CN101246178A

CN101246178A - 用于吸附、分离、检测超微量靶蛋白的系统及其用途

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Publication number: CN101246178A
Application number: CNA2008100894865A
Authority: CN
Inventors: 于中连; 马庆伟; 赵洪斌; 吕芳; 吕萍萍
Original assignee: BIOYONG TECHNOLOGY Inc
Current assignee: Chongqing Tongyi Biotechnology Research Institute Co., Ltd.
Priority date: 2008-04-03
Filing date: 2008-04-03
Publication date: 2008-08-20
Anticipated expiration: 2028-04-03
Also published as: CN101246178B

Abstract

该发明提供一种用于吸附、分离、纯化、检测微量靶蛋白的系统，包括分离填料、用于固定分离填料并使其与溶液结合以及吸取溶液的中空管。本发明将蛋白微珠芯片中的微珠粒子，应用于层析洗脱分离领域，即将其作为层析分离柱中的载体，并将常规的层析分离柱环境创造性改变成类似于移液器枪头环境，从而获得能在同一环境中进行上样、吸附、洗涤、洗脱、浓缩、鉴定同时还具有蛋白微珠芯片高特异性的应用效果。

Description

用于吸附、分离、检测超微量靶蛋白的系统及其用途

技术领域

本发明涉及到蛋白组学和分子生物学中生物液体样品中超微量靶蛋白的分离，具体是提供用于分离、检测生物液体中超微量靶蛋白的系统及其使用方法。

技术背景

随着生命科学的研究迅速进展，生物样品中靶蛋白的分离方法日益受到科研工作者的关注。科学家们发现，随着蛋白的检测很多很灵敏准确的方法，如荧光定量PCR仪、质谱仪等的出现，目前限制蛋白质研究的问题是如何有效处理前期样品。

目前也有很多处理生物样品中靶蛋白的方法。其中最常见的是层析洗脱分离法(色谱法)，例如离子交换层析、选择吸附层析(如疏水作用层析、亲水作用层析、糖基化作用层析、dextran作用层析、脂肪酸作用层析)、亲和作用层析(如生物素亲和作用层析、免疫作用层析、凝集素作用层析、金属鳌合/配位作用层析、配体或受体作用层析、共价作用层析)等。然而这些方法也有着很多缺陷限制其使用，如整个流程耗时很长、操作复杂(例如经过上样、吸附结合、洗涤、洗脱、浓缩纯化)、需要具有经验的操作人员和复杂的仪器设备、操作前对样品要求很高(样品纯度、不能有颗粒物等)。尤其是面对临床诊断，要求操作简单且并不需要完全分离生物样品(例如分离血样中的磷酸化蛋白、糖蛋白等)。

此外，近年来出现了用于分离微量蛋白的微珠芯片。蛋白质微珠芯片是指以生物分子微珠作为配基，将其固定在固相载体的表面，形成的蛋白质微阵列。常见的微珠有PVDF微珠，聚丙烯酰氨凝胶微珠、硝化纤维素膜微珠、聚苯乙烯微珠等等。然而这类微珠芯片有其固有的缺点：1、芯片特异性问题，这与芯片微珠表面修饰和修饰物都有关系，芯片微珠表面修饰工艺不好或者修饰物间隔不合适都可能造成芯片微珠表面的非特异性吸附，修饰物的特异性更是直接决定着芯片的特异性。2、芯片容量，芯片微珠的表面积有限，因此所修饰的修饰物数量是一定的，因此，芯片容量也一直是微珠芯片的一个重要问题。3、是芯片微珠同样品的结合不充分，芯片微珠同待检分子的结合属于平面结合，并且芯片微珠所需样品量很小，因此不能保证芯片微珠同样品充分结合，这不像液体中两项能充分混合；4、芯片微珠洗脱不充分，芯片是一个固体平面，洗脱不能完全洗涤微珠，可能造成干扰物质洗涤不完全从而影响芯片微珠的特异性；5、修饰样品量小，对低丰度目标物质的检测能力有限。

因此，需要提供一种特异性高、操作方便、省时省力、集吸附、分离、洗脱于一体的分离微量靶蛋白的系统及其使用方法。

发明内容

本发明针对蛋白的分离纯化过程中所存在的问题，通过综合层析洗脱分离法和蛋白微珠芯片法的优点，创造性发明了用于结合、分离、纯化靶蛋白的系统及其使用方法。

该发明思路在于将蛋白微珠芯片中的微珠粒子，应用于层析洗脱分离领域，即将其作为层析分离柱中的载体，并将常规的层析分离柱环境创造性改变成类似于移液器枪头(tip头)环境，从而获得能在同一环境中进行上样、吸附、洗涤、洗脱、浓缩、鉴定同时还具有蛋白微珠芯片高特异性的应用效果。

