CN110124354B - 一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法 - Google Patents

一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110124354B
CN110124354B CN201910516812.4A CN201910516812A CN110124354B CN 110124354 B CN110124354 B CN 110124354B CN 201910516812 A CN201910516812 A CN 201910516812A CN 110124354 B CN110124354 B CN 110124354B
Authority
CN
China
Prior art keywords
silica gel
solution
polymerization
aptamer
bed layer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910516812.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110124354A (zh
Inventor
池金鑫
黄桂华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiamen Huaxia University
Original Assignee
Xiamen Huaxia University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen Huaxia University filed Critical Xiamen Huaxia University
Priority to CN201910516812.4A priority Critical patent/CN110124354B/zh
Publication of CN110124354A publication Critical patent/CN110124354A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110124354B publication Critical patent/CN110124354B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/285—Porous sorbents based on polymers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

本发明公开了一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法。本发明采用“sol‑gel”法的制备工艺,制备表面带巯基硅胶杂化整体柱，硅烷化试剂聚合液以溶胶‑凝胶方法制备表面带有巯基基团的高比表面‑(Si‑O‑Si)n‑刚性结构，在此基础上以纳米金为中间连接媒介，金纳米粒子通过巯基修饰到制备好的硅胶柱表面形成纳米材料功能化桥联作用界面，最后将适配体通过巯基修饰到金纳米粒子表面，实现核酸适配体在有机‑无机硅胶杂化整体聚合床层表面的高密度修饰，应用于赭曲霉毒素A的特异识别。

Description

一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及 其制备方法
技术领域
本发明属于整体聚合材料制备领域，具体涉及一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法。
背景技术
亲和色谱是基于样品分子和固定相之间一种特异性相互作用而分离生物分子的现代分离技术。亲和色谱将具有特异性识别功能的基团固载于色谱固定相上，利用所分析物与固定相的特异性和专一性作用实现分析物与样品中其他物质的分离，具有选择性富集目标物的能力而被广泛应用于样品的富集和纯化以及定量定性分析中。
核酸适配体是一种对其目标物质有特异的识别能力和高亲和力的、经过SELEX技术筛选得到的短链DNA或RNA序列。核酸适配体链内某些互补碱基的配对，氢键和范德华力等作用使其可以形成许多稳定的空间结构，如发卡式结构、G-四分体、假结和凸环结构等，这些结构的形成使其与各类靶标分子的结合变得比较容易。核酸适配体具有高亲和力、稳定性好、可体外筛选合成、目标配体范围广等特点受到越来越多的关注。近几年来，以核酸适配体作为亲和配体来分离和分析检测小分子物质和蛋白质等，将核酸适配体修饰到毛细管整体柱固定相内用于分析分离的方法也受到研究者们的高度关注。
