CN104689806A - 功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱及其制备方法，固相萃取小柱的基质为功能化的SiO2/TiO2复合纳米微球，是由原始介孔SiO2纳米微球经胺基化、TiO2羧基化共价化学修饰，然后通过酰胺反应复合所得。该功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的填装高度为(0.2～0.5)cm。主要适于富集生物体液以及复杂基质中的磷酸化肽。本发明固相萃取柱具有对目标物质回收率高(92％-105％)，制备成本低，材料易得，功能化过程简单，适应性强，易于批量生产的特点，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分析化学中与蛋白质组学相关的材料富集技术领域，涉及一种介孔SiO2/TiO2纳米复合材料的制备方法，主要用于磷酸化蛋白的选择性富集和检测，富集后的样品进行质谱检测，从而大大提高对磷酸化蛋白的检测灵敏度。
背景技术
磷酸化是一个共价磷酸基团可逆结合到一个或者多个氨基酸，这是细胞调控机制中最常见的蛋白质修饰。在生物学理论研究中，磷酸化作用是调节和控制蛋白质活力和功能最基本、最普遍，也是最重要的机制，参与多种细胞监管功能，如控制细胞周期、信号传导、分化、增殖、改造和新陈代谢作用；在医药学临床实践中，磷酸化蛋白起着诱导内皮细胞的增殖、减少细胞凋亡、增加脑组织缺氧耐受性、促进血管生成等重要医疗作用，参与各类疾病的临床研究，如肿瘤的研究以及新的药物靶标的发现等。磷酸化蛋白质组学的研究是促进其生物学理论与医学应用紧密结合的桥梁。因此，检测被修饰的磷酸化蛋白，对深入研究其细胞调控机制并将其运用至各类顽疾的调查研发具有极为重要的意义。
为了分析蛋白的磷酸化作用，已有研究者用蛋白酶消解蛋白，将所得的肽片段直接通过质谱技术分析。[参见：(a)Pinkse，M.W.H.；Uitto，P.M.；Hilhorst，M.J.；Ooms，B.；Heck，A.J.R.Anal.Chem.2004，76，3935-3943.(b)Yue，G.E.；Roper，M.G.；Balchunas，C.；Pulsipher，A.；Coon，J.J.；Shabanowitz，J.；Hunt，D.F.；Landers，J.P.；Ferrance，J.P.Anal.Chim.Acta 2006，564，116-122.]目前该方法遇到许多问题：一，，由于消化后的肽混合物过于复杂，磷酸化一般以亚化学计量方式发生，因此非磷酸化肽的丰度要比磷酸化肽高得多；二，用于检测磷酸化肽的质谱分析技术灵敏度低；三，在低寿命的质谱条件下，磷酸根离子的离子化效率在检测方面变得更低。可见，目前的质谱分析技术对于磷酸化肽的检测较为困难。为了解决检测磷酸化肽的各种困难，各种技术都在向磷酸化肽的富集方向发展。[参见：(a)Leitner，A.Trends Anal.Chem.2010，29，177-185.(b)Dunn，J.D.；Reid，G.E.；Bruening，M.L.Mass Spectrom.Rev.2010，29，29-54.(c)Rogers，L.D.；Foster，L.J.Mol.Biosyst.2009，5，1122-1129.(d)Han，G.；Ye，M.；Zou，H.Analyst 2008，133，1128-1138.(30)Mamone，G.；Picariello，G.；Ferranti，P.；Addeo，F.Proteomics2010，10，380-393.]