因此，本发明第一个目的是提供一种用于吸附、分离、纯化、检测微量靶蛋白的系统。该系统包括：

(1)分离填料；和

(2)用于固定分离填料并使其与溶液结合以及吸取溶液的中空管；

(3)如果需要，分离填料上下面含有用于固定分离填料的支撑网；

其中所述的分离填料是直径约在10-10³μm级或10-10³nm级的微珠组成，该微珠具有生理性无毒、生物高相容性的高分子材料内层和可逆结合或释放靶蛋白的官能团外层。

在一个具体实施方案中，所述的中空管上端孔直径大于下端孔直径，上端孔同移液器前端吻合，分离填料被固定在中空管的中部或下部，通过移液器的吸取作用从下端孔吸入溶液并接触分离填料。

在另一个具体实施方案中，中空管可以类似于移液枪的枪头。

在另一个具体实施方案中，还可包括用于活化分离填料微珠的活化缓冲液。

在另一个具体实施方案中，用于制备所述的中空管和/或支撑网的材料是无机或有机惰性材料。其中惰性材料选自木质、纸质、塑料、玻璃、金属、矿物质。

在另一个具体实施方案中，根据特殊修饰类型选择现有的结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、活化缓冲液，例如用于离子交换修饰、选择吸附修饰、亲和作用修饰中所用的各种已知的结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、活化缓冲液。

在另一个具体实施方案中，组成分离填料的微珠是经表面修饰的固体微珠。这些微珠的材质很特别，可以是琼脂糖、聚丙稀酰铵、纤维素等物质形成的共聚物微珠，主要特点是具有化学惰性，作用在于结合吸附微量靶蛋白，并最终被洗脱缓冲液洗脱靶蛋白。这些微珠很微小，可以是微米级(10-10³μm)的微珠也可以是纳米级(10-10³nm)的微珠；而且微珠形状可以制造成球形的，也可以制造成其他形状如立方体等。其中，所述微珠的内层高分子材料可以选自用于微珠芯片的常规材料，例如聚多糖、聚酯、烯烃共聚物、聚氨化合物、聚酸化合物、蛋白、胶体物、二氧化硅、环氧化合物。其中聚多糖选自琼脂糖、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、淀粉、环糊精或共聚物，聚酯选自聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯-共-碳酸酯)、树脂、聚氨酯、聚己内酯、纤维素酯、聚乙二醇、聚乙烯醇或共聚物；其中烯烃共聚物选自聚砜、聚醚砜、聚偏乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈或共聚物；聚酸化合物选自聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物；蛋白选自胶原、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、白蛋白或共聚物；胶体物选自硅胶、明胶、罗望子胶、沙蒿胶、黄原胶、瓜尔豆胶或共聚物；或以上任意组合的共聚物。因此，本领域技术人员根据试验目的，可自行选用各种现有的微珠材料。

在另一个具体实施方案中，根据所分离的靶蛋白，可对微珠官能团外层进行特殊修饰，特殊修饰选自离子交换修饰、选择吸附修饰(如疏水作用修饰、亲水作用修饰、糖基化作用修饰、脂肪酸作用修饰)、亲和作用修饰(如生物素亲和作用修饰、免疫亲和修饰、凝集素亲和修饰、金属鳌合/配位亲和修饰、染料配体亲和修饰、核酸亲和修饰)。因此，所述特殊修饰的官能团可选自-COOH、-CHO、-NH₂、-SH、-S-S、环氧基、羰基。

