CN105732891A - 一种核壳结构的聚合物微球及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属高分子材料和分析技术领域，涉及一种单分散核壳结构聚合物纳米粒子及其制备和应用。单烯类功能单体与多烯类交联单体通过聚合制得的聚合物粒子为核，然后通过聚合物表面的残留双键和半胱氨酸的巯基之间发生的巯基与双键的点击化学(thiol-ene)技术在核表面修饰上半胱氨酸单体，形成表面光滑且带有氨基和羧基亲水性功能基团核壳结构的聚合物纳米粒子。本发明在材料表面通过thiol-ene反应接枝半胱氨酸引入氨基和羧基等亲水基团，不仅克服了传统后修饰方法反应效率低、步骤繁琐以及副反应多等缺点，而且提高表面功能基团的键合量。本发明的聚合物纳米粒子可用于分离或富集糖肽、糖蛋白，在蛋白质组学等领域有较好的实用价值和应用前景。

Description

一种核壳结构的聚合物微球及其制备和应用

技术领域

本发明涉及富集糖肽，具体地说是一种单分散核壳结构聚合物纳米粒子及其制备和在糖肽富集中的应用。

背景技术

糖蛋白作为一类重要的翻译后修饰蛋白，在生物免疫、信号转导及肿瘤发生等生物学过程中发挥着重要的作用。因此，糖肽的发现与鉴定在疾病的诊断和蛋白质组学领域意义重大。在众多技术中，利用质谱技术对于研究糖蛋白糖基化位点信息的分析及糖型结构的归属已经成为现在研究糖肽的主要方法。但由于糖蛋白丰度低、糖肽占总肽段比例小，因此在用质谱分析检测时往往被高丰度的非糖肽掩盖，因此在分析之前，需要对糖肽进行选择性富集。

目前最常用的糖蛋白富集方法包括亲水作用色谱、凝集素亲和色谱，酰肼及硼酸功能化材料等。其中，亲水作用色谱(HILIC)是根据糖肽与非糖肽之间亲水性差异将其分开。此方法步骤简便快捷，避免了糖链结构的破坏，且富集产物与质谱兼容。因此，亲水作用色谱在糖肽选择性富集领域受到了人们的关注。目前，在利用亲水作用色谱用于糖肽富集的材料中，使用较为广泛的是糖类和磺酸类功能基团材料。目前主要是利用这些功能分子接枝在基质材料的表面(ZXiong,ZLiangZhao,FWang,JZhu,HQin,RWu,WZhangHZou,Chem.Commun.,2012,48,8138–8140；GHuang,ZXiong,HQin,JZhu,ZSun,YZhang,XPeng,JOu,HZou,AnalyticaChimicaActa,2014,809,61-68)。然而所采用的后修饰接枝策略效率较低并且步骤极其繁琐。有研究利用点击化学的方式在硅球上进行半胱氨酸的修饰制备亲水作用色谱进行糖肽富集(LRen,YLiu,MDong,Z.Liu.J.Chromatogr.A.2009,1216,8421-8425；ZLin,JPang,HYang,ZCai,LZhang,G.Chen,Chem.Commun.2011,47,9675-9677；YLiu,LRen,ZLiu.Chem.Commun.2011,47,5067-5069)，虽半胱氨酸键合效率提高且糖蛋白富集效果较好，但硅球颗粒较大，其比表面积较小，而且硅球本身具有非特性吸附强，因此限制此类材料对于糖肽的富集。

发明内容

针对以上不足，本发明提供一种简单、省时、易行、产物重现性高的聚合反应方法，得到的产物颗粒为纳米级，形状规整，单分散性好，表面含有大量氨基和羧基亲水性基团。利用该聚合物材料作为富集材料，对糖肽的分离富集以及可以兼容后续的质谱直接分析，从而解决了糖蛋白质组学样品的分析困难。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

步骤一：将单烯类功能单体、多烯类交联剂和引发剂等与反应溶液，一同加入到250mL的圆底烧瓶中，超声1分钟，使得加入的试剂溶解形成均匀的溶液。之后将Dean-Stark接收器接于圆底烧瓶之上，接收器上接冷凝管，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，反应体系温度由室温在10～60分钟内升到60～140℃。维持60～140℃条件下，在1～4小时内将反应体系中的溶剂蒸馏掉30-70％，停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶液洗三遍，之后用四氢呋喃、丙酮、无水乙醚各洗涤3遍后，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。