目前，以共价或非共价相互作用为基础的磷酸化肽富集方法在各项研究中使用。磷酸化肽在固定的金属磷酸盐离子对的相互作用下，通过结合螯合金属离子采用金属离子亲和层析法(IMAC)[参见：(a)Andersson，L.；Porath，J.Anal.Biochem.1986，154，250-254.(b)Posewitz，M.C.；Tempst，P.Anal.Chem.1999，71，2883-2892.]。在金属氧化物和磷酸基团之间的相互作用下，金属氧化物亲和层析(MOAC，例如，二氧化钛、氧化锆)也被用于磷酸化肽的富集[参见：(a)Larsen，M.R.；Thingholm，T.E.；Jensen，O.N.；Roepstorff，P.；Jorgensen，T.J.D.Mol.Cell.Proteomics 2005，4，873-886.(b)Kweon，H.K.；Hakansson，K.Anal.Chem.2006，78，1743-1749.]。虽有报道各种富集方法，但到目前为止，未曾有报道采用相关功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米材料实现选择性富集。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的固相萃取小柱及其制备方法，能够用于富集生物体液以及复杂基质中的磷酸化肽。
技术方案：一种功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的固相萃取小柱，所述的固相萃取柱的基质为功能化的介孔SiO2/TiO2复合纳米微球，介孔SiO2纳米微球直径为50～150nm，平均孔径为4～5nm，介孔SiO2纳米微球表面附着TiO2纳米球，TiO2纳米球直径为3～5nm；固相萃取柱空管容积为100μL～1mL，填装高度为0.2～0.5cm，空管材质为聚烯烃。
制备所述的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的方法，由原始介孔SiO2纳米微球经胺基化修饰、TiO2纳米球经羧基化修饰，然后通过酰胺反应所得，共价化学修饰按以下步骤进行：
(1)介孔SiO2纳米微球表面胺基化：在无水乙醇溶剂中加入介孔SiO2纳米微球和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，介孔SiO2纳米微球与APS的质量比为2∶1～1∶5，介孔SiO2纳米微球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于50～90℃条件下反应5～24小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的胺基化的介孔SiO2纳米微球；
(2)TiO2纳米球表面羧基化：在二氯甲烷溶剂中加入制备得到的TiO2纳米球及3-巯基丙酸(MPA)，TiO2纳米球和MPA的质量比为20∶1～4∶1，TiO2纳米球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10～40℃条件下反应0.5～2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的羧基化的TiO2纳米球。
(3)功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的制备：在水溶液中加入制备得到的介孔SiO2纳米微球和TiO2纳米球以及交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰亚胺(NHS)，SiO2/TiO2质量比为4∶1～3∶1，SiO2与EDC、NHS质量比为(20～5)：1∶1，介孔SiO2纳米球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10～40℃条件下反应0.5～2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球。
所述的一种功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的固相萃取小柱，制备方法为：
(1)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5～20μm；
(2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球干法填装入柱内；
(3)在填装的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球上放入另一片多孔性聚乙烯上筛板，聚乙烯筛板孔径为5～20μm，压紧填料使填装柱高度保持在0.2～0.5cm，制备得到固相萃取小柱。
所述介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱用于富集的步骤包括：在进行富集之前，首先用(5～20)mL甲醇、乙腈或者相应的缓冲溶液活化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球，然后在负压驱动下使样品溶液流过柱子，采用适量体积清洗液洗去基体的杂质，使用合适的洗脱液把分析物洗脱收集到容器中，然后进行分析。
与现有的固相富集小柱相比，本发明所提供的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱具有以下优点：
(1)环境友好：本发明的介孔型SiO2/TiO2纳米复合材料本身是环境友好的，并且在制备过程中，步骤简单，只需消耗少量的有机溶剂，不会引入其他有毒有害物质；
(2)稳定性好，可再生和重复利用。吸附在介孔型SiO2/TiO2纳米复合材料上的目标物能容易地用少量有机溶剂洗脱下来，键合的官能团不会被破坏，可以重复利用。
(3)二氧化硅被胺功能化可固定磷酸化多肽基团，而二氧化钛通过螯合金属离子捕获、富集。本发明是由经胺基化修饰后的二氧化硅纳米颗粒与经羧基化修饰后的二氧化钛纳米颗粒，通过酰胺化作用结合，从而制得对磷酸化蛋白具有多重富集作用的纳米复合型材料；
(4)在完成发明的过程中，选择β-酪蛋白作为研究目标物，对所述固相萃取小柱的各项性能指标进行了反复测试。结果表明对于上述样品中的磷酸化多肽的加标回收率均能达到92％-105％，解吸过程简单，2mL的乙腈或者其盐溶液就可将上述物质洗脱下来，实验结束后，将固相萃取小柱用乙腈、甲醇各5mL依次洗涤，无需其他操作，即可重复使用。
附图说明
图1为功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱示意图，图中为：固相萃取柱管1、上筛板2、下筛板3、功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球填料4；