本发明的第二个发明目的提供利用所述的系统来吸附、分离、纯化、检测超微量蛋白的方法。其中，步骤包括：

(1)用结合缓冲液稀释或溶解含靶蛋白的混合物，和；

(2)将含有分离填料的中空管的上端孔套入移液器的前端，和；

(3)通过移液器，吸取含靶蛋白的结合缓冲液，并使其反复经过分离填料，使得靶蛋白通过前述修饰的作用与微珠充分结合，和；

(4)弃去结合缓冲液，通过移液器吸取洗涤缓冲液，充分洗去未结合分离填料的杂质，和；

(5)弃去洗涤缓冲液，通过移液器吸取洗脱缓冲液，从分离填料洗脱靶蛋白，并收集靶蛋白洗脱。

在一个具体实施方案中，还包括在吸取含靶蛋白的结合缓冲液之前，用移液器吸取活化缓冲液，以活化分离填料的微珠表面。

本发明的第三个发明目的是提供上述的系统或上述的方法用于制备检测超微量靶蛋白的产品中的用途。

定义：

术语“靶蛋白”指由氨基酸、肽或多肽组成的任何目的蛋白质，包括抗原/抗体、膜蛋白、糖蛋白、弱酸弱碱蛋白、脂蛋白、金属亲和蛋白、抗体/抗体蛋白、磷酸化蛋白等)。

术语“微珠”，又称“微球”、“微粒”、或“纳米粒子”，是用于层析吸附结合中具有生物惰性的微米级或纳米级的有机或无机粒子，并通常作为层析吸附结合中的载体或填料。

术语“疏水性修饰”，指将微珠表面处理成具有疏水特征的表面，如表面特征修饰C骨架等。由于C骨架的长短决定着疏水性作用的大小和所分离的多肽的特征，因此不同的疏水能力、不同C骨架可结合具有疏水性基团的不同大小的靶蛋白。然后利用多肽中含有疏水基团，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离、分析微量靶蛋白的目的。例如，C18疏水性修饰一般只用来纯化分离10个氨基酸以下的多肽和肽的酶消化产物，C8修饰的微珠可用来分离一般大小的多肽，较大的多肽的分离和纯化需要用到C3乃至Cl修饰的微珠表面。

术语“亲水性修饰”，指将微珠表面处理成具有疏水特征的表面，然后利用多肽中含有亲水性基团(如-OH基团等等)，可与固定相之间产生亲水作用而达到分离、分析微量靶蛋白的目的。其中亲水能力同基团数量相关，这些基团可以同具有亲水基团的蛋白相结合。例如，参见文献：Advanced Materials，2001，13，11-22；Chemistry of Materials，1999，11，2389-2399；Chemical Communications，2002，350-351；Chemistry of Materials，2003，15，1944-1949。

术语“糖基化修饰”，是指将微珠表面暴露于进行糖基化的酶(例如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)，从而具有作为配体或受体的靶蛋白相结合的能力。

术语“脂肪酸修饰”，指将微珠表面亲和上脂肪酸，通过形成疏水的脂肪酸支链形成类似细胞膜的疏水环境，使得细胞膜上的靶膜蛋白通过疏水作用插入并结合到微珠。

术语“离子交换修饰”，指，是将微珠表面处理成具有吸附(弱)阳/阴离子特征的表面，如表面特征的修饰(弱)阴/阳离子，从而特征吸附含有(弱)阳/阴离子的蛋白。离子交换修饰包括(弱)阴/阳离子修饰。由于微珠表面带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷不同，可分为阴离子交换微珠和阳离子交换微珠。含有欲被分离的离子的溶液同微珠混合后，各种离子即与微珠上的荷电部位竞争性结合。微珠表面荷点部位由基质、荷电基团和反离子构成，在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。微珠表面与水溶液中离子或离子化合物所进行的离子交换反应是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子A⁺与溶液中的阳离子B⁺可发生可逆的交换反应，反应式如下：

微珠表面利用其荷电基团，吸附溶液中相反电荷的离子或离子化合物，被吸附的物质随后为带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。

术语“亲和性修饰”，利用了亲和层析(Affinity Chromatography，AC)的基本原理。亲和层析法是利用蛋白分子对其配体分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离蛋白的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱，包括生物素亲和作用层析、免疫作用层析、凝集素作用层析、金属鳌合/配位作用层析、染料配体作用层析、核酸亲和层析。

亲和层析法特异可逆结合的物质很多，如抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等。因此，术语“亲和性修饰”指根据所分离的靶蛋白的类型，将其对应配体的官能团引入微珠表面，以使得微珠作为靶蛋白的配体能特异吸附、释放靶蛋白。因此，根据靶蛋白与其配体的关系，亲和性修饰可包括生物素亲和作用修饰、免疫亲和修饰、凝集素亲和修饰、金属鳌合/配位亲和修饰、染料配体亲和修饰、核酸亲和修饰。

例如，术语“生物素亲和修饰”，指将微珠表面亲和结合生物素、亲和素等亲和物质，通过它们同靶蛋白相结合。

例如，术语“免疫亲和修饰”，是利用抗体与其相应抗原的作用具有高度的特异性和高度结合力的特点，将靶蛋白的抗原、抗体偶联在微珠表面，以通过这些物质使得微珠与各自互补的靶蛋白相结合。常见的免疫亲和修饰包括单抗亲和修饰、细菌胞壁蛋白A和蛋白G亲和修饰(它们能够特异结合到免疫球蛋白的Fc部分，对不同的免疫球蛋白有不同的结合力)。

例如，术语“凝集素亲和修饰”，指将凝集素引入微珠表面，由于凝集素可特异结合靶蛋白的寡糖，从而使得微珠特异结合、洗脱纯化靶蛋白。不同的凝集素能够特异地结合某种寡糖或者糖肽，因而借助于凝集素表面修饰可特异、敏感、快速分析具有糖链结构的靶蛋白，例如几乎所有的膜蛋白。

