一种磷酸化肽段富集装置及其富集方法
技术领域
本发明属于生物领域,更具体地,涉及一种磷酸化肽段富集装置及其富集方法。
背景技术
蛋白质磷酸化翻译后修饰在生命体中具有重要的意义,蛋白质的磷酸化可以改变蛋白质催化基团的性质、改变蛋白质的构象、改变蛋白质在细胞内的定位等,它是细胞内已知的最快速普遍的信号转导方式。蛋白质的磷酸化和去磷酸化几乎调控着生命体内所有的生命过程,包括细胞的增值、发育、分化和凋亡、生命体的新陈代谢、神经活动、肌肉运动等等。磷酸化蛋白质的研究需要对磷酸化的多肽分子进行富集,常规的富集实验是将富集微珠和样本溶液、清洗溶液、置换溶液、洗脱溶液等在EP管中进行混合震荡孵育、离心后利用移液枪手动将上清液体和微珠进行分离,由于微珠颗粒小、质量轻,手动的分离往往不是带走了部分微珠造成样本的损失,就是剩余太多清洗溶液,导致非磷酸化多肽的残留,使富集效率下降。
中国专利文件CN209226886U提供的辅助装置是利用一种新型的过滤装置来分离微珠颗粒和多种溶液。该装置中以玻璃棉作为过滤支撑基底材料,通过夹紧吸头尖端固定玻璃棉,因此装置难以大规模生产,装置制作过程中人为操作造成的差异性较大,难以保证不同批次装置的一致性。同时应用该装置的磷酸化富集方法,只能在重力作用下的自然流动或注射器缓慢加压作为清洗和洗脱方法,耗时较久,且不同样品耗时差异大,难以保证操作一致性,不利于大批量样本的高效处理。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种磷酸化富集装置及其富集方法,其目的在于高效高速高自动化的富集磷酸化肽段,由此解决以往磷酸化富集方法中耗时久、一致性差的技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种磷酸化肽段富集装置,其包括可拆卸配合的分离柱、以及收集管;
所述分离柱,包括两端开口的套管,所述套管由上至下具加样部、反相色谱填料部、和滤液排出部;所述反相色谱填料部有用于固相萃取的反相色谱填料;
所述收集管,为与离心机配合的容器,其上端开口于所述分离柱配合,侧方具有开孔,用于平衡内外气压;
工作时,所述分离柱通过所述收集管的上端开口与其可拆卸的固定,所述分离柱的下端开口处于所述收集管中央;含有磷酸化肽段的样品与具有磷酸化肽段亲和性的固体颗粒的混合物、清洗液、或洗脱液,经所述分离柱的上端开口加入到加样部,在离心过程中经反相色谱填料部固液分离后,滤液由滤液排出部下端开口进入到收集管内被收集。
优选地,所述磷酸化肽段富集装置,其所述反相色谱填料部处于所述分离柱出口3mm至8mm处。
优选地,所述磷酸化肽段富集装置,其所述反相色谱填料为反相色谱填料C4、C8或C18,优选为C18反相色谱填料;所述加样部与所述反相色谱填料部的容积比在20:1-100:1之间。
优选地,所述磷酸化肽段富集装置,其所述分离柱套管滤液排出部具有缢缩。
按照本发明的另一个方面,提供了一种磷酸化肽段富集方法,其应用本发明提供的磷酸化肽段富集装置,包括以下富集、清洗、和洗脱步骤:
所述富集步骤具体为:将含有磷酸化肽段的样品与具有磷酸化肽段亲和性的固体颗粒的混合物震荡孵育后加入到所述的磷酸化肽段富集装置的分离柱加样部,并将所述装置置于离心机中离心,利用离心力使得所述混合物固液分离,其滤液被收集管收集;
所述清洗步骤具体为:将清洗液加入到盛装待清洗的吸附有磷酸化肽段的固体颗粒的磷酸化肽段富集装置的分离柱加样部,并将所述装置置于离心机中离心,利用离心力使得所述清洗液流经所述吸附有磷酸化肽段的固体颗粒,形成废液被收集管收集;
所述洗脱步骤具体为:将洗脱液加入到盛装清洗后的吸附有磷酸化肽段的固体颗粒的磷酸化肽段富集装置的分离柱加样部,并将所述装置置于离心机中离心,利用离心力使得所述洗脱液流经所述吸附有磷酸化肽段的固体颗粒并洗脱所述磷酸化肽段,形成富集有磷酸化肽段的样品。
优选地,所述磷酸化肽段的富集方法,其所述富集、清洗、以及洗脱步骤多次重复进行,当需要收集或弃去滤液时,更换收集管。
优选地,所述磷酸化肽段的富集方法,其所述具有磷酸化肽段亲和性的固体颗粒为氮三乙酸根合铁络合物微珠。
