CN117554630B - 一种酪氨酸磷酸化肽段的富集方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酪氨酸磷酸化肽段的富集方法及其应用。所述方法包括：将含酪氨酸磷酸化肽段的样品与偶联有SH2超亲体的固相在容器中混合，所述容器的底部以聚醚砜膜作为支撑筛板；清洗所述固相，从所述固相上分离所述酪氨酸磷酸化肽段。本发明设计全新的高特异性的酪氨酸磷酸化富集方法，尤其针对微量样本，采用聚醚砜膜作为筛板，能够减少非特异肽段的吸附，并能减少外源污染，有利于酪氨酸磷酸化多肽高特异性和高灵敏度的鉴定，并能进一步和特定的清洗液、洗脱液协同配合，进一步提高检测特异性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学技术领域，涉及一种酪氨酸磷酸化肽段富集方法及其应用。
背景技术
蛋白质磷酸化几乎调节着生命活动的各个过程，包括细胞的增殖、发育和分化、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢和肿瘤发生等。最常见的磷酸化类型是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)磷酸化，其中酪氨酸磷酸化处在信号调控的上游，在细胞的生长、增殖、分化、新陈代谢等生命活动过程中起到启动者的角色。肿瘤的发生、发展和转移与酪氨酸磷酸化功能异常关系密切。对于蛋白质酪氨酸磷酸化层次上的检测逐渐受到人们重视。
进行蛋白质磷酸化检测前需对磷酸化肽段富集，传统的磷酸化肽段富集方法包括Western Blot，固定金属离子亲和色谱，金属氧化物亲和色谱，以及免疫共沉淀方法等。Western Blot制备特异性磷酸化抗体较难，而且对于可鉴定的特异性位点的个数有很大的限制，除此之外，鉴定结果会受样品处理过程以及在凝胶电泳中上样的误差影响。固定金属离子亲和色谱等方法的分离柱效较低，在处理前需对样本进行脱盐，进一步加重了损失，导致鉴定数目降低，通量也有限。免疫共沉淀方法专用特异性抗体较昂贵，只能鉴定已知磷酸化蛋白，而且对于低丰度的磷酸化蛋白结果不好。基于SH2超亲体(SH2-superbinder)的磷酸化蛋白质组学技术是通过对SH2结构域进行选择性突变，导致对磷酸化酪氨酸的捕获力提升1000倍，并且具有特异性。但是以往提出的基于SH2-superbinder的酪氨酸磷酸化富集方法结果重现性以及富集效率并不理想。
此外，在临床实践中，大部分样本较难获取，样本量小，比如常见的病理穿刺和切片样本的量极小（<1 mg）；而现有的蛋白组学前处理方法步骤繁琐，容易造成样本损失，其中磷酸化肽段尤其是酪氨酸磷酸化肽段本身含量较少，对富集体系的回收率要求更高，这使得用常规方法对珍贵临床样本进行分析较为困难。
综上所述，开发新型的酪氨酸磷酸化肽段富集方法，能够实现高效、高特异性富集，尤其针对微量样本，对于蛋白质磷酸化检测领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种酪氨酸磷酸化肽段的富集方法及其应用，以期减少样本前处理过程中的损失，高效富集酪氨酸磷酸化肽段，进行高特异性、灵敏度检测。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种酪氨酸磷酸化肽段的富集方法，所述方法包括：
将含酪氨酸磷酸化肽段的样品与偶联有SH2超亲体的固相在容器中混合，所述容器的底部以聚醚砜膜作为支撑筛板；清洗所述固相，从所述固相上分离所述酪氨酸磷酸化肽段。
本发明中，为减少样本前处理过程中的损失，设计全新的酪氨酸磷酸化肽段的富集方法，采用聚醚砜膜作为筛板，能够减少非特异肽段的吸附，并能减少外源污染，有利于酪氨酸磷酸化多肽高特异性和高灵敏度的鉴定，并能进一步和特定的清洗液、洗脱液协同配合，进一步提高检测特异性和灵敏度，可实现微量样本（如10~50 μg初始蛋白）的酪氨酸磷酸化组学高特异形、高灵敏形分析。