例如，术语“金属鳌合/配位亲和修饰”，是利用靶蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和微珠之上的金属离子之间的相互作用，将所述金属离子引入微珠表面，从而特异吸附、洗脱纯化靶蛋白。这些氨基酸残基包括组氨酸、色氨酸、赖氨酸等。目前采用的固定金属离子螯合剂主要有亚氨基二乙酸(IDA)和次氨基三乙酸(NTA)两种。它们都可以有效地与Ni2+，Zn2+，Cu2+和Co2+等二价金属离子发生螯合作用，从而将这些金属离子固定在微珠表面上。固定金属亲和层析(Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC)是近年来发展起来的一种亲和方法，其固定相基质上鳌合了一些金属离子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等。因此在微珠表面进行金属鳌合/配位亲和修饰时，可通过配位键鳌合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构，使得靶蛋白最易结合到修饰过的微珠表面上，以达到很好的纯化效果。

例如，术语“染料配体亲和修饰”，指将染料三嗪环与羟基反应偶联到微珠表面，在它们之间形成醚键，以作为纯化脱氢酶、激酶、血清蛋白、干扰素、多种血浆蛋白等极好的配体，从而使得微珠吸附、洗脱纯化靶蛋白。常用的染料主要有两类，一类是Cibacron，另一类是Procion。这些染料结构中都有三嗪环，环上有1～2个可被取代的氯原子。染料的结构类似于某些酶类的底物，如Cibacron Blue F3GA与NAD的分子结构类似，是许多酶和蛋白质的极有效的吸附剂。

例如，术语“核酸亲和修饰”指将特异核酸片段偶联在微珠上，通过核酸片段可吸附、洗脱对应的核酸结合蛋白以及调节蛋白。通过所述的核酸亲和修饰过的微珠或载体，已经纯化了许多DNA结合蛋白，包括转录因子和与DNA修复、重组和转座有关的靶蛋白。例如倪菊华等采用偶联CATTGCT寡核苷酸的DNA亲和层析载体上从发育13天鸡胚骨骼肌核抽提物中分离到两种核蛋白。

应当指出的是，由于本发明综合了层析洗脱分离法和蛋白微珠芯片分离法的优点，创造性发明了用于结合、分离、纯化靶蛋白的系统及其使用方法。也就是说，本发明的关键是将蛋白微珠芯片分离法的微珠系统，转用到层析洗脱分离领域，从而发明快速、简便的分离微量靶蛋白的系统。因此，本发明中所使用的各种材料和修饰、加工过程，如微珠、缓冲液、对微珠的修饰方法，均可使用现有技术。

例如，各种类型的微珠(包括修饰类型)可使用现有的微珠(例如琼脂糖微珠可购自Sigma Chemicals，St.Louis，MO)。

例如，对于应用现有的天然高分子，再将它们加工成形为微珠，已有一些专利报道，如JP11181147A(1999)、EP075000A1(1996)、US5064949A(1991)和JP3028241A(1991)报道了应用纤维素及衍生物制造微珠的方法。WO9119746A(1991)和EP0087786A(1983)则报道了琼脂和琼脂糖微珠的成形技术。CN1105369A(1995)和JP62100534A(1987)报道了制造甲壳素微珠的方法。合成高分子微珠一般都是在高分子合成过程中用单体通过如悬浮聚合、乳液聚合或分散聚合的方法来制造的。此外，W.-H.Hou等报道了单分散的聚酰胺微珠的报道(J.Appl.Polym.Sci.45(1992)1783)。

此外，中国公开专利CN1353130公开了一种新型制备颗粒度均匀的高分子微珠方法，其发明原理是首先配制高分子溶液，然后往溶液中滴加沉淀剂，促使高分子溶液相分离，产生富含高分子且尺寸均匀的液珠。在另一种不会沉淀的高分子保护下，控制搅拌速度和温度，使液珠彼此不碰撞以保持尺寸的稳定性，最后液珠转化为高分子均匀微珠或针状微珠。起保护作用的高分子在配制高分子溶液和沉淀剂时加入。

在一个实例中，将欲加工成微珠或针状微珠的高分子称之为高分子甲；将起保护作用的高分子称之为高分子乙；将高分子甲的溶剂称之为溶剂甲，高分子乙也溶解于溶剂甲；将高分子甲的沉淀剂但同时又是高分子乙的溶剂称之为溶剂乙。因此，成形高分子均匀微珠的过程是：

(1)配制高分子甲和乙在溶剂甲中的混合高分子溶液。高分子甲的浓度范围为0.001-0.1克/毫升，高分子乙的浓度是高分子甲0.1-10倍。此溶液命名为溶液甲。

(2)配制高分子乙在溶剂乙中的高分子溶液。高分子乙的浓度范围为0.001-0.2克/毫升，溶剂乙与溶剂甲完全混溶。此溶液命名为溶液乙。

(3)将溶液乙在搅拌下滴入溶液甲中，促使溶液甲相分离。首先产生富含高分子甲的液珠，并逐渐转化为高分子甲的溶胀微珠。溶液乙的用量是溶液甲的1-10倍，以保证高分子甲充分沉淀出来。滴加溶液乙时，搅拌速度为5-500转/分。温度低于溶剂甲和乙的沸点。