步骤二：在25mL的圆底烧瓶中，装上冷凝管，加入反应溶剂，加入步骤一中得到的聚合物核颗粒、半胱氨酸、引发剂等，超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒溶解形成均匀分散在溶液中。之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。将反应装置均匀缓慢加热，在30min内升温至60～80℃。维持60～80℃条件下反应4-48小时，停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶液洗三遍，之后用四氢呋喃、丙酮、无水乙醚各洗涤3遍后，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。

在步骤一中，所说的单烯类功能单体为丙烯酸、丙烯酸酯类、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、丙烯酰胺、4-乙烯吡啶或N-乙烯基吡咯烷酮。多烯类交联单体是N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、双甲基丙烯酸乙二醇酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯、二乙烯基苯，混合物中两者的摩尔比例为1:0.2至1:8。引发剂选偶氮类自由基引发剂。反应溶液为乙腈、甲醇、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺。含有单烯类功能单体，多烯类交联单体和引发剂的溶剂中，单体的总摩尔数浓度为0.05～0.4mol/L，引发剂占单体总质量的0.5～10％，余量为反应溶剂。制备出来的单分散聚合物微球，其粒径为200nm～1μm，聚合物微球的PdI小于0.2。

在步骤二中，引发剂选偶氮类自由基引发剂，反应溶液为乙腈、甲醇、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺。含有半胱氨酸和引发剂的溶剂中，半胱氨酸的总摩尔数浓度为0.01～0.2mol/L，引发剂占半胱氨酸总质量的0.5～10％，余量为反应溶剂。制备出来的单分散聚合物微球，其粒径为200nm～5μm，聚合物微球的PdI小于0.2。

本发明具有如下优点：

1.本发明所述制备方法，采用蒸馏沉淀聚合与点击化学结合，使得制备材料时间减少，反应重现性高，反应条件温和，反应效率高。

2.本发明制备核壳结构聚合物纳米粒子的粒径分布较窄，粒径单分散，且聚合物颗粒干净。

3.聚合物纳米颗粒外层形成采用点击化学接枝半胱氨酸，使得本发明核壳结构聚合物纳米粒子的表面含有大量氨基和羧基等功能基团，并具有更高的糖肽的选择性和吸附容量。

4.通过本发明制备的具有亲水功能的核壳结构聚合物纳米粒子；通过亲水基团与糖肽上糖的相互作用，实现糖肽的选择性富集和之后的质谱直接分析，开辟聚合物微球在蛋白质组学方面的新应用。

附图说明

图1单分散核壳结构聚合物纳米粒子的X射线光电子能谱。出现了S元素1s轨道的结合能谱图(162eV)。

图2单分散核壳结构聚合物颗粒对糖蛋白(免疫球蛋白G，IgG)与非糖蛋白(牛血清白蛋白，BSA)的经过trypsin酶解常物按质量比1：10混合的富集效果图。a)原液；b)富集产物。

具体实施方式

下面采用具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

1.单分散核壳结构聚合物纳米粒子的制备

在250mL的圆底烧瓶中，加入130mL乙腈，加入165mg甲基丙烯酸(MAA),1200mgN，N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)以及27mg偶氮二异丁腈(AIBN)等，超声1分钟，使得加入的试剂溶解形成均匀的溶液，在烧瓶上装上Dean-Stark接收器，其上接冷凝管，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，反应器由室温在30分钟内升到115℃。维持115℃条件下，在2小时内将反应体系中的溶剂蒸馏掉一半，停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶液洗三遍，之后用四氢呋喃、丙酮、无水乙醚各洗涤3遍后，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时，得到poly(MBAAm-co-MAA)。在25mL的圆底烧瓶中，装上冷凝管，加入反应溶剂水-乙醇混合溶液15mL，加入聚合物核颗粒400mgpoly(MBAAm-co-MAA)、150mg半胱氨酸(Cys)20mg偶氮二异丁腈(AIBN)等，超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒溶解形成均匀分散在溶液中，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至65℃。维持65℃条件下反应12小时，停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶液洗三遍，之后用四氢呋喃、丙酮、无水乙醚各洗涤3遍后，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。

2.聚合物纳米粒子的表征

X射线光电子能谱如图1所示，在161mV出现了S元素的1s的结合能，证明了材料中硫基团的存在。

实施例2

将糖蛋白(免疫球蛋白G，IgG)与非糖蛋白(牛血清白蛋白，BSA)的经过trypsin酶解常物按质量比1：10混合，并溶解于乙腈：水：三氟乙酸体积比为85:15:0.1上样溶液中，从而制得浓度为100ng/μL的蛋白混合溶液。