可以理解，本发明中，所述“SH2超亲体”亦称之为“SH2-superbinder”或“SH2超结合体”，现有技术中已知的SH2-superbinder均可以用于本发明。
可以理解，本发明中所述容器指代底部以聚醚砜膜作为支撑筛板，能够实现承载样品、偶联有SH2超亲体的固相等，且允许清洗液和洗脱液等通过聚醚砜膜的任意容器，本领域技术人员知晓如何选择具体的容器，如使用移液器吸头等。
优选地，所述清洗使用的清洗液包括：高盐清洗液、低盐清洗液和水；所述高盐清洗液含有40~60 mM三羟甲基氨基甲烷（例如可以是42 mM、44 mM、46 mM、48 mM、50 mM、52mM、55 mM、56 mM、58 mM或59 mM等）和230~260 mM氯化钠（例如可以是232 mM、235 mM、238mM、240 mM、245 mM、248 mM、252 mM、255 mM、258 mM或259 mM等）；所述低盐清洗液含有40~60 mM碳酸氢铵（例如可以是42 mM、44 mM、46 mM、48 mM、50 mM、52 mM、55 mM、56 mM、58 mM或59 mM等）。
优选地，所述清洗的方法包括：依次使用所述高盐清洗液、低盐清洗液和水分别清洗1~3次。
优选地，所述清洗的方法具体包括：向所述容器中加入清洗液，进行混合，并从容器底部除去清洗液。
本发明中，针对聚醚砜膜，发现特定的清洗液能够与其协同配合，进一步提高富集效果。
优选地，所述分离使用的洗脱液包括三氟乙酸溶液。
优选地，所述三氟乙酸溶液的浓度为0.3v/v%~0.7v/v%，包括但不限于0.35v/v%、0.4v/v%、0.45v/v%、0.5v/v%、0.55v/v%、0.6v/v%、0.6v/v%或0.68v/v%等等。
本发明中，针对聚醚砜膜，发现特定的洗脱液能够与其协同配合，进一步提高富集效果。
优选地，所述分离具体包括：将所述洗脱液加入所述容器，进行混合，从容器底部收集洗脱液。
可以理解，本发明所述固相指代并且包括能够结合所述SH2超亲体的任何支持物。熟知固相包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺和磁铁矿等等。固相实际上可以具有任何结构构造，只要偶联的SH2超亲体能够结合肽和/或蛋白质。因此，固相构造可以是球形的，如珠或圆柱形等。本领域技术人员将知晓用于结合SH2超亲体的许多其它合适的固相，或将能够采用常规实验确定此类固相。
可选地，所述固相的材质包括玻璃、琼脂、琼脂糖、琼脂糖衍生物、磁珠、二氧化硅、二氧化钛、藻酸盐、纤维素或陶瓷中任意一种。
作为优选的技术方案，所述酪氨酸磷酸化肽段的富集方法包括：
将含酪氨酸磷酸化肽段的样品与偶联有SH2超亲体的固相在容器中混合，所述容器的底部以聚醚砜膜作为支撑筛板；
向所述容器中加入清洗液，进行混合，离心，从容器底部除去清洗液，将所述洗脱液加入所述容器，进行混合，离心，从容器底部收集洗脱液。
第二方面，本发明提供第一方面所述的酪氨酸磷酸化肽段的富集方法在酪氨酸磷酸化肽段检测中的应用。
第三方面，本发明提供一种酪氨酸磷酸化肽段检测方法，所述方法包括：
采用第一方面所述的酪氨酸磷酸化肽段的富集方法富集酪氨酸磷酸化肽段，鉴定富集的酪氨酸磷酸化肽段。
优选地，所述检测方法还包括对富集的酪氨酸磷酸化肽段进行定量。
优选地，所述鉴定或所述定量的方法包括质谱。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计全新的高特异性的酪氨酸磷酸化富集方法，尤其针对微量样本，采用聚醚砜膜作为筛板，能够减少非特异肽段的吸附，并能减少外源污染，有利于酪氨酸磷酸化多肽高特异性和高灵敏度的鉴定，并能进一步和特定的清洗液、洗脱液协同配合，进一步提高检测特异性和灵敏度。
附图说明
图1为实施例1中Tip柱结构示意图；
图2A为实施例1中富集pY肽段的鉴定数结果图，纵坐标为肽段数量（个）；
图2B为实施例1中富集pY肽段的富集效率结果图，纵坐标为富集效率；
图3为实施例2中不同富集方法鉴定pY肽段统计图，纵坐标为肽段数量（个）；