4)用过滤，离心或沉淀的方法分出高分子甲的溶胀微珠。用溶剂乙反复浸泡和洗涤，不断更换溶剂乙以洗去溶剂甲及少量共沉淀的高分子乙。这时溶胀微珠逐渐收缩，最后得到颗粒度均匀的高分子(甲)微珠。

在该公开专利中，还进一步描述了成形高分子均匀针状微珠的过程是：

(1)配制高分子甲和乙在溶剂甲中的混合高分子溶液。高分子甲的浓度范围为0.001-0.1克/毫升。高分子乙的浓度是高分子甲的0.1-10倍。此溶液命名为溶液甲。

(2)配制高分子乙在溶剂乙中的高分子溶液。高分子乙的浓度范围为0.001-0.2克/毫升。溶剂乙与溶剂甲完全混溶。此溶液命名为溶液乙。

(3)将溶液乙在搅拌下滴入溶液甲中，促使溶液甲相分离。首先产生富含高分子甲的液珠，并逐渐转化为高分子甲的溶胀针状微珠。溶液乙的用量是溶液甲的1-10倍，以保证高分子甲充分沉淀出来。滴加溶液乙时，搅拌速度为100-10000转/分。温度可接近溶剂甲和乙的沸点。

(4)用过滤，离心或沉淀的方法分离高分子甲的溶胀针状微珠。用溶剂乙反复浸泡和洗涤，不断更换溶剂乙，以洗去溶剂甲及少量共沉淀的高分子乙。这时溶胀针状微珠逐渐收缩，最后得到颗粒度均匀的高分子(甲)针状微珠。

基于上述类似理由，本发明中所使用的各种缓冲液(包括活化缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液)也可使用现有的缓冲液。

例如，在用于选择吸附层析纯化人粒细胞集落刺激因子的微珠体系中，由于微珠表面进行了聚乙二醇的疏水性修饰处理，因此该微珠体系可使用常规的缓冲液，如结合和洗涤缓冲液为的50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.5)，而洗脱缓冲液为含1mol/L NaCl的50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.5)。

例如，在用于亲和层析纯化IgG单抗的微珠体系中，由于微珠表面进行了蛋白G的免疫亲和修饰处理，因此该微珠体系可使用常规的缓冲液，如结合和洗涤缓冲液为pH7.0、20mmol/L磷酸缓冲液，而洗脱缓冲液为pH2.7、0.1mmol/L甘氨酸盐酸。

例如，在用于亲和层析纯化血小板膜糖蛋白I、III受体复合物的微珠体系中，由于微珠(琼脂糖胶珠)表面进行了刀豆素A(凝集素)的亲和修饰处理，因此该微珠体系可使用常规的缓冲液，如结合和洗涤缓冲液为20mmol/L Tris.HCl、100mmol/L Na2Cl、0.1％TritonX2-100、1mmol/L CaCl2(pH 7.4)的缓冲液，而洗脱缓冲液为结合缓冲液中加入100mmol/Lα2甲基2D2甘露糖苷。

例如，在用于亲和层析纯化超氧化物岐化酶的微珠体系中，由于微珠表面进行了二价铜离子的金属鳌合修饰处理，因此该微珠体系可使用常规的缓冲液，如结合和洗涤缓冲液为20mmol/L磷酸缓冲液(含0.5mol/L NaCl，pH7.2)，而洗脱缓冲液依次为20mmol/L磷酸缓冲液(含0.5mol/L NaCl，pH7.2)、20mmol/L磷酸缓冲液(含0.8mol/L NaCl，Ph6.0)、20mmol/L磷酸缓冲液(含0.5mol/L(NH₄)₂SO₄，pH7.8)。

从以上实例可知，由于离子交换层析、选择吸附层析(如疏水作用层析、亲水作用层析、糖基化作用层析、脂肪酸作用层析)、亲和作用层析(如生物素亲和作用层析、免疫亲和层析、凝集素亲和层析、金属鳌合/配位亲和层析、核酸亲和层析)都已经广泛用于分离纯化各种靶蛋白，因此对于上述层析法所对应的微珠修饰，所涉及的各种缓冲液(活化、结合、吸附、洗涤、洗脱缓冲液等)均是上述层析法中已知的。因此，在使用本发明的系统进行分离、纯化、鉴定微量靶蛋白中，根据所述靶蛋白的现有技术中的提示，本领域技术人员可毫不费力地选择适当的缓冲液。

