CN116769026A - 一种抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗IFN‑γ自身抗体的纯化工艺及其应用，涉及生物技术领域。该纯化工艺包括以下步骤：将生物样本进行深层过滤，得到上清液，将上清液进行亲和层析，得到初提物，采用超滤法进行浓缩，得到抗IFN‑γ自身抗体。该纯化工艺将生物样本经过深层过滤后，通过亲和层析法将复杂的血液成分进行分离，然后再通过超滤法进行浓缩，利用亲和层析的抗原抗体反应，使得到的抗IFN‑γ自身抗体能够保证抗体的天然构型。并且整个纯化工艺无需硫酸铵为代表的盐析技术参与，纯化得到的抗IFN‑γ自身抗体产率高、纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺及其应用。
背景技术
抗体长期以来一直用于研究，但针对人体产生的自身抗体由于缺乏适当的分离纯化方法，因此，一直难以更深层次地研究以抗原抗体相互作用为基础的原发型自身免疫缺陷病。
抗IFN-γ自身抗体免疫缺陷综合征是一种新近发现的原发性免疫缺陷表型，抗干扰素自身抗体(即抗IFN-γ自身抗体)是其致病的主要原因。作为一种尚未被准确定义的自身抗体，由于其产生机制涉及交叉免疫现象，不同种属免疫原性的差异，导致其在模式生物中表达受限，无法实现快速、准确、高纯度、高活性的研究需求。而常用的以硫酸铵沉淀为主体架构的抗体纯化手段费时费力，并且对抗体活性存在影响。同时，由于上述抗干扰素自身抗体缺乏特异性结合位点，常规使用的沉淀法、层析法得到的抗体纯度低、特异性差，且整套分离纯化方法步骤繁琐。上述原因导致目前基于抗IFN-γ自身抗体的研究，都是基于患者的血清或者血浆，并非纯化后的抗IFN-γ自身抗体。因此，需要一种针对抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺方法，能够在不引入硫酸铵的前提下，从复杂的血液成分中将抗IFN-γ自身抗体分离出来，且得到的抗IFN-γ自身抗体产率高，纯度高，能够保持抗IFN-γ自身抗体的天然构型。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺，该纯化工艺将生物样本经过深层过滤后，通过亲和层析法将复杂的血液成分进行分离，然后再通过超滤法进行浓缩，利用亲和层析的抗原抗体反应，使得到的抗IFN-γ自身抗体能够保证抗体的天然构型。并且整个纯化工艺无需硫酸铵为代表的盐析技术参与，纯化得到的抗IFN-γ自身抗体产率高、纯度高。
本发明提供了一种抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺，包括以下步骤：将生物样本进行深层过滤，得到上清液，将所述上清液进行亲和层析，得到初提物，采用超滤法进行浓缩，得到抗IFN-γ自身抗体。
本发明人在研究过程中发现，若采用常规的硫酸铵盐析法对抗体进行纯化，科研级别抗体在硫酸铵沉淀过程中带入大量硫酸盐等杂质，引起产品水解后呈现酸性损伤蛋白质活性，在沉淀过程中存在高pH释氨的发生，对后续所有实验仪器以及实验操作者产生危害。其次，硫酸铵的残留对后续精细实验如质谱，分子相互作用的监测存在巨大影响，后续如进行脱盐步骤将会大量损失抗体成分。而现有技术中又因为缺乏对抗IFN-γ自身抗体的特异性结合位点，因此，采用常规的沉淀法、层析法得到抗体纯度低，特异性差。因此，本发明人提出采用将生物样本经过深层过滤后，通过亲和层析法将复杂的血液成分进行分离，然后再通过超滤法进行浓缩，利用亲和层析的抗原抗体反应，使得到的抗IFN-γ自身抗体能够保证抗体的天然构型。
在其中一个实施例中，所述深层过滤包括以下步骤：采用平衡缓冲液对琼脂糖凝胶浸润，离心，对所述生物样本进行过滤，离心，得到所述上清液。
在其中一个实施例中，所述亲和层析包括第一亲和层析和第二亲和层析，所述第一亲和层析的填料包括干扰素γ，所述第二亲和层析的填料包括蛋白A琼脂糖凝胶，或蛋白G琼脂糖凝胶。
本发明人在针对抗IFN-γ自身抗体进行研究的过程中，之所以现有技术中缺乏对抗IFN-γ自身抗体的特异性结合位点，是因为业界对于抗IFN-γ自身抗体的性质没有明确，不清楚是否为IgG类抗体或者其他任意一种蛋白，而本发明人在研究过程中，通过逐步摸索和反复实验，发现抗IFN-γ自身抗体是以多克隆IgG抗体的形式存在，因此，本发明人提出采用多次亲和层析的方法进行纯化，通过上述多次亲和层析的方法能够将复杂的血液成分进一步分离，实现血液到粗组分抗体混合物，再到特异性IgG的高特异性纯化过程，并且由于利用了亲和层析的抗原抗体反应，更好的保证抗体的天然构型，纯化得到的抗IFN-γ自身抗体可以直接投入科研使用。
