CN110102270B

CN110102270B - 一种特异识别f2毒素的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法

Info

Publication number: CN110102270B
Application number: CN201910474549.7A
Authority: CN
Inventors: 谢增鸿; 许金花; 沈浩强; 林旭聪
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2039-06-03
Also published as: CN110102270A

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种特异识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法。基于多巯基功能单体、低聚倍半多聚硅氧烷（POSS）和四(3‑巯基丙酸)季戊四醇酯交联剂等光引发聚合形成的表面富含巯基的有机‑无机杂化硅胶聚合物作为基质，带巯基的适配体通过“巯基‑烯”点击反应与基质上丰富的烯基键合，在POSS纳米粒子上高覆盖密度修饰带巯基的抗霉菌毒素核酸适配体，从而制得的对F2毒素具有亲和作用的整体柱。该整体柱基质具有高度交联结构、多作用位点的特征，能够高效地使对F2毒素具有特异性识别的核酸适体高密度负载固定到POSS基整体柱上，结构稳定，方法简单快速，可用于对F2毒素高效特异识别分离。

Description

一种特异识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种特异识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法。

背景技术

整体柱是一种在柱内进行原位聚合或固定化形成的连续多孔的整体材料，可以根据实际需求对整体材料的表面进行相应功能化衍生。亲和色谱是根据生物分子间亲和吸附和解离的原理建立起来的色谱法，是将相互间具有高度特异亲和性的两种物质之一作为配基，与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制备成专一的亲和吸附剂，然后将其作为固定相填充色谱柱用于目标物的纯化，在整体柱研究领域中表现出了巨大的发展潜力。

核酸适配体是一种对其目标物质有特异的识别能力和高亲和力的、经过SELEX技术筛选得到的短链DNA或RNA序列。核酸适配体链内某些互补碱基的配对，氢键和范德华力等作用使其可以形成许多稳定的空间结构，如发卡式结构、G-四分体、假结和凸环结构等，这些结构的形成使其与各类靶标分子的结合变得比较容易。核酸适配体能在冷冻条件下保存较长时间，即使在一些环境下发生变性，这种变性经过一些手段和方法也可以恢复其活性。核酸适配体具有高亲和力、稳定性好、可体外筛选合成、目标配体范围广等特点受到越来越多的关注。近几年来，以核酸适配体作为亲和配体来分离和分析检测小分子物质和蛋白质等，将核酸适配体修饰到整体柱固定相内用于分析分离的方法也受到研究者们的高度关注。

目前核酸适配体修饰到整体柱的方式主要包括以下几个方面：

(1)非化学键合核酸适配体法较为成熟的是采用生物素和链霉亲和素法键合适配体法，其是利用一些较强的亲和作用实现适配体键合到固定相上。该制备方法制备条件温和、简单快速、同时产量高，但这种键合方法会一定程度上影响蛋白质与适配体的结合能力；当温度较低或者有机相浓度浓度较高时，生物素与链霉亲和素的作用力会下降，甚至发生解离。此外，在某些应用环境中，链霉亲和素会发生不可逆失活。

(2)化学键合核酸适配体法主要包括巯-烯点击、戊二醛法和纳米金法，其中巯-烯点击反应具有适应范围更广，整体柱表面带有巯基或者烯键、环氧官能团都可以衍生，这个特点大大的拓宽了衍生范围，通过制备或者后续衍生使毛细管整体柱表面带上双键或者环氧基团，通过巯-烯点击法，或者通过一锅煮的方式可将一端修饰巯基的核酸适配体高效的键合到毛细管整体柱表面，制备的核酸适配体亲和整体柱可实现对蛋白的分离纯化和检测。该方法具有反应效率高、快速简便等优点。