称取1mg在实施例1中制备的poly(MBAA-co-MAA)Cys核壳结构聚合物纳米粒子，分散在200μL上述蛋白溶液中，在室温条件下孵育30分钟，反应结束后离心，弃上清。上样溶液洗涤材料数遍，离心弃上清。在分离得到的材料中加入15μL水：三氟乙酸体积比为100:0.1的混合溶液，在室温下孵育1小时，离心取去富集产物。将蛋白原液和富集产物进行MALDI-TOFMS鉴定。

将1μL待分析物与1μLDHB基质(20mg/mL2,5-二羟基苯甲酸溶于含1％三氟乙酸的60％乙腈溶液)依次点于MALDI靶板上，待样品点干燥后进行质谱鉴定。MALDI-TOFMS实验是在UltraflexⅢTOF/TOF(BrukerDaltonics,Bremen,Germany)上进行，检测时采用线性正离子模式。

如图2所示，a图为未经过材料分离富集处理的原蛋白混合溶液，b图为富集产物。如图2a所示，在IgG与BSA混合的蛋白溶液中没有鉴定到IgG的糖蛋白，经核壳型聚合物纳米粒子富集之后(图2b)鉴定到了15条糖肽；且无非糖肽的非特异吸附(图3b)。表明材料具有较好的糖蛋白富集能力及良好的亲水性。

Claims (10)

1.一种核壳结构的聚合物微球，其特征在于：

所述聚合物微球颗粒，以单烯类功能单体与多烯类交联单体制得的聚合物粒子为核，核表面为通过巯基与双键(thiol-ene)的点击化学接枝的半胱氨酸分子作为壳；此聚合物微球颗粒为：表面光滑且带有氨基和羧基等亲水基团核壳结构的聚合物纳米粒子。

2.按照权利要求1所述的聚合物微球，其特征在于：所述核颗粒的单烯类功能单体为丙烯酸酯类、丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、4-乙烯吡啶或N-乙烯基吡咯烷酮中的一种或二种以上；多烯类交联单体是N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、双甲基丙烯酸乙二醇酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯或二乙烯基苯中的一种或二种以上。

3.按照权利要求1或2所述的聚合物微球，其特征在于：单烯类功能单体与多烯类功能单体的摩尔比为1:0.2至1:5。

4.按照权利要求1所述的聚合物微球，其特征在于：壳的表面带有氨基和羧基功能基团，其表面的半胱氨酸在壳中质量分数范围是5％～40％。

5.按照权利要求1所述的聚合物微球，其特征在于：

所述聚合物微球为单分散核壳结构聚合物纳米粒子，粒径为150nm-5μm；且对于糖肽具有亲水作用色谱机理(HILIC)的富集作用。

6.一种权利要求1-5任一所述聚合物微球的制备方法，其特征在于：

1)形成聚合物核：将溶剂、单烯类功能单体、多烯类功能单体与引发剂混合加入反应器中，通惰性气体5～60分钟；将反应器温度从室温在10～60分钟内升到反应溶液沸腾状态，然后在0.5～4小时内将反应体系中的溶剂蒸馏掉30％-70％，核心聚合物微球在溶剂蒸馏过程中形成；离心得到聚合物微球，之后依次使用反应溶剂洗涤微球中未反应物质2～5遍，在真空干燥箱中至恒重；

2)制备聚合物微粒的壳层：将得到的聚合物核颗粒、半胱氨酸、引发剂在反应溶剂体系中混合，在60-80℃下反应4-48小时；离心分离得到核壳结构聚合物纳米粒子，之后依次使用反应溶剂洗涤微球中未反应物质2～5遍，在真空干燥箱中至恒重。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：形成核时期，单烯类功能单体与多烯类功能单体的摩尔比为1:0.2至1:8，单体总摩尔数浓度为0.05-0.4mol/L；

其所用的溶剂为乙腈、甲醇、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺中一种或二种以上混合；

引发剂为偶氮类自由基引发剂，加入量占单体总质量的0.5-10％。

8.按照权利要求6所述的制备方法，在形成核壳时期，体系中加入半胱氨酸质量与聚合物微球核比为1:0.1至1:10；半胱氨酸摩尔浓度为0.01-0.5mol/L；

形成核壳时期，所述引发剂为偶氮类自由基引发剂，加入量占半胱氨酸总质量的0.5～10％。

9.按照权利要求6所述的制备方法，形成核壳时期，其所用的溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、水中一种或二种及以上混合溶液。

10.一种权利要求1所述聚合物微球可用于生物样品中糖肽、糖蛋白的分离和富集。