图2为合成得到的介孔型SiO2纳米微球透射电镜图A(TEM)，TiO2纳米球透射电镜图B以及复合后的介孔型SiO2/TiO2纳米复合材料透射电镜图C；
图3为SiO2、TiO2、介孔型SiO2/TiO2纳米复合材料的FT-IR表征图；
图4为本发明的固相萃取小柱富集后的β-酪蛋白的质谱图；
图5为β-酪蛋白没有经过富集的标准质谱图。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下面结合附图，通过具体实施例对本发明进一步详述。
实施例1：功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球填料的制备
实验材料：十六烷基三甲基溴化铵，批号为：J1315062，购自上海阿拉丁试剂有限公司；油酸钠，批号为20120920，购自国药集团化学试剂有限公司；钛酸正四丁酯，批号为：20140121，购自上海阿拉丁试剂有限公司；1，3，5-三甲苯，批号为：I1329044，购自上海阿拉丁试剂有限公司；硅酸四乙酯，批号为：L1306074，购自上海阿拉丁试剂有限公司；2，5-二羟基苯甲酸，批号为：J1312017，购自南京化学试剂有限公司；3-巯基丙酸，批号为：38194，购自上海阿拉丁试剂有限公司；胰蛋白酶(1：250)，批号为20130929，上海阿拉丁试剂有限公司；β-酪蛋白，批号为SLBK9882V，上海阿拉丁试剂有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)，批号K1220037，上海阿拉丁试剂有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，批号090M14531V，上海阿拉丁试剂有限公司；琥珀酰亚胺(NHS)，批号MKBG7914V，上海阿拉丁试剂有限公司。
实验仪器及设备：圆底烧瓶、KQ-500DE超声波清洗器、聚四氟乙烯反应釜、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、DF-101S磁力加热搅拌器、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
实验过程：
(1)SiO2纳米微球的制备
将3.5ml的2mol/L氢氧化钠溶液和480ml离子水混合于大烧杯中，依次加入1.0g十六烷基三甲基溴化胺(CATB)和7ml三甲苯(TMB)混合均匀，在80℃下剧烈搅拌4h，再加入5.0ml正硅酸四乙酯(TEOS)，混合均匀，继续在80℃剧烈搅拌2h，冷却，在9000转/分钟转速下离心过滤，用无水乙醇洗涤，重复三次。之后沉淀40℃下真空干燥，即得介孔SiO2纳米微球。
(2)SiO2纳米微球胺基功能化
取上述SiO2纳米微球200mg于圆底烧瓶中同时加入磁力搅拌子，加入无水乙醇40mL，之后加入200mg 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，混合后通N2半小时以排出空气，在磁力搅拌器中水浴80℃条件下反应6h，反应完成后离心分离(9000转/min，5min)，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的胺基化的介孔SiO2纳米微球；
(3)TiO2纳米球的制备
2.0g油酸钠于50ml烧杯中，加入15ml乙醇和10ml水，搅拌，并密封，逐渐缓慢滴入1.0ml钛酸四丁酯(TBOT)，搅拌，将所得溶液移至水热反应釜，至于烘箱中150℃，反应12h。将所得混浊液离心，取沉淀加二氯甲烷溶解离心，洗涤；之后沉淀40℃下真空干燥，即得介孔TiO2纳米微球。
(4)TiO2纳米球羧基功能化
取200mg上述TiO2纳米微球于50ml小烧杯中，加入40ml二氯甲烷溶解，加搅拌子搅拌，并加入30mg 3-巯基丙酸(MPA)，混合后通N2半小时以排出空气，置于30℃下反应2h，反应完成后离心分离(9000转/min，5min)，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的羧基化的TiO2纳米微球。
(5)功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的制备
在250mL圆底烧瓶中加入上述制备得到的胺基化的介孔SiO2纳米微球150mg和TiO2纳米球40mg，分散于50mL水中，然后加入交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)10mg、琥珀酰亚胺(NHS)10mg，混合后通N2半小时以排出空气，在搅拌作用下于30℃条件下反应2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球。
实施例2：介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱的制备
A.萃取柱的准备
1、空柱材料和规格
现有的固相萃取小柱空柱规格从100μL～1mL不等。空柱材料为聚丙烯，小柱上下各有20μm孔径的聚乙烯筛板，上述空柱均可使用于本发明中。在下面的实验例中本发明采用1mL的规格。
2、固相萃取柱的填料
固相萃取柱的填料为功能化的介孔SiO2/TiO2复合纳米微球，介孔SiO2纳米微球直径为50～150nm，平均孔径为4～5nm，介孔SiO2纳米微球表面附着TiO2纳米球，TiO2纳米球直径为3～5nm；固相萃取柱空管容积为100μL～1mL，填装高度为0.2～0.5cm，空管材质为聚烯烃。
所述的一种功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的固相萃取小柱，制备方法为：
(1)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5～20um；
(2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球干法填装入柱内；
(3)在填装的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球上放入另一片多孔性聚乙烯上筛板，聚乙烯筛板孔径为5～20μm，压紧填料使填装柱高度保持在0.2～0.5cm，制备得到固相萃取小柱。
3、填装量和填装高度的选择
用前述A准备的材料填装1mL固相萃取柱，如附图1，将一片多孔性聚乙烯下筛板3置于固相萃取柱管1底部，称取相当于固相萃取柱空管容积二分之一的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球4放入固相萃取柱管1中，然后将多孔性上筛板2放在填料上部，压紧填料使填装柱高度保持在0.3cm，得到功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱。