目前，核酸适配体修饰整体柱方面的研究，主要集中于无机硅胶整体柱和有机聚合整体柱，而关于有机-无机杂化整体柱的研究较少。本发明中，以修饰巯基核酸适配体通过“巯基-烯”点击反应键合到表面带丰富烯基的杂化硅胶多孔整体柱表面并最终实现核酸适配体在杂化硅胶多孔整体柱表面高适配体覆盖密度修饰，实现了该杂化硅胶亲和整体柱可用于对F2毒素的高效特异识别分离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异识别F2毒素的核酸适配体键合硅胶亲和整体柱的配方和制备方法。所制备的POSS基整体柱具有高度交联结构，整体柱表面具有丰富的烯基官能团，能够高效地负载对F2毒素具有特异性识别的核酸适体，进而实现了该杂化硅胶亲和整体柱对F2毒素的高效特异识别分离。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种特异性识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱，所述亲和整体柱由多巯基功能单体、双丙烯酰胺亲水单体和笼型低聚倍半多聚硅氧烷(Polyhedral OligomericSilsesquioxanes,简称POSS)单体三者在引发剂和致孔剂作用下，通过光引发“巯基-烯”点击化学反应而形成表面富含有烯基的杂化硅胶整体柱基质，继而以巯基功能化适配体与整体柱基质上烯基发生“巯基-烯”点击化学反应，形成用于F2毒素特异识别的核酸适配体高覆盖密度修饰的杂化硅胶亲和整体柱。

所述多巯基功能单体为四(3-巯基丙酸)季戊四醇酯；双丙烯酰胺单体为N,N-亚甲基双丙烯酰胺；低聚倍半多聚硅氧烷交联剂(POSS)为甲基丙烯酸酯接枝的笼型多面体低聚倍半硅氧烷；

所述致孔剂为N,N-二甲基甲酰胺和分子量10000的聚乙二醇两者组成的二元制孔剂；所述引发剂为偶氮二异丁腈。

各组分用量的按体系总质量百分比总和为100％计为，多巯基功能单体4.0％、双丙烯酰胺单体11.0％、笼型低聚倍半多聚硅氧烷POSS单体1.0％、N,N-二甲基甲酰胺67.1％、聚乙二醇16.7％、引发剂偶氮二异丁腈0.2％。

所述抗F2毒素核酸适配体的碱基序列为5’-SH-C6-TCA TCT ATC TAT GGT ACATTA CTA TCT GTA ATG TGA TAT G-3’；

所述特异性识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，包括以下步骤：

(1)抗F2毒素核酸适配体的活化：

将5’修饰巯基的抗F2毒素核酸适配体先以6000r/min的转速下离心15min，然后加入128μL Tris-HCl缓冲液稀释到100μmol/L，涡旋震荡3min，然后于90℃加热3min，冷却至室温后备用。

(2)POSS基杂化硅胶整体柱的制备：

按比例称取双丙烯酰胺单体、低聚倍半多聚硅氧烷聚合多巯基单体，加入适量的致孔剂和引发剂，室温下涡旋振荡3min，超声脱气20min其形成均一溶液；将混合物注入经巯丙基三甲氧基硅烷预处理好的石英毛细管中，两端密封后置于紫外交联仪内紫外光照辐射10min聚合；将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱仪用高压溶剂泵，以甲醇为流动相冲洗整体柱，除去为反应的残留物，得到表面富含烯基的POSS-巯基交联的杂化硅胶整体柱；

(3)抗F2毒素适配体修饰的杂化硅胶亲和整体柱的制备：

往制备好的杂化硅胶整体柱中充满Tris-HCl缓冲液(pH 7.40)，将步骤(1)中得到的核酸适配体储备溶液通入整体柱中，制得抗F2毒素适配体修饰的杂化硅胶亲和整体柱，于4℃下保存。

所述的用于F2毒素特异识别的核酸适配体键合杂化硅胶亲和整体，所述Tris-HCl缓冲液pH为7.40，由10mmol/L Tris-HCl、120mmol/L NaCl和5mmol/L KCl组成。