图4为实施例3中富集pY肽段的鉴定数结果图，纵坐标为肽段数量（个）；
图5为实施例3中富集pY肽段的富集效率结果图，纵坐标为富集效率。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例进行细胞样本的酪氨酸磷酸化组学检测。
将收集到的原钒酸钠处理K562细胞沉淀，用细胞裂解液重悬后转移到研磨管中，研磨7个循环后高速离心取上清，得到原钒酸钠-K562细胞蛋白溶液，BCA测定浓度后，分别取2、5、10、20、40和100 μg的不同蛋白量至新的小型的离心管（EP管）中，进行还原烷基化和SP3酶切，得到多肽。同时使用1.5 mm直径的空心铁制圆管，截取一层聚醚砜膜水平放入200μL的移液器吸头中，用细铁丝将膜填充到吸头底部并按压紧实，随后在吸头中加入偶联有SH2-superbinder的微球（嘉华药锐自制：蛋白表达纯化的SH2-superbinder超亲复合体与蛋白琼脂糖微球Agarose Bead耦联）制备成一体化的Tip柱（结构示意图如图1所示）。将酶切得到的多肽转移入制备好的Tip柱中，孵育1 h后，使用高盐清洗液（50mM 三羟甲基氨基甲烷，245mM 氯化钠，pH 7.5）、低盐清洗液（50 mM 碳酸氢铵）、纯水分别清洗2次，每次需确保微球（beads）重复混匀，并离心弃去清洗液。最后使用0.5 v/v%三氟乙酸（TFA）洗脱三次得到酪氨酸磷酸化肽段（pY肽段），真空浓缩为干粉状态，再用0.1 v/v% 甲酸（FA）重悬，exploris 480质谱使用40 min DDA方法采集样本，fragpipe搜库进行数据分析。鉴定结果如图2A（pY肽段鉴定数）和图2B（pY肽段鉴富集效率）所示，结果表明，使用聚醚砜膜作为筛板的Tip富集柱，能够高特异性、高灵敏度的进行细胞样本的酪氨酸磷酸化组学的鉴定。
实施例2
本实施例进行临床组织样本的酪氨酸磷酸化组学检测。
将石蜡包埋的乳腺癌FFPE组织，用脱蜡液除去组织中的石蜡后，加入组织裂解液重悬组织样本并转移入研磨管中，研磨6个循环后90℃解交联3 h，高速离心取上清，得到组织样本的蛋白溶液，BCA测定浓度后，分别取50 μg、100 μg的不同蛋白量各4份至新的EP管中，进行还原烷基化和SP3酶切，得到多肽。同时使用1.5 mm直径的空心铁制圆管，截取一层聚醚砜膜水平放入200 μL的移液器吸头中，用细铁丝将膜填充到吸头底部并按压紧实，随后在吸头中加入偶联有SH2-superbinder的微球（嘉华药锐自制：蛋白表达纯化的SH2-superbinder超亲复合体与蛋白琼脂糖微球Agarose Bead耦联），制备成一体化的Tip柱，另一边则将相同量偶联有SH2-superbinder的微球直接放入1.5 mL EP管中制备成富集EP管。将酶切得到的多肽分别转移入制备好的Tip柱和富集EP管中（2种蛋白起始富集量各2个重复），孵育1.5 h后，使用高盐清洗液（60mM 三羟甲基氨基甲烷，260mM 氯化钠，pH 8）、低盐清洗液（60 mM 碳酸氢铵）、纯水分别清洗2次，每次需确保微球（beads）重复混匀，并离心弃去清洗液。最后使用0.3v/v%三氟乙酸（TFA）洗脱三次得到酪氨酸磷酸化肽段（pY肽段），真空浓缩为干粉状态，再用0.05v/v%甲酸（FA）重悬，exploris 480质谱使用90 min DIA方法采集样本，MS2pep-DIANN搜库进行数据分析。鉴定结果如图3所示，结果表明，聚醚砜膜作为筛板的Tip富集柱，比普通富集EP管鉴定临床组织样本的酪氨酸磷酸化组学效果更好。
实施例3
本实施例利用不同筛板材料对细胞样本的酪氨酸磷酸化组学检测。