目前制备核酸适配体键合毛细管整体柱的方式主要包括以下几个方面：
1.非化学键合核酸适配体法，采用生物素和链霉亲和素法键合适配体法，其是利用一些较强的亲和作用实现适配体键合到固定相上。该制备方法制备条件温和、简单快速、同时产量高，利于保持适配体的活性等。利用该方法生物素修饰后的核酸适配体固定在链霉亲和素微球上，再将修饰后微球填充到石英毛细管中，制备了核酸适配体亲和柱，或者利用生物素与链霉亲和素之间的桥连作用，将适配体修饰到有机聚合物整体柱上，制备了核酸适配体亲和整体柱，可实现对细胞色素C和凝血酶的分离与检测。
2.化学键合核酸适配体法，主要包括巯-烯点击及戊二醛法，其中巯-烯点击法相比硅胶整体柱表面衍生受限于硅羟基间的缩合反应，巯-烯点击反应具有适应范围更广，整体柱表面带有巯基或者烯键、环氧官能团都可以衍生，这个特点大大的拓宽了衍生范围，通过制备或者后续衍生使毛细管整体柱表面带上双键或者环氧基团，通过巯-烯点击法，或者通过一锅煮的方式可将一端修饰巯基的核酸适配体高效的键合到毛细管整体柱表面，制备的核酸适配体亲和整体柱可实现对蛋白的分离纯化和检测。该方法具有反应效率高、快速简便等优点，但该方法制备出的核酸适配体键合密度不高。
金纳米粒子具有较好生物相容性、易修饰性和易制备性，已经被应用到多个不同的领域。金纳米粒子通过巯基或者氨基修饰到整体柱表面，随后巯基适配体通过巯基或者氨基修饰到金纳米粒子表面，可最终实现整体柱表面的高密度的功能化修饰。目前，以纳米金为连接媒介将末端修饰有巯基的核酸适配体固定到表面带有巯基基团的基质整体柱上，制备的核酸适配体修饰的整体柱可对凝血酶进行富集、分离与检测。但是，上述方法制备的杂化硅胶基亲和整体柱中核酸适配体的覆盖密度都在277-342pmol/μL的水平。巯基化杂化整体聚合材料可以通过一步法或者一锅法制备而成，在适当盐溶液环境下，DNA链可以呈现高度分散状态，与DNA水溶液直接反应比较，有助于高密度键合在毛细管整体聚合材料表面，有利于进一步提高其对目标物快速、高效及灵敏的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法。本发明采用“sol-gel”法的制备工艺,制备表面带巯基硅胶杂化整体柱，硅烷化试剂聚合液以溶胶-凝胶方法制备表面带有巯基基团的高比表面-(Si-O-Si)n-刚性结构，在此基础上以纳米金为中间连接媒介，金纳米粒子通过巯基修饰到制备好的硅胶柱表面形成纳米材料功能化桥联作用界面，最后将适配体通过巯基修饰到金纳米粒子表面，实现核酸适配体在有机-无机硅胶杂化整体聚合床层表面的高密度修饰，应用于赭曲霉毒素A的特异识别。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层，所述整体聚合亲和床层基于硅烷化试剂聚合液以溶胶-凝胶方法制备表面带有巯基基团的高比表面-(Si-O-Si)n-刚性结构,以此为聚合物骨架，在柱表面修饰纳米金粒子形成纳米材料功能化桥联作用界面，然后在结合缓冲盐溶液辅助下将抗赭曲霉毒素A的适配体DNA序列片段密集修饰于金纳米粒子表面，实现适配体在整体聚合床层表面的高密度修饰，形成特异识别赭曲霉毒素A的硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层。
上述硅烷化试剂为四甲氧基硅烷和带巯基的巯丙基三甲氧基硅烷；
上述硅烷化试剂聚合液包含以下组分：硅烷化试剂、乙酸溶液催化剂和尿素-聚乙二醇组成的二元致孔剂；按质量百分数之和为100％计，所述硅烷化试剂聚合液各组分所占质量百分数为：四甲氧基硅烷18.84～21.51％，巯丙基三甲氧基硅烷7.31～9.74％，乙酸溶液55.07～59.10％，尿素7.70～8.69％，聚乙二醇5.57～6.86％；
上述聚乙二醇的分子量为10000；
上述乙酸溶液为0.01mol/L乙酸的水溶液。
上述纳米金粒子表面带负电荷，粒径为20-25nm；
上述抗赭曲霉毒素A的适配体DNA序列的碱基序列为5'-SH-C6-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'；
上述结合缓冲盐溶液pH＝8.0，由10mmol/LTris-HCl、120mmol/LNaCl和5mmol/LKCl组成。
一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层的制备方法，包括以下步骤：
(1)石英毛细管预处理：
将石英毛细管空柱依次采用1.0mol/L的HCl溶液冲洗30min、二次水通至中性，1.0mol/L的NaOH溶液冲洗30min，然后在100℃环境中加热3h，接着再依次用二次水通至中性、0.1M盐酸冲洗30min、二次水通至中性，最后用甲醇冲洗30min，在180℃、0.4MPa条件下氮气吹3h，制得预处理毛细管柱；