本发明的显著优点在于：

本发明所述的特异识别F2毒素的核酸适配体亲和聚合柱，是具有纳米尺寸的笼型聚倍半硅氧烷和四(3-巯基丙酸)季戊四醇酯为交联剂，通过自由基光引发聚合形成具有纳米尺寸材料的均一相POSS基质载体，所制备的聚合柱内核骨架是刚性的硅胶基质，通过在基质表面修饰上POSS基团，每个笼型聚倍半硅氧烷单体分子上具有八个支化独立分布的烯基作用位点，作为桥联位点可立体地固定化巯基核酸适配体，从而形成表面链接亲水性双丙烯酰胺单体获得高亲水性的基础上，可以高表面覆盖密度地键合核酸适配体，在光聚合温和条件下将末端修饰巯基的抗F2毒素核酸适配体利用“点击化学”反应直接一步键合到整体柱上，提供一种具有高亲水、高覆盖密度的核酸适配体亲和作用层，通过紫外分光光谱测试，核酸适配体表面覆盖密度高达到2536pmol/μL以上，有效降低疏水性F2毒素在柱体基质上非特异性吸附，实现对F2毒素的高特异识别。

附图说明

图1为所制备的抗F2毒素核酸适配体修饰的杂化硅胶亲和整体柱的不同标尺下的电镜形貌图；

图2为所制备的不含抗F2毒素核酸适配体和抗F2毒素核酸适配体修饰的杂化硅胶亲和整体柱对F2毒素的特异性分析；

(a)不含抗F2毒素核酸适配体的杂化硅胶亲和整体柱；

(b)抗F2毒素核酸适配体修饰的杂化硅胶亲和整体柱

0.背景物质；1.F2毒素。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

一种特异识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法具体步骤为：

(1)毛细管柱内壁巯基化衍生

将毛细管空柱依次通入0.1mol/L盐酸30min，通入二次水至中性，再通入0.1mol/L氢氧化钠溶液3h，然后通入再次通入二次水至中性后通入甲醇30min，在25℃、0.4MPa条件下氮气吹干；注入甲醇与巯丙基三甲氧基硅烷按体积1:1组成的混合物，在60℃下恒温水浴反应24h，使毛细管壁上键合上带有巯基的硅烷化物质；然后用甲醇冲洗30min，在70℃、0.4MPa条件下氮气吹3h，制得毛细管柱内壁巯基化的毛细管；

(2)POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱的制备

各组分用量的按体系总质量百分比总和为100％计为，多巯基功能单体4.0％、双丙烯酰胺单体11.0％、笼型低聚倍半多聚硅氧烷POSS单体1.0％、N,N-二甲基甲酰胺67.1％、聚乙二醇16.7％、引发剂偶氮二异丁腈0.2％，依次加入到离心管中，然后室温下涡旋振荡3min，超声脱气20min其形成均一溶液；然后将混合物注入经巯丙基三甲氧基硅烷预处理好的石英毛细管中，两端密封后置于紫外交联仪内365nm光照辐射10min；将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱仪用高压溶剂泵，以甲醇为流动相冲洗整体柱，除去为反应的残留物，得到表面富含烯基的杂化硅胶整体柱；

(3)抗F2毒素的核酸适配体修饰亲和整体柱的制备：

将5’修饰巯基的抗玉米赤霉烯酮核酸适配体先以6000r/min的转速下离心15min，然后加入128μL Tris-HCl缓冲液(pH 7.40)稀释到100μmol/L，涡旋震荡3min，然后于90℃加热3min，冷却至室温后形成核酸适配体储备溶液，备用。

向制备好的杂化硅胶整体柱中(5cm)充满Tris-HCl缓冲液(pH 7.40)，将步骤上述中得到的核酸适配体储备溶液通入这个整体柱中，制得抗F2毒素适配体修饰的杂化硅胶亲和整体柱(图1)，于4℃下保存。

应用例1

应用修饰抗F2核酸适配体的亲和整体柱，整体柱柱长5cm，分别进行平衡、上样、清洗和洗脱，其具体步骤如下：(1)平衡：将对照柱及修饰F2毒素核酸适配体亲和柱用结合缓冲液平衡。结合缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.40)，120mM NaCl，5mM KCl，20mM CaCl₂，压力1000psi，流速0.05mL/min，平衡0.5h；(2)上样：在修饰抗F2毒素核酸适配体亲和柱注入20μL 10ng/mLF2毒素溶液，在修饰F2毒素核酸适配体亲和柱收集富集液，压力1000psi，流速0.05mL/min；(3)清洗：用结合缓冲液清洗整体柱，0.05mL/min，压力1000psi；(4)洗脱：用30％ACN：70％TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.40，2.5mM EDTA)将F2毒素从整体柱上洗脱下来，收集洗脱液，压力1000psi，流速0.05mL/min；(5)检测：将待测清洗液和洗脱液注入HPLC-RF-20A检测，检测玉米赤霉烯酮条件：流动相：水：甲醇：乙腈＝30:10:60，Ex＝274nm，Em＝440nm，1mL/min，20μL进样，结果见图2。

