁酰溴、22ml无水三乙胺和1g 4-二甲氨基吡啶,0℃下冰浴2h,然后30℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌活化12小时,抽滤,用丙酮和去离子水洗涤得到活化基质;然后将活化基质、4ml甲基丙烯酸缩水甘油酯、100ml80%异丙醇溶液(v/v)、0.06g溴化铜、0.12g抗坏血酸和0.12ml五甲基二乙烯三胺混合,进行表面引发的自由基聚合反应,50℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌反应12小时,抽滤,用丙酮和去离子水交替清洗,去除共聚物,得到聚合物接枝的基质;接着将接枝基质和1.6g 2-巯基-1-甲基咪唑以及1M碳酸钠缓冲液(pH 11)混合,50℃下150rpm摇床中反应8小时;最后将介质抽滤,用去离子水洗涤,得到以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC介质,配基密度为600μmol/g介质。
实施例7
取抽干纤维素微球10g,用丙酮替换所含水分,然后加入100ml无水四氢呋喃、2ml 2-溴异丁酰溴、2.2ml无水三乙胺和0.1g 4-二甲氨基吡啶,0℃下冰浴2h,然后30℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌活化12小时,抽滤,用丙酮和去离子水洗涤得到活化基质;然后将活化基质、2ml甲基丙烯酸缩水甘油酯、100ml80%异丙醇溶液(v/v)、0.03g溴化铜、0.06g抗坏血酸和0.06ml五甲基二乙烯三胺混合,进行表面引发的自由基聚合反应,50℃下在密封三口烧瓶中磁力搅拌反应12小时,抽滤,用丙酮和去离子水交替清洗,去除共聚物,得到聚合物接枝的基质;接着将接枝基质和0.8g 2-巯基-1-甲基咪唑以及1M碳酸钠缓冲液(pH 11)混合,50℃下150rpm摇床中反应24小时;最后将介质抽滤,用去离子水洗涤,得到以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC介质,配基密度为400μmol/g介质。
实施例8
聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC新介质的静态吸附性能测试,并与未接枝介质进行比较。首先用去离子水充分清洗介质,将介质用pH 7.0的磷酸盐缓冲液平衡约30min,抽滤,分别准确称取0.04g介质于2ml离心管中,加入0.8ml不同人IgG浓度的缓冲溶液;将离心管置于恒温混匀仪中,25℃下1500rpm吸附5h,达到吸附平衡后,离心分离,取出上清液测定人IgG的浓度;根据物料平衡计算介质的吸附容量,绘制吸附等温线,并根据Langmuir方程拟合得到饱和吸附容量和解离常数。本发明实施例1制备的聚合物接枝新介质对人IgG的饱和吸附容量为90.0mg/g gel,解离常数为0.6mg/ml;而未接枝介质的饱和吸附容量为52.5mg/g gel,解离常数为2.6mg/ml。结果表明,以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC介质对抗体的吸附容量高,结合力强。
实施例9
聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC新介质对人IgG的动态结合容量测试,并与未接枝介质和商品化HCIC介质MEP HyperCel比较。用pH 7.0磷酸盐缓冲液稀释静注人免疫球蛋白溶液(含人IgG 50mg/ml),制备浓度为2mg/ml的人IgG上样料液;将介质装填于Tricorn 5/100柱,先用pH 7.0磷酸盐缓冲液充分平衡床层,线性流速为300cm/h,上样,UV检测器(280nm)在线检测柱出口的人IgG浓度;记录10%穿透时上样体积,根据物料平衡计算10%穿透时介质对人IgG的动态载量Q10%。本发明实施例1制备的聚合物接枝新介质对人IgG的Q10%为24.4mg/ml resin,未接枝介质和MEP HyperCel对人IgG的Q10%分别为2.3和10.8mg/ml resin。结果表明,以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的HCIC介质对抗体的动态载量高,显示出良好的抗体规模化分离应用前景。
Claims (7)
1.一种聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质,其特征在于包括层析基质、聚合物接枝链和配基,所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球,聚合物接枝链为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯,配基为2-巯基-1-甲基咪唑。
层析介质的结构组成为:
2.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质,其特征在于所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性多孔微球。
3.根据权利要求1或2所述的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质,其特征在于所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
4.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质,其特征在于所述的层析基质表面羟基经活化和聚合反应形成的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝。
5.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质,其特征在于所述的配基为经2-溴异丁酰溴活化和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝后偶联的2-巯基-1-甲基咪唑。
6.根据权利要求1所述的以2-巯基-1-甲基咪唑为功能配基的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝层析介质,其特征在于所述的层析介质的配基密度为70-1000μmol/g介质。
7.一种如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
1)将层析基质用丙酮替换其中所含水分,抽干,在抽干层析基质中加入10-20倍层析基质质量的无水四氢呋喃、0.1-2倍层析基质质量的2-溴异丁酰溴、0.11-2.2倍层析基质质量的无水三乙胺和0.005-0.1倍层析基质质量的4-二甲氨基吡啶,先0℃下冰浴2~3h,然后30℃下活化12-24小时,抽滤,用丙酮和去离子水洗涤得到活化层析基质;
2)将活化层析基质和0.05~1.0倍活化层析基质质量的甲基丙烯酸缩水甘油酯、10~20倍活化层析基质质量的80%异丙醇溶液(v/v)、0.001~0.01倍活化层析基质质量的溴化铜、0.002~0.02倍活化层析基质质量的抗坏血酸、0.002~0.02倍活化层析基质质量的五甲基二乙烯三胺混合,进行表面引发的自由基聚合反应,50℃反应12~24小时,抽滤,用丙酮和去离子水交替洗涤,得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的层析基质;
3)将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的层析基质和0.02-0.4倍层析基质质量的2-巯基-1-甲基咪唑和0.5-1M碳酸钠缓冲液混合,碳酸钠缓冲液的pH为10-12,50℃下150rpm摇床中反应8-24小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质,其配基密度为70-1000μmol/g介质。
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