(2)含巯基的高比表面硅胶杂化整体聚合床层的制备：
按比例称取二元致孔剂尿素和聚乙二醇，量取催化剂乙酸溶液于圆底烧瓶中，磁力搅拌至完全溶解；然后按比例称取四甲氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷于离心管中混匀，将该混合试剂以2滴/秒的添加速度逐滴加入圆底烧瓶，在0℃冰浴45min，超声脱气使其形成均一溶液；然后将均一溶液注入步骤(1)预处理的石英毛细管中，两端密封后置于47℃水浴锅中恒温反应24h，120℃加热3h；反应采用高压溶剂泵除去未反应的残留物，得到表面富含巯基的高比表面硅胶杂化整体聚合床层的制备；
(3)纳米金修饰的巯基硅胶杂化整体聚合亲和床层的制备：
在200mL双颈瓶中加入98ml双蒸水和2ml 50mM HAuCl4，或称取0.03938g HAuCl4溶于100ml双蒸水中，加入磁力搅拌转子并加热，反应液充分沸腾时，快速加入3ml 38.8mM柠檬酸钠溶液；继续加热回流15～20min；停止加热，持续搅拌，使反应系统自然冷却至室温，将制备好的纳米金胶体溶液用孔径0.45um的滤膜过滤，制得纳米金粒子。
向步骤(2)制备好的含巯基的高比表面硅胶杂化整体聚合床层中(10cm)充满5mMTCEP(三(2-羧乙基)膦)室温放置减少二硫键的形成，随后用二次水冲洗干净，将制得的纳米金粒子通入到含巯基的高比表面硅胶杂化整体聚合床层中直到聚合层变为深红棕色且末端流出的液体呈粉红色，制得纳米金修饰的巯基硅胶杂化整体聚合亲和床层。
(4)硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层的制备：
将抗赭曲霉毒素A的核酸适配体用10000r/min离心5min，然后加入92μL结合缓冲盐溶液进行稀释，再放置于90℃加热3min，冷却至室温后加入46μL5mmol/L三羧甲基磷酸，置于摇床中室温孵育1h以降解二硫键，形成浓度为100μmol/L的核酸适配体溶液；将核酸适配体溶液注入步骤(3)制得的纳米金修饰的巯基硅胶杂化整体聚合亲和床层中，用二次水清洗1h，制得硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层。
硅羟基是毛细管内壁进行预聚合的基础，管壁裸露的硅羟基数目越多越有利于预聚合。但是普通熔融石英毛细管的硅羟基数量很少，不利于预聚合。因此需要对毛细管进行预处理。
本发明的显著优点在于：
本发明以四甲氧基硅烷(TMOS)和巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)为反应前驱体，以乙酸为反应催化剂，通过溶胶-凝胶(sol-gel)反应，将形成的透明预聚液注入经预处理的毛细管中，形成的具有稳定硅胶骨架结构、表面富含巯基的杂化硅胶整体柱，硅胶骨架比表面积大，可达461m2/g。纳米金具有高的表面积及好的生物相容性，以金纳米粒子为中间连接媒介，能增加适配体在整体柱上的结合位点，在结合缓冲盐溶液(10mmol/LTris-HCl、120mmol/LNaCl、5mmol/L KCl，pH＝8.0)中，适配体DNA链呈现直立或舒展状态，避免了折叠吸附在纳米金表面而导致适配体有效容量降低的问题，实现了抗赭曲霉毒素A核酸适配体在硅胶柱表面高密度键合，通过能谱测试纳米金在柱上的含量可达64.42％，核酸适配体表面覆盖密度高达到3531pmol/μL，远大于文献中报道的113～1413pmol/μL。
附图说明
图1为采用纳米金修饰前后的毛细管整体柱的电镜形貌图。
A1：未负载纳米金的硅胶杂化基质柱全貌图，A2：未负载纳米金的硅胶杂化基质柱局部放大图；B1：负载纳米金的硅胶杂化基质柱全貌图，B2：负载纳米金的硅胶杂化基质柱局部放大图。
图2硅胶骨架比表面积检测图。
图3纳米金修饰的巯基硅胶杂化整体聚合亲和床层中纳米金含量检测图。A：为未修饰纳米金及核酸适配体的空白聚合床层；B：修饰金纳米粒子但不修饰抗赭曲霉毒素A的核酸适配体的整体聚合床层。
图4为不同整体聚合床层对赭曲霉毒素A的识别情况对比图。
A为未修饰纳米金及核酸适配体空白柱，
B为修饰金纳米粒子但不修饰抗赭曲霉毒素A的核酸适配体的对照柱，
C为修饰抗赭曲霉毒素A核酸适配体的亲和整体柱，
峰1：赭曲霉毒素A。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层的制备方法，具体步骤为：
(1)石英毛细管预处理：
将石英毛细管空柱依次采用1.0mol/L的HCl溶液冲洗30min、二次水通至中性，1.0mol/L的NaOH溶液冲洗30min，然后在100℃环境中加热3h，接着再依次用二次水通至中性、0.1M盐酸冲洗30min、二次水通至中性，最后用甲醇冲洗30min，在180℃、0.4MPa条件下氮气吹3h，制得预处理石英毛细管柱；