有益效果

(1)常规的层析法涉及冗长的制备填料、上柱、洗脱等过程，并且难以分离微量靶蛋白，而本发明可分离、检测微量靶蛋白，大大减少时间；

(2)由于是立体系统，本发明克服了常规蛋白芯片的平面分离缺陷，能充分结合靶蛋白并除去杂质；

(3)本发明所用的各种材料及其加工过程均可使用常规技术，具有较高地通用性；

(4)本发明所用的各种材料可利用现有的材料，来源广泛，有效地降低成本；

(5)本发明仅仅应用到简单的移液工具，无需昂贵的仪器；

(6)本发明所需样品很少，可在同一系统中对样品进行预处理；

(7)本发明具有较高的检测准确度；

(8)本发明操作简单迅速，可以同临床应用中有关蛋白质纯化提取的工作很好的结合。

附图说明

图1：包含分离填料的中空管立体图，其中1、3为分离填料的上、下界面，2为分离填料。

图2：未包含分离填料的中空管剖面侧视图，此时1、3为分离填料的上、下界面支撑网。

图3：包含分离填料的中空管剖面正视图，其中1、3为分离填料的上、下界面，2为分离填料。

图4：放大的微珠剖面图，其中4为微珠的高分子内层，5为高分子外层，6为官能团。

图5：分离、纯化的微量靶蛋白的质谱检测图。其中，图A是分离后的酸性靶蛋白的质谱检测图；图B是分离后的金属结合靶蛋白的质谱检测图。

具体实施方式：

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。

实施例一：微珠的制备

1.壳聚糖微珠

壳聚糖(chitosan)，化学名称(1，4)-A-氨基-A-脱氧-B-D-葡聚糖，是N-脱乙酰基氨基葡萄糖的共聚物，由于壳聚糖及其衍生物无毒，具有生物降解性及良好的生物相容性，被广泛用于酶和细胞的固定化载体。

以下是壳聚糖微珠的制备过程：称取壳聚糖9，溶于300mL2％的醋酸溶液中，连续搅拌2h使其充分溶解，抽滤去除不溶物，滤液分别加入Tween-80 10mL、油相分散介质、致孔剂乙酸乙酯、乳化剂及高分子表面改性剂，50℃下充分搅拌充分反应30min，升温至60℃，加入甲醛溶液，反应30min，再加入戊二醛2.0ml，调pH9.0，升温至80℃，反应60min.抽滤，用煤油充分洗涤，再用无水乙醇洗涤去除残留有机物.80℃干燥，得20～100μm的壳聚糖微珠。

2.硅胶微珠的制备

(1)将正硅酸乙酯、乙醇和去离子水混合进行水解，正硅酸乙酯与乙醇的体积比为1∶0.25～1，正硅酸乙酯与水的摩尔比控制在1∶2～10之间；加入氨水调节pH值，pH值控制在8～12之间，搅拌6～12小时，得到均匀半透明的聚四乙氧基硅烷溶液；

(2)将上述聚四乙氧基硅烷溶液加入水中进行分散，水与聚四乙氧基硅烷溶液的体积比为1～4；再加热溶液，保持在80～100℃，蒸发除去乙醇；

(3)将上述溶液冷却至室温，用浓盐酸调节pH在2.5～5.0之间；边搅拌边加入尿素的甲醛混合溶液聚合，尿素与甲醛的摩尔比为1∶0.5～1.5，混合溶液的加入量为正硅酸乙酯∶混合溶液＝10∶2～6体积；重新调节pH值为2.5～5.0，5～40分钟后加入水终止反应，得到3～10μm的粒径均匀分布有机无机复合微珠，停止搅拌，放置过夜陈化；将有机-无机复合物微珠在650～750℃灼烧除去有机物，得3～10μm球形硅胶，粒径分布范围±0.5μm。

3.共聚物微珠的制备：

(1)聚乳酸共聚物微珠

材料：单甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物[Monomethoxy-poly(ethyleneglycol)-b-poly-dl-lactide，PELA40000(2000)，其中2000为MPEG链段分子量，40000为PELA分子量]，聚乳酸[Poly(lactic acid)，D，L-PLA，分子量40000，山东医疗器械公司]，聚(乳酸-羟基乙酸)[Poly(lactide-co-glycolide)，PLGA，乳酸和羟基乙酸的摩尔比为50∶50，分子量40000，山东医疗器械公司]，其他试剂均为国产分析纯试剂。

乳化均质机(T18 Basic，IKA Co.，China)，离心机(CS-6KR，Beckman Co.，USA)，激光粒度仪(Hydro2000MU，Malvern Instruments Co.，UK)，场发射扫描电子显微镜(JSM-6700F，JEOL，Japan)。