将收集到的原钒酸钠处理K562细胞沉淀，用细胞裂解液重悬后转移到研磨管中，研磨5个循环后高速离心取上清，得到原钒酸钠-K562细胞蛋白溶液，BCA测定浓度后，取200μg蛋白溶液至新的EP管中，进行还原烷基化和SP3酶切，得到多肽。同时使用1.5 mm直径的空心铁制圆管，分别截取一层C8膜、聚醚砜膜和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）水平放入200 μL的移液器吸头中，用细铁丝将膜填充到吸头底部并按压紧实，随后在吸头中偶联有SH2-superbinder的微球（嘉华药锐自制：蛋白表达纯化的SH2-superbinder超亲复合体与蛋白琼脂糖微球Agarose Bead耦联），制备成不同筛板材料的一体化的Tip柱。将酶切得到的多肽，各取10 μg转移入制备好的不同筛板材料的Tip柱中，孵育2 h后，使用高盐清洗液（40mM 三羟甲基氨基甲烷，230 mM 氯化钠，pH 7）、低盐清洗液（40 mM 碳酸氢铵）、纯水分别清洗2次，每次需确保微球（beads）重复混匀，并离心弃去清洗液。最后使用0.7v/v%三氟乙酸（TFA）洗脱三次得到酪氨酸磷酸化肽段（pY肽段），真空浓缩为干粉状态，再用0.15v/v% 甲酸（FA）重悬。每种Tip柱进行2次重复实验，C8膜Tip柱2次实验编号为C8_1和C8_2，聚醚砜膜Tip柱2次实验编号为JMF_1和JMF_2，PVDF膜Tip柱2次实验编号为PVDF_1和PVDF_2。exploris 480质谱使用40 min DDA方法采集样本，fragpipe搜库进行数据分析。鉴定结果如图4（pY肽段鉴定数）和图5（pY肽段鉴富集效率）所示，结果表明，在同样微量多肽的起始富集量条件下，聚醚砜膜做为筛板的Tip柱富集到的酪氨酸磷酸化肽段（pY肽段），其鉴定灵敏度和富集特异性都优于C8膜和PVDF膜作为筛板的Tip柱，且具备良好的结果稳定性、重现性。
综上所述，本发明设计全新的高特异性的酪氨酸磷酸化富集方法，尤其针对微量样本，采用聚醚砜膜作为筛板，能够减少非特异肽段的吸附，并能减少外源污染，有利于酪氨酸磷酸化多肽高特异性和高灵敏度的鉴定，并能进一步和特定的清洗液、洗脱液协同配合，进一步提高检测特异性和灵敏度。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (7)
1.一种酪氨酸磷酸化肽段的富集方法，其特征在于，所述方法包括：
将含酪氨酸磷酸化肽段的样品与偶联有SH2超亲体的固相在容器中混合，所述容器的底部以聚醚砜膜作为支撑筛板；
清洗所述固相，从所述固相上分离所述酪氨酸磷酸化肽段；
所述清洗使用的清洗液包括高盐清洗液、低盐清洗液和水；所述高盐清洗液含有40~60mM三羟甲基氨基甲烷和230~260 mM 氯化钠；所述低盐清洗液含有40~60 mM 碳酸氢铵；
所述清洗的方法包括：依次使用所述高盐清洗液、低盐清洗液和水分别清洗1~3次；
所述分离使用的洗脱液包括三氟乙酸溶液；
所述三氟乙酸溶液的浓度为0.3v/v%~0.7v/v%。
2.根据权利要求1所述的酪氨酸磷酸化肽段的富集方法，其特征在于，所述清洗的方法具体包括：向所述容器中加入清洗液，进行混合，并从容器底部除去清洗液。
3.根据权利要求1所述的酪氨酸磷酸化肽段的富集方法，其特征在于，所述分离具体包括：将所述洗脱液加入所述容器，进行混合，从容器底部收集洗脱液。
4.根据权利要求1所述的酪氨酸磷酸化肽段的富集方法，其特征在于，所述固相的材质包括玻璃、琼脂、琼脂糖、琼脂糖衍生物、磁珠、二氧化硅、二氧化钛、藻酸盐、纤维素或陶瓷中任意一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的酪氨酸磷酸化肽段的富集方法，其特征在于，所述方法包括：
将含酪氨酸磷酸化肽段的样品与偶联有SH2超亲体的固相在容器中混合，所述容器的底部以聚醚砜膜作为支撑筛板；
向所述容器中加入清洗液，进行混合，离心，从容器底部除去清洗液，将所述洗脱液加入所述容器，进行混合，离心，从容器底部收集洗脱液。
6.权利要求1-5任一项所述的酪氨酸磷酸化肽段的富集方法在酪氨酸磷酸化肽段检测中的应用。
7.一种酪氨酸磷酸化肽段检测方法，其特征在于，所述方法包括：
采用权利要求1-5任一项所述的酪氨酸磷酸化肽段的富集方法富集酪氨酸磷酸化肽段，鉴定富集的酪氨酸磷酸化肽段。
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