(2)含巯基的高比表面硅胶杂化整体柱的制备：
按表1中配方比例称取二元致孔剂尿素和聚乙二醇，量取催化剂乙酸溶液于圆底烧瓶中，磁力搅拌至完全溶解，按表1中单体比例称取单体四甲氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷于离心管中，以2滴/秒的速度加入圆底烧瓶，在0℃“sol-gel”反应45min，超声脱气10min使其形成均一溶液；然后将均一溶液注入步骤(1)预处理的石英毛细管中，两端密封后置于47℃水浴锅中恒温反应24h；将制备好的整体柱取出，120℃加热3h，连接至液相色谱仪用高压溶剂泵，分别以水、甲醇为流动相冲洗整体柱，以除去整体柱内未参加反应的物质，得到表面富含巯基的高比表面硅胶杂化整体柱；
(3)纳米金修饰的巯基硅胶杂化整体聚合亲和床层的制备：
在200mL双颈瓶中加入98ml双蒸水和2ml 50mM HAuCl4，或称取0.03938g HAuCl4溶于100ml双蒸水中，加入磁力搅拌转子并加热，反应液充分沸腾时，快速加入3ml 38.8mM柠檬酸钠溶液。继续加热回流15～20min；停止加热，持续搅拌，使反应系统自然冷却至室温，将制备好的纳米金胶体溶液用孔径0.45um的滤膜过滤，制得纳米金粒子。
向步骤(2)制备好的硅胶杂化整体柱中(10cm)充满5mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)室温放置减少二硫键的形成，随后用二次水冲洗干净，将制得的纳米金粒子通入硅胶杂化整体柱中直到柱体变为深红棕色且末端流出的液体呈粉红色。制得纳米金修饰的巯基硅胶杂化整体聚合亲和床层。
(4)硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层的制备：
将抗赭曲霉毒素A的核酸适配体用10000r/min离心5min，然后加入92μL pH 8.0的结合缓冲盐溶液进行稀释，再放置于90℃加热3min，冷却至室温后加入46μL 5mmol/L三羧甲基磷酸，置于摇床中室温孵育1h以降解二硫键，形成浓度为100μmol/L的核酸适配体溶液；将得到核酸适配体溶液注入步骤(3)中制得的纳米金修饰的巯基硅胶杂化整体聚合亲和床层中，用二次水清洗1h，制得硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层(图1)。
表1硅胶聚合基质的组分含量表
Colunm PEG<sup>a</sup>(％w/w) Urea(％w/w) HAc<sup>b</sup>(％w/w) TMOS(％w/w) MPTMS(％w/w)
A 6.22 8.06 57.14 18.84 9.74
B 6.22 8.06 57.17 20.51 8.04
C 6.22 8.06 57.19 21.22 7.31
D 5.57 8.12 57.57 20.65 8.09
E 6.86 8.01 56.78 20.37 7.98
F 5.57 8.12 57.57 20.65 8.09
G 6.18 8.69 56.78 20.37 7.98
H 6.53 8.46 55.07 21.51 8.43
I 5.94 7.70 59.10 19.59 7.67
a：PEG为Mw＝10000的聚乙二醇；
b：HAC为浓度为0.01M的乙酸水溶液；
实施例2
选用配方B分别制备未修饰纳米金及核酸适配体的空白聚合床层和修饰金纳米粒子但不修饰抗赭曲霉毒素A的核酸适配体的纳米金整体聚合床层。通过氮气脱附-吸附实验测得所制得的硅胶骨架比表面积大，可达461m2/g(如图2所示)；通过能谱测试空白聚合床层上金的含量为0％，而所制得纳米金在柱上的金含量可达64.42％(如图3所示，其中A为未修饰纳米金及核酸适配体的空白聚合床层，B为修饰金纳米粒子但不修饰抗赭曲霉毒素A的核酸适配体的整体聚合床层)。
实施例3
选用配方B分别制备修饰抗赭曲霉毒素A(OTA)核酸适配体的亲和整体聚合床层，计算核酸适配体在整体聚合床层上的覆盖密度，其具体步骤如下：
核酸适配体在整体柱上的覆盖密度可根据核酸适配体在键合整体柱前后浓度差来测量，实验采用适配体的衍生体积和浓度分别为20μL 100μM(总浓度为n1)来制备核酸适配体柱，接收衍生尾液及清洗液共2mL，测定其在285nm处紫外-可见光吸收光谱值，计算接收尾液核酸适配体浓度(n2)，结果如表2所示，核酸适配体亲和整体聚合床层适配体覆盖密为3531pmol/μL.
表2核酸适配体在整体柱上的覆盖密度
nl<sup>a</sup>(nmol) n2<sup>b</sup>(nmol) ρ<sup>C</sup>(pmol/μL)