在其中一个实施例中，所述第一亲和层析包括以下步骤：将干扰素γ加入抗体亲和层析柱，得到第一亲和层析柱，采用平衡缓冲液对第一亲和层析柱进行平衡，采用平衡缓冲液稀释所述上清液，得到稀释上清液，将所述稀释上清液进行上样，使所述稀释上清液与所述第一亲和层析柱进行蛋白耦合，采用洗脱缓冲液进行洗脱，得到层析液。
在其中一个实施例中，所述第一亲和层析步骤中，所述蛋白耦合的流速为1±0.2mL/min，所述洗脱的目的蛋白保留时间为5-10min，所述洗脱的流速为1.5±0.2mL/min。
在其中一个实施例中，所述第二亲和层析包括以下步骤：将蛋白A琼脂糖凝胶或蛋白G琼脂糖凝胶加入抗体亲和层析柱，得到第二亲和层析柱，采用平衡缓冲液对第二亲和层析柱进行平衡，将所述层析液进行上样，使所述层析液与所述第二亲和层析柱进行蛋白耦合，离心，除去离心液，加入平衡缓冲液，采用洗脱缓冲液进行洗脱，离心，得到初提物。
在其中一个实施例中，所述浓缩包括以下步骤：将平衡缓冲液加入所述初提物，以超滤法进行浓缩，得到抗IFN-γ自身抗体；所述超滤法的膜包包括聚醚砜和再生纤维素纤维中的至少1种。
在其中一个实施例中，所述膜包的分子量为10KD。
在其中一个实施例中，所述生物样本为血液，血清，或血浆；
所述平衡缓冲液包括磷酸缓冲液，Tris缓冲液，和Tris-HCl缓冲液中的至少1种，所述洗脱缓冲液包括Tris-HCl缓冲液，和柠檬酸钠缓冲液中的至少1种。
在其中一个实施例中，所述Tris-HCl缓冲液的pH＝2.0-3.0，所述柠檬酸钠缓冲液的pH＝3.0-4.0。
在其中一个实施例中，所述深层过滤步骤中的平衡缓冲液为pH＝7.4，渗透压为280-315mOsm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液；
所述第一亲和层析步骤中的平衡缓冲液为pH＝7.4，渗透压为280-315mOsm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液；
所述第二亲和层析步骤中，用于平衡的平衡缓冲液为pH＝7.4，渗透压为280-315mOsm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液；除去离心液后加入的平衡缓冲液为pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液；所述第二亲和层析步骤中的洗脱缓冲液为pH＝2.8，含有甘油和EDTA的Tris-HCl缓冲液；
所述浓缩步骤中的平衡缓冲液为pH＝7.4，渗透压为280-315mOsm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液。
本发明还提供了一种产品，该产品包括抗IFN-γ自身抗体，所述抗IFN-γ自身抗体由所述纯化工艺制备得到；所述产品为诊断试剂，生物材料，或生物大分子。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺及其应用，该纯化工艺将生物样本经过深层过滤后，通过亲和层析法将复杂的血液成分进行分离，然后再通过超滤法进行浓缩，利用亲和层析的抗原抗体反应，使得到的抗IFN-γ自身抗体能够保证抗体的天然构型。并且整个纯化工艺无需硫酸铵为代表的盐析技术参与，纯化得到的抗IFN-γ自身抗体产率高、纯度高。
附图说明
图1为实验例中，实施例1进行第一亲和层析后得到的层析液进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(Bio-Rad)实验的结果图；
图2为实验例中，对优势凝胶进行质谱分析的结果图；
图3为实验例中，对实施例1进行超滤浓缩后的蛋白液进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(Bio-Rad)实验的结果图；
图4为实验例中，中和活性实验的结果图；
图5为实验例中，将对比例1得到的层析液进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(Bio-Rad)实验的结果图；
图6为将对比例2得到的蛋白液进行Native-PAGE实验的结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
定义：
本发明的上清液：溶液离心后，在容器下方形成固体的沉淀物，而沉淀物上方形成的液体部分即为上清液。该上清液的成分取决于溶液中存在的组分，上清液可能是透明的，也可能是不透明的。
聚醚砜：英文简称为PES，可用于制备超滤管的包膜。
再生纤维素纤维：指用纤维素为原料制成的再生纤维。
来源：
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。
实施例1
一种抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺。
该纯化工艺具体如下：
一、深层过滤。
使用pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液浸没至琼脂糖凝胶颗粒过滤柱(Cytiva，Superdex200)，以300×g离心1min后，添加血浆(400μL)静置4min，以300×g离心1min后，收集离心收集液，得到上清液。
在本实施例中，上述血浆采集自患有抗IFN-γ自身抗体综合征的患者，具体采集方法：采用EDTA抗凝材料的采血管通过肘窝静脉采血的方式采集血液，经过离心得到血浆。
二、亲和层析。
1、第一亲和层析。
使用抗体亲和层析柱(Cytiva，HiTrap1ml)，装夹填料重组人干扰素γ(Cloud-Clone，1mg)，使用微量泵(Diener)以1.5mL/min泵入pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液10mL。将深层过滤得到的上清液使用pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液稀释至1mL，使用微量泵以1.0mL/min泵入层析柱，静置7min，使用微量泵以1.5mL/min泵入pH为2.8，含有甘油和EDTA的Tris-HCl缓冲液，收集前3mL层析液。
2、第二亲和层析。
使用抗体亲和层析柱(Cytiva，Ab SpinTrap)，装夹填料Protein G SepharoseHigh Performance(Cytiva)，使用pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液充满层析柱，300×g离心1min以去除预装的体积百分比20％的乙醇溶液，重复上述充满缓冲液并离心的步骤1次。加入第一亲和层析得到的层析液，摇晃混匀，静置4min，以100×g离心1min，除去离心液。使用一个新的离心液收集管，添加1M Tris-HCL，pH＝9.0的碱性缓冲液30μL，在层析柱中加入pH＝2.8，含有甘油和EDTA的Tris-HCl缓冲液，以50×g离心1min，得到初提物。
三、超滤浓缩。
使用超滤管(50mL10kDa MWCO，PES，Sartorius)，添加初提物后，添加12mL pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液，以4000×g离心25min，添加12mLpH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液重复2次离心操作，得到含有抗IFN-γ自身抗体的蛋白液。
对比例1
一种纯化工艺。
该纯化工艺具体如下：
一、深层过滤。
使用pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液浸没至琼脂糖凝胶颗粒过滤柱(Cytiva，Superdex200)，以300×g离心1min后，添加血浆(400μL)静置4min，以300×g离心1min后，收集离心收集液，得到上清液。
在本对比例中，上述血浆采集自患有抗IFN-γ自身抗体综合征的患者，具体采集方法：采用EDTA抗凝材料的采血管通过肘窝静脉采血的方式采集血液，经过离心得到血浆。
二、亲和层析。
使用抗体亲和层析柱(Cytiva，HiTrap1ml)，装夹填料重组人干扰素γ(Cloud-Clone，1mg)，使用微量泵(Diener)以1.5mL/min泵入pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液10mL。将深层过滤得到的上清液使用pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液稀释至1mL，使用微量泵以1.0mL/min泵入层析柱，静置7min，使用微量泵以1.5mL/min泵入pH为2.8，含有甘油和EDTA的Tris-HCl缓冲液，收集前3mL层析液。
对比例2
一种纯化工艺。
本对比例的纯化工艺中，采用硫酸铵纯化法对蛋白质成分进行纯化操作，具体如下：
一、盐析纯化。
1、取1mL血清，加生理盐水1mL，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4的体积百分数为20％，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。
2、将静置后的溶液以3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白，得到上清液。
3、在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30mL，使(NH4)2SO4的体积百分数为50％，充分混合，静置30min。
4、将静置后的溶液以3000r/min离心20min，弃上清，得到沉淀。
5、于沉淀中加生理盐水，使之溶解，再加入(NH4)2SO4饱和溶液，使(NH4)2SO4的体积百分数为33％，充分混合后，静置30min。
6、将静置后的溶液以3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复2-3次本对比例中的步骤5。
7、离心去除沉淀，以去除杂蛋白，过DEAE－纤维素层析柱。以0.01mol/L pH7.4的PBS(含有0.03mol/L NaCl)洗脱，收集洗脱液。
8、亲和层析：使用抗体亲和层析柱(Cytiva，HiTrap 1mL)，装夹填料重组人干扰素γ(Cloud-Clone，1mg)，使用微量泵(Diener)以1.5mL/min泵入pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液10mL。将本对比例第7步的洗脱液使用pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液稀释至1mL，使用微量泵以1.0mL/min泵入层析柱，静置7min，使用微量泵以1.5mL/min泵入pH为2.8，含有甘油和EDTA的Tris-HCl缓冲液，收集前3mL层析液。
9、超滤浓缩：使用超滤管(50mL 10kDa MWCO，PES，Sartorius)，添加层析液后，添加12mL pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液，以4000×g离心25min，添加12mLpH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液重复2次离心操作，得到蛋白液。
实验例
一、将实施例1中进行第一亲和层析后得到的层析液进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(Bio-Rad)实验。
电泳实验条件：电压130V，55min。结果如图1所示。
结果分析：实施例1中进行第一亲和层析时，凝胶实验后发现大量蛋白条带混杂，无法明确抗IFN-γ自身抗体的抗体性质。可见，在实施例1进行第一亲和层析后得到的层析液，其中包含的成分只能称为与IFN-γ结合的血浆成分。
二、对图1中的蛋白条带进行质谱蛋白质分析。
结果分析：发现共计检测到1512种不同蛋白质，包括大量未知的蛋白质及其复合体。其中优势凝胶(即蛋白含量较高的凝胶条带)分离结果的主要蛋白质为热休克蛋白家族成员，热休克蛋白70与热休克蛋白71，同时发现大量IgG相关重链、轻链结构，质谱结果如图2所示。
三、对实施例1进行超滤浓缩后的含有抗IFN-γ自身抗体的蛋白液进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(Bio-Rad)实验。
电泳实验条件：电压130V，55min。结果如图3所示。
结果分析：图3中血浆1、血浆2为2组平行试验，从图可看出，IgG蛋白条带纯化程度良好，纯度达到99％。说明实施例1中的第二亲和层析步骤将序列明确的以热休克蛋白家族蛋白为主的大量分子伴侣以IgG纯化的形式去除，得到了纯化后的多克隆IgG成分。
四、中和活性实验。
实验具体操作：
1、将实施例1制备得到的含有抗IFN-γ自身抗体的蛋白液进行260/280mm蛋白浓度检测，使用pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙，镁的磷酸缓冲液将蛋白浓度调节至0.1mg/ml。
2、使用THP-1细胞，0.1mg/ml蛋白浓度的实施例1制备得到的含有抗IFN-γ自身抗体的蛋白液，0.1mg/ml IFN-γ共培养24小时，以是否添加实施例1制备得到的含有抗IFN-γ自身抗体的蛋白液为分组标签分为AIGA(+)，AIGA(-)组，AIGA(+)为添加中等浓度(0.05-0.1mg/ml)实施例1制备得到的含有抗IFN-γ自身抗体的蛋白液，AIGA(-)为无添加实施例1制备得到的含有抗IFN-γ自身抗体的蛋白液，在对磷酸化STAT-1这一公认的IFN-γ介导的信号通路中重要的识别标志进行检测，因为IFN-y在体内的功能是刺激STAT1磷酸化水平升高，如果能够抑制IFN-γ的功能，那么就能降低STAT1磷酸化水平，不加实施例1制备得到的抗IFN-干扰素自身抗体的组，即为阳性对照组。
3、使用磷酸化STAT-1抗体偶联共培养后的THP-1细胞，使用流式细胞仪进行荧光强度表达测定。测定采用硫酸化STAT1流式细胞术，具体如下所示：100微升细胞+表面染色剂30分钟，2毫升冷stainbuffer(FBS)，400-600×g离心5分钟，螺旋，1毫升1*Fix/Perm，2-8℃放置40-50分钟，加1毫升1*Perm/Wash，400-600×g离心5分钟，螺旋，加2毫升Perm/Wash，400-600×g离心5分钟，螺旋，80-100微升Perm/Wash+磷酸化抗体STAT1，2-8℃放置40-50分钟，加2毫升Perm/Wash，400-600×g离心5分钟，螺旋，加2毫升Perm/Wash，400-600×g离心5分钟，螺旋，加350微升Stainbuffer，上机检测。
结果分析：结果如图4所示。添加抗IFN-γ自身抗体能够有效抑制IFN-γ介导的信号通路的激活，并且这种抑制是具有显著性的(p＜0.05)。说明实施例1制备得到抗IFN-干扰素自身抗体具有适当的中和活性。同时证实干扰素自身抗体实际有效成分为IgG构成。而本中和活性实验通过对实施例1得到的蛋白液中的多克隆抗体进行活性鉴定后，确定其能够影响IFN-γ的正常功能后，最终确定IFN-γ是以多克隆IgG抗体的形式存在。
五、将对比例1得到的层析液进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(Bio-Rad)实验。
电泳实验条件：电压130V，55min。使用考马斯亮蓝进行蛋白质染色，使用纯水脱色一天观察。结果如图5所示。
结果分析：由图5可见，单纯进行IFN-γ亲和层析后存在大量不同丰度，不同大小的蛋白质条带存在，在没有明确抗IFN-γ自身抗体的蛋白质属性的基础上，无法从其中获取有效的抗IFN-γ自身抗体。可见，单一使用IFN-γ亲和层析的形式，试图从血浆或血清中分离有效成分，会由于杂质成分如最简单的热休克蛋白家族或小GTP酶家族蛋白的不同蛋白含量与配比均不同，其中的成分部分能够影响IFN-γ的功能，但是有部分会出现非特异性结合，根据条带亮度检测结果，这种方法得到的自身抗体纯度不超过50％，继而对后续各种需要使用抗体的实验产生巨大影响。因此，如对比例1中单一使用IFN-γ亲和层析难以获得满意的效果，甚至根本无法获得有效的关于自身抗体准确的成分提示。
六、将对比例2得到的蛋白液进行Native-PAGE实验。
因Native-PAGE实验采用非变性凝胶，可以更好地保存蛋白质的天然结构，因此，能够准确体现生物大分子的成分和含量。结果如图6所示。
结果分析：由图6可见，存在大量变性蛋白条带的出现，并不局限于IgG或其他抗体所属的规定分子大小，蛋白质结构混乱，呈现解链或多聚体的形式，抗体活性受到破坏。硫酸铵纯化作为一种非常常见的盐析纯化法，常用于粗蛋白的提取或者是精细蛋白的提取，市面上许多亲和层析柱都是选择使用这一盐析的方法将蛋白进行进一步的沉淀，但缺点是由于盐析的方法对于蛋白质的功能产生非常大的影响，如图6所示的非变性凝胶结果，在使用盐析法进行亲和层析的结果就是在最终获得的蛋白质，经过一周的正常保存，有效成分以多聚体或轻重链的形式出现，丧失了其作为蛋白质的活性结构，因此常用的盐析法对于蛋白质的活性的存留是存在硬伤的。而本发明人选择使用pH2.0-3.0的Tris-HCl缓冲液洗脱抗体，此方法洗脱抗体效果温和，并且最终进行超滤离心，过滤甘氨酸成分，获得纯度较高的活性抗IFN-γ自身抗体成分。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种抗IFN-γ自身抗体的纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：将生物样本进行深层过滤，得到上清液，将所述上清液进行亲和层析，得到初提物，采用超滤法进行浓缩，得到抗IFN-γ自身抗体。
2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，所述深层过滤包括以下步骤：采用平衡缓冲液对琼脂糖凝胶浸润，离心，对所述生物样本进行过滤，离心，得到所述上清液。
3.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，所述亲和层析包括第一亲和层析和第二亲和层析，所述第一亲和层析的填料包括干扰素γ，所述第二亲和层析的填料包括蛋白A琼脂糖凝胶，或蛋白G琼脂糖凝胶。
4.根据权利要求3所述的纯化工艺，其特征在于，所述第一亲和层析包括以下步骤：将干扰素γ加入抗体亲和层析柱，得到第一亲和层析柱，采用平衡缓冲液对第一亲和层析柱进行平衡，采用平衡缓冲液稀释所述上清液，得到稀释上清液，将所述稀释上清液进行上样，使所述稀释上清液与所述第一亲和层析柱进行蛋白耦合，采用洗脱缓冲液进行洗脱，得到层析液。
5.根据权利要求4所述的纯化工艺，其特征在于，所述第一亲和层析步骤中，所述蛋白耦合的流速为1±0.2mL/min，所述洗脱的目的蛋白保留时间为5-10min，所述洗脱的流速为1.5±0.2mL/min。
6.根据权利要求4所述的纯化工艺，其特征在于，所述第二亲和层析包括以下步骤：将蛋白A琼脂糖凝胶或蛋白G琼脂糖凝胶加入抗体亲和层析柱，得到第二亲和层析柱，采用平衡缓冲液对第二亲和层析柱进行平衡，将所述层析液进行上样，使所述层析液与所述第二亲和层析柱进行蛋白耦合，离心，除去离心液，加入平衡缓冲液，采用洗脱缓冲液进行洗脱，离心，得到初提物。
7.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，所述浓缩包括以下步骤：将平衡缓冲液加入所述初提物，以超滤法进行浓缩，得到抗IFN-γ自身抗体；所述超滤法的膜包包括聚醚砜和再生纤维素纤维中的至少1种。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的纯化工艺，其特征在于，所述生物样本为血液，血清，或血浆；
所述平衡缓冲液包括磷酸缓冲液，Tris缓冲液，和Tris-HCl缓冲液中的至少1种，所述洗脱缓冲液包括Tris-HCl缓冲液，和柠檬酸钠缓冲液中的至少1种。
9.根据权利要求8所述的纯化工艺，其特征在于，所述深层过滤步骤中的平衡缓冲液为pH＝7.4，渗透压为280-315mOsm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液；
所述第一亲和层析步骤中的平衡缓冲液为pH＝7.4，渗透压为280-315mOsm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液；
所述第二亲和层析步骤中，用于平衡的平衡缓冲液为pH＝7.4，渗透压为280-315mOsm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液；除去离心液后加入的平衡缓冲液为pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液；所述第二亲和层析步骤中的洗脱缓冲液为pH＝2.8，含有甘油和EDTA的Tris-HCl缓冲液；
所述浓缩步骤中的平衡缓冲液为pH＝7.4，渗透压为280-315mOsm/kg，钙、镁元素的含量为0的磷酸缓冲液。
10.一种产品，其特征在于，该产品包括抗IFN-γ自身抗体，所述抗IFN-γ自身抗体由权利要求1-9中任一项所述的纯化工艺制备得到；所述产品为诊断试剂，生物材料，或生物大分子。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
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| CB03 | Change of inventor or designer information |