优选地,所述磷酸化肽段的富集方法,其所述富集步骤:500-2000g离心1-5分钟。
优选地,所述磷酸化肽段的富集方法,其所述清步骤:500-2000g离心1-5分钟;
清洗液为:第一清洗液、第二清洗液、或纯水;所述第一清洗液含有0.1M NaCl、5-30%乙腈、以及0.1%有机酸,优选含有0.1M NaCl、25%乙腈、以及0.1%有机酸;所述第二清洗液,含有50-80%乙腈、以及0.5-2%有机酸,优选含有60%乙腈、以及1%有机酸;所述有机酸为乙酸、甲酸或三氟乙酸。
优选地,所述磷酸化肽段的富集方法,其所述洗脱步骤:1000-2000g离心1-3分钟;
洗脱液为:第一洗脱液或第二洗脱液;所述第一洗脱液为1-10%氨水,优选为6%氨水;所述第二洗脱液为50-100%乙腈,优选为100%乙腈。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,能够取得以下有益效果:
本发明提供的磷酸化肽段富集装置,通过分离柱与收集管的组合,以离心力替代重力作为分离柱的为动力,操作时间明显缩短,且操作过程自动化程度搞,其中包括填料选择、填料体积、离心参数等影响因素可控,从而在缩短操作时间的同时减小了实验误差,提高了富集效果的一致性,结果重复性好。
本发明提供的磷酸化肽段富集方法,优化了缓冲试剂和实验装置,从而缩短实验时间、简化实验步骤,提高了自动化程度,结果一致性好。
附图说明
图1是本发明提供的磷酸化肽段的富集装置结构图。
图2是本发明提供的磷酸化肽段的富集方法流程图。
图1和图2中,相同的附图标记用来表示相同的元件或结构,其中:1为分离柱,2为收集管,3为反相色谱填料,4为开孔,5为具有磷酸化肽段亲和性的固体颗粒。
图3是实施例2磷酸化肽段鉴定结果。
图4是实施例3磷酸化肽段鉴定结果。
图3和图4中,上图为各样品中鉴定到的磷酸化肽段分布韦恩图,下图为各样品中各磷酸化肽段信号强度相关性分析图。
图5是实施例4肽段鉴定结果。
图6是实施例5肽段鉴定结果。
图5和图6中,各系列分别展示各样品中鉴定到的总肽段数、磷酸化肽段数及磷酸化肽段富集效率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的磷酸化肽段富集装置,包括可拆卸组合的分离柱、以及收集管。
所述分离柱,包括两端开口的套管,所述套管由上至下具加样部、反相色谱填料部、和滤液排出部;所述反相色谱填料部有用于固相萃取的反相色谱填料;所述反相色谱填料部处于所述分离柱出口3mm至8mm处,所述反相色谱填料为反相色谱填料C4、C8或C18,优选为C18反相色谱填料;所述加样部与所述反相色谱填料部的容积比在20:1-100:1之间,以配合磷酸化肽段富集的料液比。所述分离柱套管滤液排出部具有缢缩,帮助固定反向色谱填料。
所述收集管,为与离心机配合的容器,其上端开口于所述分离柱配合,侧方具有开孔,用于平衡内外气压,以便液体在离心力作用下从分离柱中排除至收集管。
工作时,所述分离柱通过所述收集管的上端开口与其可拆卸的固定,所述分离柱的下端开口处于所述收集管中央;含有磷酸化肽段的样品与具有磷酸化肽段亲和性的固体颗粒的混合物、清洗液、或洗脱液,经所述分离柱的上端开口加入到加样部,在离心过程中经反相色谱填料部固液分离后,滤液由滤液排出部下端开口进入到收集管内被收集。
本发明提供的磷酸化肽段富集装置,由于采用反相色谱填料以特定的体积填充在可标准化制备的分离柱反相色谱填料柱中,因此相比目前的富集装置具有一致性高的优点。该装置由于采用了收集管和色谱柱嵌套的结构,可以利用离心机等设备,快速进行固液分离,节省实验时间,大幅提高效率。同时收集管和分离柱的可拆卸配合,完美配合磷酸化肽段富集的全流程各个阶段,无需进行多次容器转换、清洗,只需要更换收集管即可快速弃去或收集液体。
本发明提供的磷酸化肽段富集方法,包括以下富集、清洗、和洗脱步骤:
所述富集步骤具体为:将含有磷酸化肽段的样品与具有磷酸化肽段亲和性的固体颗粒的混合物震荡孵育后加入到所述的磷酸化肽段富集装置的分离柱加样部,并将所述装置置于离心机中离心,利用离心力使得所述混合物固液分离,其滤液被收集管收集;所述具有磷酸化肽段亲和性的固体颗粒为氮三乙酸根合铁络合物(Fe-NTA)微珠。所述富集步骤:500-2000g离心1-5分钟。转速过低、离心时间过短,可能导致固液分离不完全;转速过高、离心时间过长,可能导致肽段过早洗脱,可能降低磷酸化肽段富集效率。
所述清洗步骤具体为:将清洗液加入到盛装待清洗的吸附有磷酸化肽段的固体颗粒的磷酸化肽段富集装置的分离柱加样部,并将所述装置置于离心机中离心,利用离心力使得所述清洗液流经所述吸附有磷酸化肽段的固体颗粒,形成废液被收集管收集;清洗液为:第一清洗液、第二清洗液、或纯水;所述第一清洗液含有0.1M NaCl、5-30%乙腈、以及0.1%有机酸,优选含有0.1M NaCl、25%乙腈、以及0.1%有机酸;所述第二清洗液,含有50-80%乙腈、以及0.5-2%有机酸,优选含有60%乙腈、以及1%有机酸;所述有机酸为乙酸、甲酸或三氟乙酸;500-2000g离心1-5分钟。
所述洗脱步骤具体为:将洗脱液加入到盛装清洗后的吸附有磷酸化肽段的固体颗粒的磷酸化肽段富集装置的分离柱加样部,并将所述装置置于离心机中离心,利用离心力使得所述洗脱液流经所述吸附有磷酸化肽段的固体颗粒并洗脱所述磷酸化肽段,形成富集有磷酸化肽段的样品。洗脱液为:第一洗脱液或第二洗脱液;所述第一洗脱液为1-10%氨水,优选为6%氨水;所述第二洗脱液为50-100%乙腈,优选为100%乙腈;1000-2000g离心1-3分钟。洗脱步骤中离心转速可略高于富集及清洗步骤,以保证肽段完全洗脱。
所述富集、清洗、以及洗脱步骤多次重复进行,当需要收集或弃去滤液时,更换收集管。
以下为实施例:
实施例1:
一种磷酸化肽段富集装置,如图1所示,包括分离柱、收集管;
所述分离柱,包括两端开口的细长锥形套管,其总长度5cm,加样部长度4.2cm,反相色谱填料部长3mm,滤液排出部长3mm;所述加样部与所述反相色谱填料部的容积比为:80:1。所述加样部开口直径为6mm,所述反相色谱填料部装有C18填料2mm3,滤液排出部向出口缢缩,出口直径0.5mm。
所述收集管,为与离心机配合的容器,直径1cm、长度4cm,其上端开口具有密封盖,具有与所述分离柱配合的通孔,用于将分离柱下端2cm部分固定在所述收集管中央;所述收集管其侧方离上部距密封盖3mm处,具有开孔,用于平衡内外气压,以便于液体在离心力作用下从分离柱中排出至收集管。
工作时,所述分离柱通过所述收集管的上端开口与其可拆卸的固定,所述分离柱的下端开口处于所述收集管中央;含有磷酸化肽段的样品与具有磷酸化肽段亲和性的固体颗粒的混合物、清洗液、或洗脱液,经所述分离柱的上端开口加入到加样部,在离心过程中经反相色谱填料部固液分离后,滤液由滤液排出部下端开口进入到收集管内被收集。
本发明提供的磷酸化肽段富集方法,流程如图2所示,具体实施例如下:以下实施例中均使用源自HeLa细胞的蛋白酶解冻干肽段作为起始材料,磷酸化富集后的肽段均使用Sciex公司的TripleTOF 5600+液质联用系统进行检测。
实施例2:
采用实施例1所述的富集装置,反向色谱填料选择C4填料。通过以下步骤,分别对3份600μg肽段样品进行磷酸化肽段富集,具体包括1次富集步骤、6次清洗步骤、以及5次洗脱步骤。
1.预处理:以50μL第二清洗液溶解样品肽段;取5μL Fe-NTA微珠材料,于富集反应管中混合肽段溶液,室温条件下(20-25℃)转速1500rpm剧烈震荡1小时;
2.富集:将预处理获得的混合物转移混合液至实施例1提供的磷酸化肽段分析装置分离柱的加样部,直接置于离心机500g离心5分钟,废液进入收集管;
3.第一、第二次清洗:向分离柱加样部加入50μL第一清洗液,直接置于离心机500g离心5分钟,重复2次,废液进入收集管;第一清洗液的成分为:0.1MNaCl/25%乙腈/0.1%乙酸;
4.第三、第四次清洗:向分离柱加样部加入50μL第二清洗液,直接置于离心机500g离心5分钟,重复2次,废液进入收集管;第二清洗液的成分为:60%乙腈/1%乙酸;
5.第五、第六次清洗:向分离柱加样部加入50μL纯水,直接置于离心机500g离心5分钟,重复2次,废液进入收集管;