2.000 0.440 3531
a:核酸适配体总浓度；
b:未结合的核酸适配体浓度；
c:核酸适配体在聚合床层上的覆盖密度；
实施例4
选用配方B分别制备未修饰纳米金及核酸适配体的空白聚合床层、修饰金纳米粒子但不修饰抗赭曲霉毒素A的核酸适配体作为对照聚合床层和修饰抗赭曲霉毒素A(OTA)核酸适配体的亲和整体聚合床层，分别进行平衡、富集、清洗和洗脱，其具体步骤如下：
(1)平衡：将空白聚合床层、对照聚合床层及修饰OTA核酸适配体亲和聚合床层用结合缓冲液平衡。结合缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，120mM NaCl，5mM KCl，20mM CaCl2250psi反压阀，流速0.05mL/min，平衡0.5h；
(2)富集：分别注入20μL 10ng/mL赭曲霉毒素A(OTA)溶液，分别在空白聚合床层、对照聚合床层和修饰OTA核酸适配体亲和聚合床层富集0.5h。250psi反压阀，流速0.05mL/min。
(3)清洗：用结合缓冲液清洗整体聚合床层，一定体积清洗后，额外再接5μL清洗液，待测。0.05mL/min，压力250psi，收集最后的清洗液待查；
(4)洗脱：用30％ACN：70％TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0，2.5mM EDTA)将OTA从整体聚合床层上洗脱下来，收集洗脱液20μL待测，色谱条件为250psi反压阀，流速0.1mL/min，收集20μL的洗脱液待查。
(5)检测：将待测清洗液和洗脱液注入HPLC-RF-20A检测，检测OTA条件：流动相：2％乙酸水：乙腈＝38:62，Ex＝333nm，Em＝460nm，1mL/min，20μL进样结果见图2。
由图2可见，纳米金空白聚合床层和非OTA适配体对照聚合床层对赭曲霉毒素A未见有效保留，而亲和整体聚合床层中的OTA被有效洗脱下来，证明本发明有机-无机杂化硅胶整体亲和聚合床层可实现对赭曲霉毒素A的特异识别分离。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门华厦学院
<120> 一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

Claims (3)

1.一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层，其特征在于：所述整体聚合亲和床层基于硅烷化试剂聚合液以溶胶-凝胶方法制备表面带有巯基基团的高比表面-(Si-O-Si）n-刚性结构, 以此为聚合物骨架，在柱表面修饰纳米金粒子形成纳米材料功能化桥联作用界面，然后在结合缓冲盐溶液辅助下将抗赭曲霉毒素A的适配体DNA 序列片段密集修饰于金纳米粒子表面，实现适配体在整体聚合床层表面的高密度修饰，形成特异识别赭曲霉毒素A的硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层；
所述硅烷化试剂为四甲氧基硅烷和巯丙基三甲氧基硅烷；所述的硅烷化试剂聚合液包含以下组分：硅烷化试剂、乙酸溶液催化剂和尿素-聚乙二醇组成的二元致孔剂；按质量百分数之和为100 %计，所述硅烷化试剂聚合液各组分所占质量百分数为：四甲氧基硅烷18.84~21.51 %，巯丙基三甲氧基硅烷7.31~9.74 %，乙酸溶液55.07~59.10 %，尿素7.70~8.69 % ，聚乙二醇 5.57~6.86 %；所述聚乙二醇的分子量为10000；所述乙酸溶液为0.01mol/L乙酸的水溶液；
所述纳米金粒子表面带负电荷，粒径为20-25 nm；
所述抗赭曲霉毒素A适配体DNA 序列的碱基序列为5'-SH-C6-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAA AGGGAGCATCGGACA-3'。
2.根据权利要求1所述的一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层，其特征在于：所述结合缓冲盐溶液pH =8.0，由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl和5mmol/L KCl组成。
3.一种制备如权利要求1-2任意一项所述的一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）石英毛细管预处理：
将石英毛细管空柱依次采用1.0 mol/L的HCl溶液冲洗30 min、二次水通至中性，1.0mol/L的NaOH溶液冲洗30 min，然后在100℃环境中加热3 h，接着再依次用二次水通至中性、0.1 M盐酸冲洗30 min、二次水通至中性，最后用甲醇冲洗30 min，在180 ℃、0.4 MPa条件下氮气吹3 h，制得预处理毛细管柱；