由图2可见，所制备的亲和整体柱中F2毒素被有效洗脱下来，本发明抗F2毒素适配体修饰的杂化硅胶亲和整体柱可用于F2毒素特异识别。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种特异识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

shctcatcta tctatggtac attactatct gtaatgtgat atg 43

Claims

1.一种特异性识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱，其特征在于：所述亲和整体柱由多巯基功能单体、双丙烯酰胺亲水单体和笼型低聚倍半多聚硅氧烷POSS单体三者在引发剂和致孔剂作用下，通过光引发 “巯基-烯”点击化学反应而形成表面富含有烯基的杂化硅胶整体柱基质，继而以巯基功能化适配体与整体柱基质上烯基发生“巯基-烯”点击化学反应，形成用于F2毒素特异识别的核酸适配体高覆盖密度修饰的杂化硅胶亲和整体柱。

2.根据权利要求1所述的一种特异性识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱，其特征在于：所述多巯基功能单体为四（3-巯基丙酸）季戊四醇酯，双丙烯酰胺单体为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，低聚倍半多聚硅氧烷交联剂POSS为甲基丙烯酸酯接支的笼型多面体低聚倍半硅氧烷。

3.根据权利要求1所述的一种特异性识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱，其特征在于：所述致孔剂为N,N-二甲基甲酰胺和分子量10000的聚乙二醇两者组成的二元制孔剂；所述引发剂为偶氮二异丁腈。

4.根据权利要求1~3任一项所述的一种特异性识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱，其特征在于：各组分用量的按体系总质量百分比总和为100%计为，多巯基功能单体4.0%、双丙烯酰胺单体11.0%、笼型低聚倍半多聚硅氧烷POSS单体1.0%、N,N-二甲基甲酰胺67.1%、聚乙二醇16.7%、引发剂偶氮二异丁腈0.2%。

5.根据权利要求1所述的一种特异性识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱，其特征在于：所述抗F2毒素核酸适配体的碱基序列为5’-SH-C6- TCA TCT ATC TAT GGT ACA TTACTA TCT GTA ATG TGA TAT G-3’。

6.如权利要求1-3任意一项所述的特异性识别F2毒素的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）抗F2毒素核酸适配体的活化：

将5’修饰巯基的抗F2毒素核酸适配体先以6000 r/min的转速下离心15 min，然后加入128μL Tris-HCl缓冲液稀释到100 μmol/L，涡旋震荡3 min，然后于90 ℃加热3 min，冷却至室温后备用；

（2）POSS基杂化硅胶整体柱的制备：

按比例称取双丙烯酰胺单体、多巯基功能单体、笼型低聚倍半多聚硅氧烷POSS单体，加入致孔剂和引发剂，室温下涡旋振荡3 min，超声脱气20 min其形成均一溶液；将混合物注入经巯丙基三甲氧基硅烷预处理好的石英毛细管中，两端密封后置于紫外交联仪内紫外光照辐射10 min聚合；将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱仪用高压溶剂泵，以甲醇为流动相冲洗整体柱，除去为反应的残留物，得到表面富含烯基的POSS-巯基交联的杂化硅胶整体柱；

（3）抗F2毒素适配体修饰的杂化硅胶亲和整体柱的制备：

往制备好的杂化硅胶整体柱中充满Tris-HCl缓冲液，将步骤（1）中得到的核酸适配体储备溶液通入整体柱中，制得抗F2毒素适配体修饰的杂化硅胶亲和整体柱，于4 ℃下保存。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液pH 为7.40，由10mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl和5 mmol/L KCl组成。