CN115124612A - 一种从天然样本中分离纯化IFN-γ的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从天然样本中分离纯化IFN‑γ的方法，包括提供人IFN‑γ亲和纯化层析柱，使待纯化样本过所述人IFN‑γ亲和纯化层析柱，然后用洗脱液进行洗脱，即制备得到目标IFN‑γ；其中，所述人IFN‑γ亲和纯化层析柱吸附有抗人IFN‑γ抗体。本发明提供的方法可以天然的细胞培养液为分离样本，从而获得天然人IFN‑γ，且可以保持IFN‑γ蛋白的天然结构及其生物活性，该方法相比传统的多步纯化工艺省时且不改变蛋白活性，并且具有操作简单、稳定性高、目标产物纯度高等优点，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质纯化技术领域，具体涉及一种从天然样本分离纯化IFN-γ的方法。
背景技术
γ-干扰素，又称IFN-γ或Ⅱ型干扰素，是21-24KDa的亚基构成的同二聚体，主要由活化的T细胞产生。干扰素是一种高效的抗病毒生物活性物质，也是一种具有广泛免疫调节作用的淋巴因子。许多文献证实IFN-γ可作为多种病理情况下的标志物，对于某些疾病的检测具有重要的意义。
IFN-γ可作为结核病诊断的依据，目前结核辅助诊断手段中，通过酶联免疫反应检测感染者体内被结核杆菌抗原致敏的效应T细胞在体外受到相同抗原的刺激后大量分泌γ-干扰素及IL-2细胞因子来判断结核感染情况。
为了检测结核感染特异性标志物IFN-γ，需制备相应抗体，目前在抗体制备中用于动物免疫的IFN-γ蛋白多通过原核或真核表达得到。其中，原核表达蛋白与天然样本结构差异较大，因此用原核表达的IFN-γ进行动物免疫，其效果远不及天然的IFN-γ的免疫效果，从而使抗人IFN-γ单克隆抗体制备时动物免疫效果不理想，以及给后期细胞株的筛选带来一定的困扰；而真核表达蛋白量低甚至不表达。
本领域技术人员希望开发新的方法，以获取可用于动物免疫、且具有良好免疫效果的人IFN-γ蛋白，以解决现有技术中面临的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从天然样本分离纯化IFN-γ的方法，该方法的分离对象可为天然样本，从而可获得天然人IFN-γ，将其用于动物免疫，可获得良好免疫效果。该方法具有操作简单、稳定性高的优点，具有良好的应用前景。
为此，本发明提供了一种分离纯化IFN-γ的方法，包括提供人IFN-γ亲和纯化层析柱，使待纯化样本过所述人IFN-γ亲和纯化层析柱，然后用洗脱液进行洗脱，即制备得到目标IFN-γ；其中，所述人IFN-γ亲和纯化层析柱吸附有抗人IFN-γ抗体。
进一步，所述人IFN-γ亲和纯化层析柱为吸附有抗人IFN-γ抗体的Protein G琼脂糖凝胶柱。
在一些实施方式中，将抗人IFN-γ抗体用pH8.0-8.5的PBS缓冲液稀释并过Protein G琼脂糖凝胶柱，置于4-6℃过夜后，用pH7.2-7.4的PBS缓冲液冲洗该Protein G琼脂糖凝胶柱，即制备得到人IFN-γ亲和层析柱。
进一步，所述待纯化样本为含有人IFN-γ的细胞培养液上清液。
在一些实施方式中，所述含有人IFN-γ的细胞培养液上清液的制备方法包括：在植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)刺激条件下培养人外周血单个核细胞(PBMCs)，收集培养上清液，即为含有人IFN-γ的细胞培养液上清液。
进一步，所述待纯化样本在过所述人IFN-γ亲和纯化层析柱之前，经过以下预处理：对所述待纯化样本进行过滤和/或浓缩。
进一步，所述过滤包括第一过滤和第二过滤；所述第一过滤包括用10-30kD的超滤膜进行过滤，例如采用10kD、15kD、20kD、25kD、30kD等的超滤膜；所述第二过滤包括用0.22-0.45pm的滤膜进行过滤，例如采用0.22pm、0.45pm等的滤膜。
进一步，所述浓缩的倍数为10-15倍，例如10倍、12倍、15倍等。
进一步，所述洗脱液包括Triton-X、十二烷基硫酸钠和3-[(3-胆烷酰胺丙基)-二甲铵]丙磺酸(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]propanesulfonic acid)。
进一步，所述洗脱液按照以下方式配制得到：按照体积百分比浓度分别配制0.3％Triton-X，1.5％十二烷基硫酸钠和1.5％3-[(3-胆烷酰胺丙基)-二甲铵]丙磺酸水溶液；然后将所述三种溶液按体积比1:1:1混合均匀，即制备得到所述洗脱液。
在一些实施方式中，所述分离纯化IFN-γ的方法包括以下步骤：
S1、使Protein G琼脂糖凝胶柱吸附抗人IFN-γ抗体，制备得到人IFN-γ亲和纯化层析柱：
S2、对待纯化样本进行以下预处理：对所述待纯化样本进行过滤和/或浓缩；
S3、使经过步骤S2预处理的待纯化样本过步骤S1制备得到的人IFN-γ亲和纯化层析柱；冲洗除去杂蛋白，然后用洗脱液进行洗脱，即制备得到目标IFN-γ。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优势：
(1)本发明提供的分离纯化方法可以天然的细胞培养液为分离样本，从而获得天然人IFN-γ，且可以保持IFN-γ蛋白的天然结构及其生物活性，该方法相比传统的多步纯化工艺省时且不改变蛋白活性。将其用于动物免疫可有效避免现有技术中原核细胞来源的IFN-γ所带来的免疫效果不佳的问题。
(2)本发明提供的分离纯化方法所采用的设备、试剂均为本领域技术人员熟悉且容易获取的，并且具有操作简单、稳定性高、目标产物纯度高等优点，具有良好的应用前景。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1：根据本发明提供的分离纯化方法得到的洗脱液的蛋白质层析图谱；
图2：根据本发明提供的分离纯化方法，各步骤所得产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；
其中，泳道1为第一次洗脱后收集的洗脱液；泳道2为第二次洗脱后收集的洗脱液；泳道3为步骤(2)制备得到的浓缩细胞培养上清液；泳道4为步骤(5)用PBS洗杂得到的溶液。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
以下具体实施方式中的实验方法和试剂，如无特别说明，均采用本领域常规技术和试剂。
实施例1
本实施例先收集天然样本细胞培养上清液，然后从中进行IFN-γ的分离纯化，具体步骤如下：
(1)细胞培养：用淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞PBMCs，按2.5×106个/ml的浓度接种于U型细胞培养板中，100μl/孔，并加入50μl PHA进行刺激20h；
(2)细胞培养上清液超滤：收集步骤(1)得到的细胞培养上清液，用20kD的超滤膜，将上清液超滤浓缩约10倍，0.22pm滤膜过滤除去不溶性微粒，即制备得到浓缩细胞培养上清液；
(3)IFN-γ蛋白洗脱液的配制：IFN-γ蛋白洗脱缓冲液按中国专利CN201010159454.5配制：先按体积百分比浓度分别配制0.3％Triton-X，1.5％十二烷基硫酸钠和1.5％3-[(3-胆烷酰胺丙基)-二甲铵]丙磺酸水溶液；然后将上述三种溶液按体积比1:1:1混合均匀，即制备得到IFN-γ蛋白洗脱液；
(4)人IFN-γ亲和层析柱的制备：将BioLegend抗人IFN-γ单克隆抗体用pH8.0的PBS缓冲液稀释并混于protein G柱，置于4℃过夜后，用pH7.4的PBS缓冲液冲洗该proteinG柱，即制备得到人IFN-γ亲和层析柱；
(5)亲和吸附：将步骤(2)制备得到的浓缩细胞培养上清液过步骤(4)制备得到的人IFN-γ亲和层析柱；用pH7.4的PBS缓冲液多次冲洗该人IFN-γ亲和层析柱进行洗杂；
(6)洗脱：采用步骤(3)制备得到的IFN-γ蛋白洗脱液进行洗脱，即收集得到人IFN-γ。
本实施例洗脱液的蛋白质层析图谱如图1所示。
对收集得到的人IFN-γ进行纯度检测：洗脱后的蛋白悬液pH调至7，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色后观察蛋白条带，结果如图2所示；其中，泳道1为第一次洗脱后收集的洗脱液，其蛋白质大小符合人IFN-γ；泳道2为第二次洗脱后收集的洗脱液，其蛋白质大小符合人IFN-γ；泳道3为步骤(2)制备得到的浓缩细胞培养上清液；泳道4为步骤(5)用PBS洗杂得到的溶液。
IFN-γ活性检测：采用ELISA检测纯化前后样本中的IFN-γ蛋白与抗体的结合活性，结果如表1所示。
表1实施例1纯化前后样本中的IFN-γ的ELISA检测结果
实施例2
本实施例先收集天然样本细胞培养上清液，然后从中进行IFN-γ的分离纯化，具体步骤如下：
(1)细胞培养：用淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞PBMCs，按2.5×106个/ml的浓度接种于U型细胞培养板中，100μl/孔，并加入50μl PHA进行刺激16h；
(2)细胞培养上清液超滤：收集步骤(1)得到的细胞培养上清液，用10kD的超滤膜，将上清液超滤浓缩约15倍，0.22pm滤膜过滤除去不溶性微粒，即制备得到浓缩细胞培养上清液；
(3)IFN-γ蛋白洗脱液的配制：IFN-γ蛋白洗脱缓冲液按中国专利CN201010159454.5配制：先按体积百分比浓度分别配制0.3％Triton-X，1.5％十二烷基硫酸钠和1.5％3-[(3-胆烷酰胺丙基)-二甲铵]丙磺酸水溶液；然后将上述三种溶液按体积比1:1:1混合均匀，即制备得到IFN-γ蛋白洗脱液；
(4)人IFN-γ亲和层析柱的制备：将BioLegend抗人IFN-γ单克隆抗体用pH8.2的PBS缓冲液稀释并混于protein G柱，置于4℃过夜后，用pH7.5的PBS缓冲液冲洗该proteinG柱，即制备得到人IFN-γ亲和层析柱；
(5)亲和吸附：将步骤(2)制备得到的浓缩细胞培养上清液过步骤(4)制备得到的人IFN-γ亲和层析柱；用pH7.4的PBS缓冲液多次冲洗该人IFN-γ亲和层析柱进行洗杂；
(6)洗脱：采用步骤(3)制备得到的IFN-γ蛋白洗脱液进行洗脱，即收集得到人IFN-γ。
IFN-γ活性检测：采用ELISA检测纯化前后样本中的IFN-γ蛋白与抗体的结合活性，结果如表2所示。
表2实施例2纯化前后样本中的IFN-γ的ELISA检测结果
实施例3
本实施例先收集天然样本细胞培养上清液，然后从中进行IFN-γ的分离纯化，具体步骤如下：
(1)细胞培养：用淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞PBMCs，按2.5×106个/ml的浓度接种于U型细胞培养板中，100μl/孔，并加入50μl PHA进行刺激24h；
(2)细胞培养上清液超滤：收集步骤(1)得到的细胞培养上清液，用30kD的超滤膜，将上清液超滤浓缩约30倍，0.45pm滤膜过滤除去不溶性微粒，即制备得到浓缩细胞培养上清液；
(3)IFN-γ蛋白洗脱液的配制：IFN-γ蛋白洗脱缓冲液按中国专利CN201010159454.5配制：先按体积百分比浓度分别配制0.3％Triton-X，1.5％十二烷基硫酸钠和1.5％3-[(3-胆烷酰胺丙基)-二甲铵]丙磺酸水溶液；然后将上述三种溶液按体积比1:1:1混合均匀，即制备得到IFN-γ蛋白洗脱液；
(4)人IFN-γ亲和层析柱的制备：将BioLegend抗人IFN-γ单克隆抗体用pH8.5的PBS缓冲液稀释并混于protein G柱，置于4℃过夜后，用pH7.2的PBS缓冲液冲洗该proteinG柱，即制备得到人IFN-γ亲和层析柱；
(5)亲和吸附：将步骤(2)制备得到的浓缩细胞培养上清液过步骤(4)制备得到的人IFN-γ亲和层析柱；用pH7.4的PBS缓冲液多次冲洗该人IFN-γ亲和层析柱进行洗杂；
(6)洗脱：采用步骤(3)制备得到的IFN-γ蛋白洗脱液进行洗脱，即收集得到人IFN-γ。
IFN-γ活性检测：采用ELISA检测纯化得到的IFN-γ蛋白与抗体的结合活性，结果如表3所示。
表3实施例3中IFN-γ的ELISA检测结果
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种分离纯化IFN-γ的方法，其特征在于，包括提供人IFN-γ亲和纯化层析柱，使待纯化样本过所述人IFN-γ亲和纯化层析柱，然后用洗脱液进行洗脱，即制备得到目标IFN-γ；其中，所述人IFN-γ亲和纯化层析柱吸附有抗人IFN-γ抗体。
2.如权利要求1所述的分离纯化IFN-γ的方法，其特征在于，所述人IFN-γ亲和纯化层析柱为吸附有抗人IFN-γ抗体的Protein G琼脂糖凝胶柱。
3.如权利要求2所述的分离纯化IFN-γ的方法，其特征在于，将抗人IFN-γ抗体用pH8.0-8.5的PBS缓冲液稀释并过Protein G琼脂糖凝胶柱，置于4-6℃过夜后，用pH7.2-7.4的PBS缓冲液冲洗所述Protein G琼脂糖凝胶柱，即制备得到人IFN-γ亲和层析柱。
4.如权利要求1所述的分离纯化IFN-γ的方法，其特征在于，所述待纯化样本为含有人IFN-γ的细胞培养液上清液；
优选地，所述含有人IFN-γ的细胞培养液上清液的制备方法包括：在植物血凝素刺激条件下培养人外周血单个核细胞，收集培养上清液，即为含有人IFN-γ的细胞培养液上清液。
5.如权利要求1所述的分离纯化IFN-γ的方法，其特征在于，所述待纯化样本在过所述人IFN-γ亲和纯化层析柱之前，经过以下预处理：对所述待纯化样本进行过滤和/或浓缩。
6.如权利要求5所述的分离纯化IFN-γ的方法，其特征在于，所述过滤包括第一过滤和第二过滤；所述第一过滤包括用10-30kD的超滤膜进行过滤；所述第二过滤包括用0.22-0.45pm的滤膜进行过滤。
7.如权利要求5所述的分离纯化IFN-γ的方法，其特征在于，所述浓缩的倍数为10-15倍。
8.如权利要求1所述的分离纯化IFN-γ的方法，其特征在于，所述洗脱液包括Triton-X、十二烷基硫酸钠和3-[(3-胆烷酰胺丙基)-二甲铵]丙磺酸。
9.如权利要求8所述的分离纯化IFN-γ的方法，其特征在于，所述洗脱液按照以下方式配制得到：按照体积百分比浓度分别配制0.3％Triton-X，1.5％十二烷基硫酸钠和1.5％3-[(3-胆烷酰胺丙基)-二甲铵]丙磺酸水溶液；然后将所述三种溶液按体积比1:1:1混合均匀，即制备得到所述洗脱液。
10.如权利要求1所述的分离纯化IFN-γ的方法，其特征在于，所述分离纯化IFN-γ的方法包括以下步骤：
S1、使Protein G琼脂糖凝胶柱吸附抗人IFN-γ抗体，制备得到人IFN-γ亲和纯化层析柱：
S2、对待纯化样本进行以下预处理：对所述待纯化样本进行过滤和/或浓缩；
S3、使经过步骤S2预处理的待纯化样本过步骤S1制备得到的人IFN-γ亲和纯化层析柱；冲洗除去杂蛋白，然后用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液即制备得到目标IFN-γ。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116769026A (zh) * | 2023-05-11 | 2023-09-19 | 广州医科大学附属第一医院 | 一种抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN116769026A (zh) * | 2023-05-11 | 2023-09-19 | 广州医科大学附属第一医院 | 一种抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺及其应用 |
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