（2）含巯基的高比表面硅胶杂化整体聚合床层的制备：
按比例称取二元致孔剂尿素和聚乙二醇，量取催化剂乙酸溶液于圆底烧瓶中，磁力搅拌至完全溶解；按比例称取四甲氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷于离心管中混匀，将该混合液以2滴/秒的添加速度逐滴加入圆底烧瓶，在0 ℃冰浴45 min，超声脱气使其形成均一溶液；然后将均一溶液注入步骤（1）预处理的石英毛细管中，两端密封后置于47 ℃水浴锅中恒温反应24 h，120 ℃加热3 h；反应采用高压溶剂泵除去未反应的残留物，得到表面富含巯基的高比表面硅胶杂化整体聚合床层；
（3）纳米金修饰的巯基硅胶杂化整体聚合亲和床层的制备：
在200 mL双颈瓶中加入98 ml双蒸水和2 ml 50 mM HAuCl4，或称取0.03938 g HAuCl4溶于100 ml双蒸水中，加入磁力搅拌转子并加热，反应液充分沸腾时，快速加入3 ml 38.8mM 柠檬酸钠溶液；继续加热回流15～20 min；停止加热，持续搅拌，使反应系统自然冷却至室温，将制备好的纳米金胶体溶液用孔径0.45 um的滤膜过滤，制得纳米金粒子；
向步骤（2）制备好的含巯基的高比表面硅胶杂化整体聚合床层中充满5 mM三（2-羧乙基）膦室温放置减少二硫键的形成，随后用二次水冲洗干净，将制得的纳米金粒子通入含巯基的高比表面硅胶杂化整体聚合床层中直到聚合层变为深红棕色且末端流出的液体呈粉红色，制得纳米金修饰的巯基硅胶杂化整体聚合亲和床层；
（4）硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层的制备：
将抗赭曲霉毒素A的核酸适配体用10000 r/min离心5 min，然后加入92 μL结合缓冲盐溶液进行稀释，再放置于90 ℃加热3 min，冷却至室温后加入46 μL 5 mmol/L三羧甲基磷酸，置于摇床中室温孵育1 h以降解二硫键，形成浓度为100 μmol/L的核酸适配体溶液；将核酸适配体溶液注入步骤（3）制得的纳米金修饰的巯基硅胶杂化整体聚合亲和床层中，用二次水清洗1 h，制得硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层。
CN201910516812.4A 2019-06-14 2019-06-14 一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法 Active CN110124354B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910516812.4A CN110124354B (zh) 2019-06-14 2019-06-14 一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910516812.4A CN110124354B (zh) 2019-06-14 2019-06-14 一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110124354A CN110124354A (zh) 2019-08-16
CN110124354B true CN110124354B (zh) 2021-08-03

Family

ID=67577230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910516812.4A Active CN110124354B (zh) 2019-06-14 2019-06-14 一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110124354B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111299568B (zh) * 2020-02-09 2021-11-30 浙江大学 polyA介导的核酸配体快速修饰纳米金的方法
CN115990355B (zh) * 2022-10-13 2024-07-09 福州大学 一种核酸适配体有序功能化的亲和整体柱及其制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102500346B (zh) * 2011-11-03 2013-06-05 广西师范大学 离子液体硅胶毛细管整体柱固定相的制备方法