微珠制备过程如下：

采用复乳法制备微珠.先将0.5mL去离子水(内水相W1)倒入溶有55mg共聚物膜材的2mL乙酸乙酯(Ethyl Acetate，EA，油相O)中，用均质机乳化15s.将该初乳液倒入15mL去离子水(外水相W2)中，再复乳化60s，形成W1/O/W2型复乳液.将复乳液倒入10mL去离子水中，室温下200r/min搅拌3min，使部分乙酸乙酯扩散到外水相中，进行预固化.再将其倒入400mL去离子水中，室温下500r/min搅拌4min进行固化，使乙酸乙酯完全除去.用去离子水离心洗涤3次，从而得到大孔微珠。

(2)聚偏氟乙烯和聚乙烯醇二甲基乙酰胺的共聚微珠

在5000毫升的三口瓶中置入浓度为0.04克/毫升的聚偏氟乙烯和0.02克/毫升的聚乙烯醇二甲基乙酰胺溶液1000毫升。在搅拌下滴加浓度为0.04克/毫升的聚乙烯醇水溶液，滴加时注意要等到前一滴所引起的沉淀基本消失方可滴入下一滴。当滴加液达2000毫升时溶液出现混浊。继续滴加，直至滴加液总量达3000毫升。滴加时搅拌速度为500转/分，温度为95℃。搅拌过夜。第2天用离心机在3000转/分下收集微珠沉淀物，并不断用水洗，烘干，收率82％。微珠直径d＝2.97微米，分散系数ε＝0.23。

(3)二乙酸纤维素和聚乙烯醇二甲基乙酰胺的共聚微珠

在5000毫升的三口瓶中置入浓度为0.02克/毫升的二乙酸纤维素和0.04克/毫升的聚乙烯醇二甲基乙酰胺溶液1000毫升。在搅拌下滴加浓度为0.04克/毫升的聚乙烯醇水溶液，滴加时注意要等到前一滴所引起的沉淀基本消失方可滴入下一滴。当滴加液达230毫升时溶液出现混浊，达400毫升时完全混浊。继续滴加，直至滴加液总量达2000毫升。滴加时搅拌速度为250转/分，温度为40℃。搅拌过夜。第2天滤出微珠，用水反复洗涤，烘干，收率53％。微珠直径d＝8.65微米，分散系数ε＝0.25。

实施例二：微珠的表面官能团修饰

1.壳聚糖微珠的表面亲和修饰过程

将壳聚糖微珠加适量无离子水，用环氧氯丙烷活化，加入EDC和肝素，4℃搅拌24h，得表面亲和修饰的微珠。

将壳聚糖微珠的长链烷基作疏水部分，硫酸基团为亲水部分，合成N-辛基-O-硫酸壳聚糖(OCS1)，可得到表面亲水性修饰的微珠。

2.纤维素微珠的表面离子交换修饰过程

将洗涤干净的纤维素微珠，加至含0.1mol/L DEAE盐酸盐、0.5mol/L NaOH的溶液中，置60℃下不断搅拌10h，使其交联-DEAE弱碱性阴离子交换基团。

3.微珠的金属鳌合亲和修饰

将微珠加入5mol/L的氢氧化钠溶液中80℃反应30min；再加入2∶4∶5(V∶V∶V)的5mol氢氧化钠/二甲基亚砜/环氧绿丙烷，40℃继续反应4h；然后再加入1mol/L络合试剂亚氨基乙酸并于60℃水浴反应4h，最后将微球置于0.01mol/L硫酸铜溶液中进行反应，得到表面鳌合金属铜的微球。

实施例三：中空管中的分离填料的装载

将圆径较小的细钢丝网或金属丝网从上端孔放入，并位于中空管的中部或下部，再装入分离填料。根据待分离样品的多少，调整分离填料的密度。最后装入圆径较大的细钢丝网或金属丝网，从而固定分离填料。

或者，在制备微珠的过程中，封闭或塞住中空管上端孔直至分离填料的上限位置，而后将中空管倒置插入微珠溶液，调整分离填料在中空管的位置，待分离填料在中空管中固定后，从中空管的上端取出封闭物或堵塞物，即可得到含有分离填料而无圆网支撑物的中空管。

实施例四：酸性蛋白、金属结合蛋白的结合、纯化、鉴定

(1).取98ul结合缓冲液于0.5ml的eppendorf管中，加入2ul血清。选取弱阳离子结合分离装置，20-200ul移液器前端固定分离装置，吸取EP管中样品，轻柔来回吸打5次，静置1min。吹弃样品。0.6ml漂洗缓冲液加入1.5mlEP管中，把移液器调节到120ul吸取漂洗缓冲液，在另一个EP管中中反复吸打三次，弃去漂洗缓冲液，如此重复三次。吸取20ul洗脱缓冲液，静置2mins。把洗脱液吸入一新的0.2ulEP管。洗脱液可以进行蛋白质谱检测和鉴定，结果如图5-A所示，其中横坐标代表所检测蛋白的质荷比(其中电荷为1)，纵坐标为峰强度，每个质谱峰的峰高对应着蛋白质的相对含量。