6.第一、第二次洗脱:更换所述磷酸化肽段富集的收集管,旧管抛弃,向分离柱加样部加入60μL第一洗脱液,1000g离心3分钟,收集滤液至收集管,重复2次;所述第一洗脱液为质量浓度在6%的氨水;
7.第三、第四、第五次洗脱:向分离柱加样部加入20μL第二洗脱液,1000g离心3分钟,收集滤液至收集管,本步骤重复3次,收集滤液至收集管;所述第二洗脱液为100%乙腈;
8、将收集管中获得的合并滤液,浓缩干燥,保存待质谱检测。
各样品肽段鉴定结果统计如下表所示。
样品编号 |
总肽段数 |
磷酸化肽段数 |
富集效率 |
Rep1 |
6670 |
6142 |
92.08% |
Rep2 |
6154 |
5715 |
92.87% |
Rep3 |
5673 |
5452 |
96.10% |
3次重复实验样品鉴定结果如附图3所示。各样品中81.14%-82.25%的磷酸化肽段能在其他重复样品中鉴定到;不同样品间磷酸化肽段信号强度相关系数高达0.842-0.852,表明该方法富集和检测到的磷酸化肽段具有良好的重复性。
实施例3:
本实施例分别对3份600μg肽段样品进行磷酸化肽段富集,具体包括1次富集步骤、6次清洗步骤、以及5次洗脱步骤。采用的装置与实施例2类似,区别仅在于,反向色谱填料选择C8填料;其步骤与实施例2类似,区别仅在于,富集、清洗和洗脱步骤采用2000g离心1分钟。
各样品肽段鉴定结果统计如下表所示。
样品编号 |
总肽段数 |
磷酸化肽段数 |
富集效率 |
Rep1 |
6489 |
6036 |
93.02% |
Rep2 |
5783 |
5390 |
93.20% |
Rep3 |
6315 |
5705 |
90.34% |
3次重复实验样品鉴定结果如附图4所示。各样品中73.81%-75.91%的磷酸化肽段能在其他重复样品中鉴定到;不同样品间磷酸化肽段信号强度相关系数高达0.868-0.880,表明该方法富集和检测到的磷酸化肽段具有良好的重复性。
实施例4:
本实施例分别对100μg,200μg,400μg,600μg和1000μg肽段样品进行磷酸化肽段富集,每类样品进行两次重复,共十份。具体步骤包括1次富集步骤、6次清洗步骤、以及5次洗脱步骤。采用的装置与实施例2类似,区别仅在于,反向色谱填料选择C18填料;其步骤与实施例2类似,区别仅在于,富集、清洗步骤采用1000g离心3分钟,洗脱步骤采用1500g离心2分钟。
各样品质谱检测结果统计如附图5所示。在本发明提供的磷酸化肽段富集与脱盐方法中,5μL Fe-NTA材料即可对100μg-1000μg肽段样品进行高效率的磷酸化富集,各样品磷酸化肽段富集效率均高于93%,对于400μg以上肽段样品,富集效率均高于97%。同时,该范围内,样品起始量越高,最终富集后鉴定到的磷酸化肽段数目越多。
实施例5:
本实施例分别对8份500μg肽段样品进行磷酸化肽段富集。具体步骤包括1次富集步骤、6次清洗步骤、以及5次洗脱步骤。采用的装置与实施例4相同,其步骤与实施例4类似,区别仅在于,预处理步骤分别取5μL,10μL,15μL,20μL Fe-NTA微珠材料与肽段溶液混合,每组实验进行2次重复。
各样品质谱检测结果统计如附图6所示。在本发明提供的磷酸化肽段富集与脱盐方法中,5-20μL Fe-NTA材料均可对500μg肽段样品进行高效率的磷酸化富集,各样品磷酸化肽段富集效率均高于96%。各样品磷酸化富集和脱盐后质谱检测鉴定到的磷酸化肽段数量无显著区别,表明5μL Fe-NTA材料磷酸化肽段富集荷载量足以满足对500μg起始肽段样品的磷酸化肽段富集处理。
本实施例2至实施例5的整体操作过程在2小时之内完成,相较于现有技术需要8小时,缩短了75%。本发明的操作过程中,由于每次富集、清洗以及洗脱的步骤十分简单迅速,因此可应用塔板原理,少量多次的重复各步骤,从而取得更佳的富集、清洗、以及洗脱的效果。同时还具有试剂消耗量小、挥发少、耗材重复利用率高的优点,节约时间成本和试剂耗材的成本。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。