CN104338512B (zh) * 2013-08-08 2018-01-12 镇江新元素医药科技有限公司 一种以烷氧基硅烷的混合物所制备的硅气凝胶
CN103949089B (zh) * 2014-04-11 2016-03-02 西安工程大学 毛细管内固相萃取柱的制备方法及其应用
CN108211424A (zh) * 2018-02-08 2018-06-29 福州大学 一种用于赭曲霉毒素特异识别的poss基有机-无机杂化硅胶整体柱及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110124354A (zh) 2019-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1321768C (en) Enzyme immobilization and bioaffinity separations with perfluorocarbon polymer-based supports
CN110115992B (zh) 一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及其制备方法
CN110124354B (zh) 一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法
CN109174009B (zh) 适配体修饰三嗪共价有机框架复合材料、制备方法及应用
CN101765458B (zh) 分离基质
CN110215737B (zh) 一种基于石墨烯-纳米金复合界面超高负载核酸适配体的亲和整体柱及其制备方法
CN108211424A (zh) 一种用于赭曲霉毒素特异识别的poss基有机-无机杂化硅胶整体柱及其制备方法
WO2006125124A2 (en) Substrate functionalization method for high sensitivity applications
CN101246178A (zh) 用于吸附、分离、检测超微量靶蛋白的系统及其用途
Nayak et al. Surface modification of alumina monolithic columns with 3-aminopropyltetraethoxysilane (APTES) for protein attachment
US20050029196A1 (en) Packing materials for separation of biomolecules
CN107413320A (zh) 一种蛋白a亲和层析介质的应用
Pichon Aptamer-based and immunosorbents
CN112316492A (zh) 可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法
Gutiérrez-Climente et al. Sol–gel process: the inorganic approach in protein imprinting
Rao et al. Construction of boric acid‐functionalized metal–organic frameworks for glycopeptide recognition in the serum of cervical cancer patients
CN110314673B (zh) 一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱及其制备方法
CN110102270B (zh) 一种特异识别f2毒素的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法
CN110605104A (zh) 特异性识别赭曲霉毒素a的核酸适配体-印迹整体柱及其制备方法
CN112755592B (zh) 一种共价有机骨架纳米微球功能化固相微萃取整体柱
Chen et al. Novel approaches for biomolecule immobilization in microscale systems
CN105734013B (zh) 目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架及其应用
CN104624167A (zh) 固载核酸适体的整体材料的制备和在蛋白在线检测的应用
CN109946409B (zh) 一种雌激素干扰物固相萃取亲和柱及其制备方法和应用
CN108927113A (zh) 一种纳米羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant