CN108169392A

CN108169392A - 一种富含氨基的微孔聚合物材料富集糖肽的方法

Info

Publication number: CN108169392A
Application number: CN201611115119.9A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 李秀玲; 姜舸
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2018-06-15

Abstract

本发明涉及一种富含氨基的微孔聚合物材料的糖肽富集方法。本方法使用几种富含氨基的微孔聚合物材料，利用含有唾液酸糖肽和中性糖肽的蛋白酶解液作为样品，采用柱固相萃取模式(SPE)或分散固相萃取模式(dSPE)，应用亲水作用和静电作用的原理，通过优化流动相中有机相和水相的比例以及在流动相中添加酸和缓冲盐等来调节流动相的pH值，实现了对糖肽的选择性富集。该方法具有通量高、选择性好、吸附量大、灵活性强、操作简便、覆盖糖肽范围广等优点，可用于标准品和复杂样品的糖肽富集。

Description

一种富含氨基的微孔聚合物材料富集糖肽的方法

技术领域

本发明在化学领域涉及有机微孔聚合物合成、色谱富集、分离材料的制备。同时还涉及糖肽富集，即基于有机微孔聚合物材料(PMF)在糖分离富集中的应用。与传统的糖肽富集方法如亲水作用色谱富集方法(HILIC)、苯硼酸亲和色谱法、破坏性的肼化学法相比，将聚合物修饰材料用于富集糖肽，所建立的方法具有选择性高、吸附容量大和通量高的优点。此外，富集可在固相萃取柱(SPE)模式或者dSPE模式下进行，操作简单，可重复性好，适用于复杂体系中糖肽的选择性分离富集。

背景技术

蛋白质糖基化是最常见的翻译后修饰之一^[1]。糖蛋白参与细胞中的多种生命活动，在细胞粘附、蛋白质的转运、定位和分子识别等活动中发挥了重要的作用^[2-3]。已有研究指出，许多疾病也与蛋白质糖基化的异常有关^[4]。近年来，质谱作为一种重要的定性和定量的分析技术被广泛用于特定位点糖型分析和糖蛋白糖基化位点鉴定^[5]。通常先把糖蛋白酶解成肽段，然后从酶解的糖肽和非糖肽的混合物中富集糖肽，进一步对其进行质谱分析。由于糖肽仅占所有酶解后肽段的小部分(2％～5％)^[6]，其质谱响应很容易被高丰度非糖肽抑制。而且，由于糖链的微观不均一性，一个糖基化位点上的糖链类型可能多达几十种，进一步降低了糖肽的相对量而使得它们很难被检测到。因此，对于糖肽的特异性富集就显得非常重要。糖肽富集应用最广泛的方法是凝集素和亲水作用色谱富集糖肽^[7-8]。但是，这两种富集方法都存在一定的缺点。例如，凝集素特异性强，只能针对特定的糖型富集，导致糖肽覆盖范围小；亲水作用色谱存在亲水性非糖肽共富集的问题。酰肼化学富集法存在操作繁琐，副反应多的问题。

富含氨基的微孔材料具有比表面积大、吸附能力强、表面亲水基团丰富等优点。本发明应用三聚氰胺和含醛基的功能单体合成一系列的微孔聚合物材料，利用三聚氰胺和含醛基的功能单体的反应活性、氢键作用以及空间电子的排斥作用，在聚合过程中形成具有微孔的聚合物，该聚合物具有热稳定性好、微孔含量高、吸附能力强等优点^[9]。由于其具有高交联度和高比表面积的结构的特点，因此吸附量大，三聚氰胺单体含有三个氨基，因此其聚合物也富富含氨基，具有亲水性和静电性，可以特异性的吸附糖肽，有效地分离糖肽和非糖肽。三聚氰胺可以与多种官能团反应，合成多种材料，因此可以覆盖大部分的糖肽。本发明应用dSPE，通量高，选择性好，操作简便，可用于蛋白酶解液和生物样品中的糖肽富集。

参考文献：

1.Hagglund P.,Bunkenborg J.,Elortza F.,et al.J Proteome Res,2004,3(3):566.

2.Kazuaki O.,Marth J.D.,Cell,2006,126(5):855

3.Hann S.R.,Semin Cancer Biol,2006,16:288

4.Slawon C.,Hart G.W.,Nart Rev Cancer,2011,11,673

5.Hyun K.A.,John W.F.,Carlito B.L.,Curr Opin Chem Biol,2009,13(4):421

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9.Schwab M.,Fassbender B.,Spiess H.,et al.J AM Chem.Soc.2009,131,7216

10.Schwarz D.,Weber J.,Macromol Mater Eng 2015,300,531

本发明目的采用下述方案来实现：

发明内容

本发明涉及一种富含氨基的微孔聚合物材料富集糖肽的方法。

本方法使用富含氨基的微孔聚合物作为富集材料，通过优化流动相中有机相和水相的比例以及在流动相中添加酸和缓冲盐等来调节流动相的pH值实现了对糖肽的选择性富集。本方法涉及的色谱模式为亲水作用色谱和亲和作用色谱原理。

1.所列举四种代表性PMF的分子结构如参考文献9和参考文献10所报道：

2.本发明的富含氨基的微孔聚合物材料应用在中性糖肽、唾液酸类糖肽的分离，以及糖肽/糖蛋白的富集以及选择性分离等领域。

3.本发明中各种糖类物质的分离采用亲水作用色谱分离模式。

4.本发明的富集操作采用SPE模式或dSPE模式

原理：

富集唾液酸糖肽：上样条件和冲洗条件都是弱酸性，在弱酸性条件下材料带正电，唾液酸糖肽带负电或者不带电，唾液酸糖肽通过静电作用和亲水作用在材料上保留；在此条件下，非糖肽带正电，与材料之间存在静电排斥作用，导致非糖肽在材料上的保留减弱，容易被冲洗液洗掉。在洗脱糖肽时使用碱性溶液，在碱性条件下材料和唾液酸糖肽都带负电，由于静电排斥作用和低乙腈下弱亲水作用，可以把糖肽洗脱下来。

富集中性糖肽：上样条件和冲洗条件都是酸性，在酸性条件下材料带正电，中性糖肽和非糖肽都带正电，肽段与材料间存在静电排斥作用和亲水作用，由于糖肽比非糖肽的极性强，所以中性糖肽和材料之间的作用比非糖肽强，从而使中性糖肽保留在材料上，非糖肽被除去；洗脱中性肽糖时低乙腈碱性溶液，在碱性条件下材料和中性糖肽都带负电，由于静电排斥作用和低乙腈的洗脱能力，可以把糖肽洗脱下来。

本发明的目的在于提供一种具有高选择性、糖基化覆盖率广和操作简单的糖肽富集方法，能对痕量糖肽进行选择性富集。

具体的制备步骤如下：

具体操作时采用SPE或dSPE，过程如下：

SPE模式：

将聚合物材料加载到移液枪枪头或者SPE小柱上，先用3-100倍材料体积的洗脱液冲洗材料，然后用材料体积3-100倍的上样液平衡材料，将蛋白酶解液去盐旋干，重溶于上样液中，上样体积为材料体积的5-200倍，加载到移液枪枪头或SPE小柱上；用5-200倍材料体积的淋洗液冲洗材料，去除非糖肽；用5-10倍材料体积的洗脱溶液洗脱糖肽，收集洗脱液，即为糖肽。

dSPE模式：

将材料装入EP管中，先用3-100倍材料体积的洗脱液振荡冲洗材料，离心弃上清液，然后用材料体积3-100倍的上样液振荡平衡材料，离心弃上清液，将蛋白酶解液去盐旋干，重溶于上样液中，上样体积为材料体积的5-200倍，振荡孵化，离心弃上清液，用5-200倍材料体积的淋洗液振荡冲洗材料，去除非糖肽，离心弃上清液；用5-10倍材料体积的洗脱液振荡洗脱糖肽，离心，收集上清液，即为糖肽。振荡转数为100-2500rpm，样品与材料之间的振荡孵化时间为10-120分钟，孵化温度为15-60度。

该方法具有选择性高、吸附量大、操作简便可控等特点，适用于生物样品中糖肽的选择性富集。

本发明具有如下优点：

1.本发明中的材料由于对糖肽和非糖肽不同的静电作用力和亲水作用，可以特异性的分离糖肽和非糖肽，获得高富集选择性。

2.本发明可应用SPE模式和dSPE模式，不受实验条件的限制。

3.本发明由于应用分散固相萃取模式，可以在同一时间操作多个实验，通量高。

4.本发明由于使用分散固相萃取模式，使用振荡器和离心机对材料进行孵化和离心，减少人为操作误差，操作简便，重复性高。

5.本发明中的材料以三聚氰胺为主要功能单体，应用多种官能团，可以特异性的富集多种糖肽，材料灵活性强，覆盖糖肽范围广。

6.本发明中的材料由于是富含氨基的聚合物材料，比表面积大，材料与样品之间的作用面积大，因此吸附量大。

附图说明

图1.采用PMF在SPE模式下富集胎球蛋白酶解液中糖肽的质谱图；

图2.采用PMF在dSPE模式下富集的胎球蛋白酶解液中糖肽的质谱图。

具体实施方式

为使本发明中涉及材料的结构特点、富集方法和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。

实施例中所用原料及设备:

二硫苏糖醛，碘代乙酰胺，尿素，碳酸氢铵，胎球蛋白，牛血清白蛋白，辣根过氧化酶，胰蛋白酶，唾液酸糖肽标准品都购自Sigma-Aldrich公司。所用水为去离子水，其他试剂如甲醇，乙腈等均使用市售色谱级。质谱分析结果由Q-TOF获得。

本发明以下实施例所使用的富含氨基的微孔聚合物材料结构式为：

制备方法如文献[9]和文献[10]所述：在三口圆底烧瓶中加入2.5g三聚氰胺溶于2mL乙醇中，然后加入4.0g甲醛或者其他的三醛化合物，在180摄氏度加热反应72小时，随后将烧瓶冷却至室温，加入3mL乙醇冲洗，收集得到白色固体产物PMF。

实施例1

以PMF1作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，5μL去盐旋干的胎球蛋白(1mg/mL)重溶于20μL 85％乙腈/0.1％甲酸溶液(是指体积浓度85％乙腈的甲酸溶液，甲酸溶液中甲酸质量浓度0.1％)中，上样后，分别用40μL的体积浓度80％乙腈/0.1％甲酸、40μL 70％乙腈/0.1％甲酸和40μL 60％乙腈/0.1％甲酸的溶液洗脱，最后用40μL 50％乙腈/0.1％甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析，如图1所示质谱图中的肽段都是糖肽。

实施例2

以PMF1作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，5μL去盐旋干的胎球蛋白(1mg/mL)重溶于20μL 85％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用40μL的体积浓度80％乙腈/1％甲酸、40μL 70％乙腈/1％甲酸和40μL 60％乙腈/1％甲酸的溶液洗脱，最后用40μL 50％乙腈/1％甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析,如图2所示质谱图中的肽段都是糖肽。

实施例3

以PMF1作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入tip中，5μL去盐旋干的胎球蛋白(1mg/mL)重溶于20μL 85％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用40μL的体积浓度80％乙腈/1％甲酸、40μL 70％乙腈/1％甲酸和40μL 60％乙腈/1％甲酸的溶液洗脱，最后用40μL 50％乙腈/1％甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例4

以PMF1作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，5μL去盐旋干的胎球蛋白(1mg/mL)重溶于20μL 80％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用40μL的体积浓度75％乙腈/0.1％甲酸、40μL 70％乙腈/1％甲酸溶液洗脱，最后用40μL50％乙腈/5mM碳酸氢铵溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。由图1可见，富集后的质谱图中，非糖肽很少，说明聚合物材料对糖肽的选择性很好。

实施例5

以PMF1作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将1mg聚合物材料装入离心管中，5μL胎球蛋白酶解液(1mg/mL)和90μL(1mg/mL)牛血清白蛋白混合去盐旋干，重溶于50μL80％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用40μL的体积浓度75％乙腈/0.1％甲酸和40μL含有70％乙腈/0.1％甲酸的溶液洗脱两次，最后用20μL 50％乙腈/5mM碳酸氢铵溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例6

以PMF1作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将1mg聚合物材料装入离心管中，5μL胎球蛋白酶解液(1mg/mL)和900μL(1mg/mL)牛血清白蛋白混合去盐旋干，重溶于100μL80％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用40μL的体积浓度75％乙腈/0.1％甲酸和40μL含有70％乙腈/0.1％甲酸的溶液洗脱两次，再用20μL的体积浓度65％乙腈/0.1％甲酸的溶液洗脱一次；最后用20μL 50％乙腈/5mM碳酸氢铵溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。由图2可见，即使在高达100倍牛血清白蛋白的干扰下，胎球蛋白(fetuin)酶解产物中的糖肽仍然被可以被从聚合物材料上洗脱下来。并且材料对糖肽选择性依然很高，说明聚合物材料富集唾液酸糖肽具有特异性。

实施例7

以PMF1作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，5μL去盐旋干的胎球蛋白(1mg/mL)重溶于20μL 70％乙腈/2％甲酸溶液中，上样后，分别用40μL的体积浓度70％乙腈/0.1％甲酸、40μL 40％乙腈溶液洗脱，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例8

以PMF1作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，5μL去盐旋干的胎球蛋白(1mg/mL)重溶于20μL 70％乙腈/2％甲酸溶液中，上样后，分别用40μL的体积浓度70％乙腈/0.1％甲酸、40μL 40％乙腈溶液洗脱，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例9

以PMF3作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，5μL去盐旋干的胎球蛋白(1mg/mL)重溶于20μL 80％乙腈/2％甲酸溶液中，上样后，分别用40μL的体积浓度80％乙腈/1％甲酸、40μL 40％乙腈溶液洗脱，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例10

以PMF2作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，5μL的胎球蛋白(1mg/mL)和90μL(1mg/mL)牛血清白蛋白混合去盐旋干，重溶于50μL 80％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用200μL的体积浓度75％乙腈/0.1％甲酸和40μL 40％乙腈的溶液洗脱两次，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例11

以PMF2作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，5μL胎球蛋白(1mg/mL)和90μL(1mg/mL)牛血清白蛋白混合去盐旋干，重溶于50μL 80％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用200μL的体积浓度75％乙腈/0.1％甲酸和40μL40％乙腈的溶液洗脱两次，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例12

以PMF2作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将0.5mg聚合物材料装入离心管中，5μL胎球蛋白(1mg/mL)和90μL(1mg/mL)牛血清白蛋白混合去盐旋干，重溶于50μL 80％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，用200μL的体积浓度75％乙腈/0.1％甲酸洗脱六次，然后用40μL 40％乙腈溶液洗脱一次，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例13

实施例14

以PMF2作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将1mg聚合物材料装入离心管中，5μL胎球蛋白(1mg/mL)和(1mg/mL)牛血清白蛋白混合去盐旋干，重溶于500μL 80％乙腈/0.1％甲酸溶液中，上样后，分别用200μL的体积浓度70％乙腈/2％甲酸和65％乙腈/2％甲酸洗脱六次和十次，然后用40μL 40％乙腈溶液洗脱一次，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例15

以PMF2作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将1mg聚合物材料装入离心管中，5μL胎球蛋白(1mg/mL)和9mL(1mg/mL)牛血清白蛋白混合去盐旋干，重溶于500μL 80％乙腈/0.1％甲酸溶液中，，上样后，分别用200μL的体积浓度70％乙腈/2％甲酸和65％乙腈/2％甲酸洗脱六次和十次，然后用40μL 40％乙腈溶液洗脱一次，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例16

以PMFX作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将1mg聚合物材料装入离心管中，5μL去盐旋干的辣根过氧化酶(1mg/mL)重溶于70％乙腈/2％甲酸溶液中，上样后，分别用200μL的体积浓度85％乙腈/2％甲酸和80％乙腈/2％甲酸洗脱一次和两次，然后用40μL 40％乙腈溶液洗脱一次，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例17

以PMF2作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，5μL去盐旋干的辣根过氧化酶(1mg/mL)和9μL牛血清白蛋白混合去盐，上样后，分别用200μL的体积浓度85％乙腈/2％甲酸和80％乙腈/2％甲酸洗脱一次和两次，然后用40μL40％乙腈溶液洗脱一次，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例18

以PMF2作为富集材料，在dSPE模式下富集糖肽。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，5μL去盐旋干的辣根过氧化酶(1mg/mL)和18μL牛血清白蛋白混合去盐，上样后，分别用300μL的体积浓度85％乙腈/2％甲酸和80％乙腈/2％甲酸洗脱一次和两次，然后用40μL40％乙腈溶液洗脱一次，最后用40μL 40％乙腈/2％氨水溶液洗脱，去盐。去盐液直接在质谱上进行分析。

实施例19

以PMFX作为富集材料，在dSPE模式下测糖肽的吸附量。将0.2mg聚合物材料装入离心管中，胎球蛋白(1mg/mL)去盐，每次在SPE柱上上样20μL，直接在质谱上进行分析，直到检测到糖肽信号。

实施例20

以PMFX作为富集材料，以唾液酸糖肽标准品为样品，在dSPE模式下测糖肽的回收率。将0.2mg聚合物材料装装入离心管中，用二甲基标定的方法测唾液酸糖肽标准品的回收率，5μL(1mg/mL)轻标记的样品用上述方法富集，洗脱液和5μL(1mg/mL)未富集的重标记的样品混合，在质谱上分析，轻标的糖肽信号和重标的糖肽信号的百分比即回收率。

实施例21

胎球蛋白的酶解过程：

配如下溶液：

a.8M尿素的50mM碳酸氢铵溶液；

b.200mM二硫苏糖醛的50mM碳酸氢铵溶液；

c.200mM碘代乙酰胺的50mM碳酸氢铵溶液；

1mg胎球蛋白溶于100μL溶液a中，加5μL溶液b，56℃45min,加入20μL溶液3，避光保存30min,加入25μg胰蛋白酶，37℃酶解16h，加入5μL甲酸终止酶解反应，-80℃保存。

Claims

1.一种富含氨基的微孔聚合物材料富集糖肽的方法，基于三聚氰胺与含有醛基、羟基、氨基中的一种或二种以上的功能单体的聚合物材料用于糖肽富集，该聚合物能实现对糖肽的富集。

2.按照权利要求1所述的方法，特征在于：该聚合物材料由功能单体三聚氰胺和下列任意一种或二种以上功能单体组成：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：基于三聚氰胺的聚合物材料应用在糖肽的富集和纯化方面；材料的结构如下中的一种或二种以上：

4.按照权利要求3所述方法，其特征在于：

富集材料中三聚氰胺与功能单体的摩尔比为1:1；聚合度范围为100-10000。

5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：富集材料形貌为无定型或者球形,孔径为2-50nm；将所述聚合物材料作为富集材料，采用柱固相萃取模式(SPE)或分散固相萃取模式(dSPE)富集和纯化糖肽；

在SPE模式下，首先将聚合物材料加载到末端带有筛板的SPE小柱上，先用洗脱液冲洗材料，然后采用上样液平衡材料，之后将溶解在上样液中的样品加载到富集材料上，采用淋洗液冲洗材料除去非糖肽，最后用洗脱液洗脱材料上的糖肽；在dSPE模式下，将富集材料置于离心管中，先用洗脱液冲洗材料，然后采用上样液平衡材料，之后把材料与溶解在上样液中的样品混合，孵化后，离心弃上清液，所剩沉淀部分用淋洗液冲洗，振荡后，离心弃上清液，沉淀部分用洗脱液洗脱糖肽，振荡后，离心取上清液即得糖肽。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：

上样液组成为缓冲盐溶液和/或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为70-85％，pH在1-5范围内，缓冲盐的浓度为0-50mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％-5％；

淋洗液组成为缓冲盐溶液和/或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶液的体积比例为55-80％，pH＝1-5，缓冲盐的浓度为0-50mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％-5％；

洗脱液组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为0-50％，pH值在1-5或10-14范围内，缓冲盐的浓度为0-50mM。

7.按照权利要求5所述方法，其特征在于，所用的蛋白酶解液样品应去盐旋干，重溶于上样液，蛋白酶酶解液样品重溶后的浓度为0.01-10mg/mL，样品的上样量与聚合物材料量之间的体积比例为1:20-1:1000，实验操作温度为15-60摄氏度。

8.按照权利要求5或6所述方法，其特征在于，冲洗材料所用洗脱液的体积为材料体积的3-100倍，平衡材料所用的上样液体积材料体积的3-100倍，上样体积为材料体积的5-200倍，淋洗材料所用的淋洗液体积为材料体积的5-200倍，洗脱糖肽所用的洗脱液体积为材料体积的5-10倍。

9.按照权利要求5所述方法，其特征在于，采用dSPE方法富集糖肽，振荡转数为100-2500rpm，样品与材料之间的孵化时间10-120分钟，孵化温度为15-60度。

10.按照权利要求5或6所述方法，其特征在于，有机溶剂包括但不局限于乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、甲苯等中的一种或二种以上，缓冲盐包括但不局限于甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵(用缓冲盐酸根离子相应的酸调节到一定的pH范围内)等，酸包括但不局限于甲酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、羟基乙酸等中的一种或二种以上。