(2)取98ul结合缓冲液于0.5ml的eppendorf管中，加入2ul血清。选取Cu²⁺离子结合分离装置，20-200ul移液器前端固定分离装置，吸取EP管中样品，轻柔来回吸打5次，静置5min。吹弃样品。0.6ml漂洗缓冲液加入1.5mlEP管中，把移液器调节到120ul吸取漂洗缓冲液，在另一个EP管中中反复吸打三次，弃去漂洗缓冲液，如此重复三次。吸取20ul洗脱缓冲液，静置5mins。把洗脱液吸入一新的0.2ulEP管。洗脱液可以进行蛋白质谱检测和鉴定，结果如图5-B所示，其中横坐标代表所检测蛋白的质荷比(其中电荷为1)，纵坐标为峰强度，每个质谱峰的峰高对应着蛋白质的相对含量。

Claims

1.一种用于吸附、分离、纯化、检测超微量靶蛋白的系统，其特征包括：

(1)分离填料；和

其中所述的分离填料是直径约在10-10³μm级或10-10³nm级的微珠组成，该微珠具有生理性无毒、生物高相容性的高分子材料内层和可逆结合或释放靶蛋白的官能团外层；和

其中所述的中空管上端孔径大于下端孔径，上端孔同移液器前端吻合，分离填料被固定在中空管的中部或上部，通过移液器的吸取作用从下端孔吸入溶液并接触分离填料。

2.权利要求1中所述的系统，其中还可包括用于吸附靶蛋白的结合缓冲液、用于洗去微珠中杂质的洗涤缓冲液、用于洗脱微珠上靶蛋白的洗脱缓冲液。

3.权利要求1中所述的系统，其中还可包括用于活化微珠的活化缓冲液。

4.权利要求1至3中所述的系统，其中用于制备所述的中空管和/或支撑网的材料是无机或有机惰性材料。

5.权利要求4所述的系统，其中惰性材料选自木质、纸质、塑料、玻璃、金属、矿物质。

6.权利要求1至5中任一所述的系统，其中分离填料微珠的内层高分子材料选自聚多糖、聚酯、烯烃共聚物、聚氨化合物、聚酸化合物、蛋白、胶体物、二氧化硅、环氧化合物或以上共聚物。

7.权利要求6所述的系统，其中聚多糖选自壳聚糖、纤维素、琼脂糖、淀粉、环糊精或共聚物；聚酯选自聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯-共-碳酸酯)、树脂、聚氨酯、聚己内酯、纤维素酯、聚乙二醇、聚乙烯醇或共聚物；烯烃共聚物选自聚砜、聚醚砜、聚偏乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈或共聚物；聚酸化合物选自聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物；蛋白选自胶原、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、白蛋白或共聚物；胶体物选自硅胶、明胶、罗望子胶、沙蒿胶、黄原胶、瓜尔豆胶或共聚物；或以上任意组合的共聚物。

8.权利要求1至7中任一所述的系统，其中根据分离的靶蛋白对微珠官能团外层进行特殊修饰，所述的特殊修饰包括离子交换修饰、疏水作用修饰、亲水作用修饰、糖基化作用修饰、脂肪酸作用修饰、生物素亲和作用修饰、免疫亲和修饰、凝集素亲和修饰、金属鳌合/配位亲和修饰、染料配体亲和修饰、核酸亲和修饰

9.权利要求8所述的系统，其中所述特殊修饰的官能团选自-COOH、-CHO、-NH₂、-SH、-S-S、环氧基、羰基。

10权利要求1至9中任一所述的系统，其中根据特殊修饰类型选择现有的结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、活化缓冲液。

10.前述权利要求中任一所述的系统，其中靶蛋白包括膜蛋白、弱酸弱碱蛋白、糖蛋白、脂蛋白、金属亲和蛋白、抗体蛋白、磷酸化蛋白。

11.前述任一权利要求所述的系统用于吸附、分离、纯化、检测超微量蛋白的方法。

12.权利要求11所述的方法，步骤包括：

(1)用结合缓冲液稀释或溶解含靶蛋白的混合物，和；

(3)通过移液器，吸取含靶蛋白的结合缓冲液，并使其反复经过分离填料，使得靶蛋白与微珠充分结合，和；

13.权利要求12所述的方法，其中还包括在吸取含靶蛋白的结合缓冲液之前，用移液器吸取活化缓冲液，以活化分离填料的微珠表面。

14.权利要求1-10所述的系统或权利要求11-13所述的方法用于制备检测超微量靶蛋白的产品中的用途。