实施例3：选择β-酪蛋白作为研究目标物，对所述固相萃取小柱的各项性能指标进行测试
实验材料：β-酪蛋白购自于上海阿拉丁试剂有限公司，批号为：SLBK9882V；胰蛋白酶(1∶250)购自于上海阿拉丁试剂有限公司，批号为：20130929；2，5-二羟基苯甲酸，批号为：J1312017，购自于南京化学试剂有限公司。
实验仪器和设备：质谱仪为MALDI-TOF-MS(AximaTOF2massspectrometry，Shimadzu，Kyoto，Japan)、按上述实施例2中制备的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱。
实验过程：
(1)取β-酪蛋白配成1mg/mL的标准溶液备用(pH8.0，50mM碳酸氢铵溶液为溶剂)；取胰蛋白酶配成0.05mg/mL的标准溶液备用(pH8.0，50mM碳酸氢铵溶液为溶剂)；取2，5-二羟基苯甲酸配成20mg/mL基质溶液备用(1.0％磷酸水溶液：乙腈混合液(v/v 1∶4)为溶剂)；
(2)β-酪蛋白原消化样品液的制备：在37℃条件下，β-酪蛋白标准溶液与胰蛋白酶标准溶液以10∶1摩尔比混合，振荡2小时，得到β-酪蛋白的胰蛋白酶消化样品液；
(3)β-酪蛋白富集液的制备：用前述A准备的介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱尖端吸入β-酪蛋白原消化样品液，用pH 4.0缓冲溶液(100mM醋酸盐缓冲液∶乙腈混合液(v/v4∶1)pH 4.0)洗涤三次，分离出非磷酸化多肽；用pH 1.0解吸溶液(1％三氟乙酸水溶液∶乙腈混合液(v/v 1∶1)pH1.0)洗脱被吸附的磷酸化多肽，收集到容器中而得到β-酪蛋白富集液；
(4)取1uLβ-酪蛋白富集液沉积到MALDI靶，同时滴入1uL基质溶液至试样斑；样品在空气中干燥后，用MALDI-TOF-MS分析得到经固相萃取小柱富集后的β-酪蛋白的质谱图，如附图4所示；
(5)取1uLβ-酪蛋白原消化样品液沉积到MALDI靶，同时滴入1uL基质溶液至试样斑；样品在空气中干燥后，用MALDI-TOF-MS分析得到没有经过富集的β-酪蛋白的标准质谱图，如附图5所示。
(6)实验结束后，将固相萃取小柱用乙腈、甲醇各1mL依次洗涤，以备重复使用。
质谱测定条件如下：
采用正离子反射模式，加速电压20kV，平均200个激光点产生一个波谱。样品基质为20mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液，其组成为乙腈∶1.0％的磷酸水溶液＝4∶1。1μL样品点在样品台上，随后基质溶液1μL点样，当样品点空气中风干后开始分析。
结果表明对于上述磷酸化蛋白的富集加标回收率均能达到92％-105％，解吸过程简单，乙腈就可将上述物质洗脱下来，实验结束后，将固相萃取小柱用乙腈、甲醇各1mL依次洗涤，无需其他操作，即可重复使用。
以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。
Claims (3)
1.一种介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱，其特征在于所述的固相萃取柱的基质为功能化的介孔SiO2/TiO2复合纳米微球，介孔SiO2纳米微球直径为50～150nm，平均孔径为4～5nm，介孔SiO2纳米微球表面附着TiO2纳米球，TiO2纳米球直径为3～5nm；固相萃取柱空管容积为100μL～1mL，填装高度为0.2～0.5cm，空管材质为聚烯烃。
2.一种制备权利要求1所述的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的方法，其特征在于由原始介孔SiO2纳米微球及TiO2纳米球分别经胺基化、羧基化共价化学修饰所得，共价化学修饰按以下步骤进行：
(1)介孔SiO2纳米微球表面胺基化：在无水乙醇溶剂中加入介孔SiO2纳米微球和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，介孔SiO2纳米微球与APS的质量比为2∶1～1∶5，介孔SiO2纳米微球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于50～90℃条件下反应5～24小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的胺基化的介孔SiO2纳米微球；
(2)TiO2纳米球表面羧基化：在二氯甲烷溶剂中加入制备得到的TiO2纳米球及3-巯基丙酸(MPA)，TiO2纳米球和MPA的质量比为20∶1～4∶1，TiO2纳米球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10～40℃条件下反应0.5～2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的羧基化的TiO2纳米球。
(3)功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的制备：在水溶液中加入制备得到的介孔SiO2纳米微球和TiO2纳米球以及交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰亚胺(NHS)，SiO2/TiO2质量比为4∶1～3∶1，SiO2与EDC、NHS质量比为(20～5)∶1∶1，介孔SiO2纳米球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10～40℃条件下反应0.5～2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球。
3.如权利要求1所述的一种功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱，其特征在于制备方法为：
(1)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5～20μm；
(2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球干法填装入柱内；
(3)在填装的功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球上放入另一片多孔性聚乙烯上筛板，聚乙烯筛板孔径为5～20μm，压紧填料使填装柱高度保持在0.2～0.5cm，制备得到固相萃取小柱。
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