CN112755984A - 一种筛选内源性抗蛇毒抑制剂的亲和层析方法 - Google Patents

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CN112755984A CN202110090567.2A CN202110090567A CN112755984A CN 112755984 A CN112755984 A CN 112755984A CN 202110090567 A CN202110090567 A CN 202110090567A CN 112755984 A CN112755984 A CN 112755984A
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Abstract

本发明涉及一种筛选内源性抗蛇毒抑制剂的亲和层析方法，本发明所涉及的毒素蛋白亲和模式通过基质表面N‑羟基琥珀酰亚氨(NHS)与蛇毒蛋白发生共价结合，以蛇毒蛋白的特异性亲和作用吸附分离华游蛇血清的蛋白质成分。亲和层析柱制备过程简单，成本低廉；蛋白吸附量大，可以用于抗毒素蛋白的分离；对样品无特殊要求；动态吸附载量高；洗脱方便；筛选范围广，直接从蛇毒免疫的动物、蛇或其天敌动物的血浆中筛选抗毒素蛋白。

Description

一种筛选内源性抗蛇毒抑制剂的亲和层析方法
技术领域
本发明涉及毒素抑制剂开发领域，特别是涉及一种用于筛选未知天然毒素抑制剂亲和层析介质及其制备方法。
背景技术
蛇毒由蛇毒腺分泌，通过排毒导管进入其毒牙鞘内，经毒牙挤压注入咬伤者体内，蛇毒具有神经毒素、肌肉毒素、血液毒素、心脏毒素，能快速地破坏人体组织，且蛇毒毒性强，对成年人致死剂量为5-25mg，因此蛇毒的致死致残率非常高。据WHO官方统计，全球每年至少有400万人被毒蛇咬伤，约12万余人因得不到及时地救治而丧失生命。但蛇和其天敌却具有广谱且强效的抗蛇毒活性，其体内的天然抗蛇毒组分尚未得到系统解析。
本课题组曾从一种江西常见的无毒蛇—华游蛇血液中通过经高效液相色谱法等蛋白分离得到了一种新的有广谱抗蛇毒作用的磷脂酶A2抑制剂(saPLIγ)。但是此蛋白方法得率小，耗费时间长，且只鉴定到一种蛋白抑制剂。最近，我们给华游蛇注射了2倍LD50的五步蛇蛇毒(出血毒)、眼镜蛇蛇毒(神经毒)和蝮蛇蛇毒(混合毒)，24小时后华游蛇仍然存活，中毒症状不明显，皮下未见明显的出血斑。这说明华游蛇体内很可能存在抗出血毒、抗肌肉毒和抗神经毒的活性组分，我们把这些组分称为“抗毒素组”。目前还没有人对华游蛇的抗毒素组进行系统研究。
传统抗蛇毒的研究，一般采取“分离纯化+活性检测”的模式，但在这种“单钩钓鱼”的研究模式下，经常会错失一些其他的抗蛇毒成分。因此，组学策略系统研究华游蛇抗毒素组是当下趋势，对于我们探讨华游蛇广谱抗蛇毒机制和寻找新的蛇毒抑制剂十分必要。本发明构建“蛇毒亲和柱”特异性“捕获”华游蛇血清中抗毒素组分，通过质谱分析鉴定抗毒素组的组成，发现新型抗蛇毒蛋白组分.
本发明使用的亲和层析方法是应用高分子化合物与配基可逆结合的原理,配基通过共价键牢固结合于填料载体上而制得的层析系统.这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。将抗原(或抗体)固相化后，就可以使存在待测液相样品中的相应抗体(或抗原)选择性地结合在固相载体上，与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。具有高效、快速、简便等优点。
因此开发一种简单且快速的方法从血浆或匀浆液中分离抗蛇毒蛋白质组，对于抗毒素蛋白鉴定有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于构建一种构建蛇毒亲和层析介质的方法，将抗毒素组从华游蛇血清或肝匀浆蛋白中捕获出来，提供了一种“多钩钓鱼”模式的天然抗毒素蛋白筛选方法。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：
本发明提供一种蛋白亲和层析介质，所述毒素蛋白静电亲和模式通过基质表面N-羟基琥珀酰亚氨(NHS)与蛇毒蛋白发生共价结合，以蛇毒特异性亲和作用吸附分离华游蛇样品的蛋白质成分。本发明构建的蛇毒亲和柱，可直接用于免疫后的动物血清、华游蛇血清和肝脏匀浆液的抗毒素蛋白分离。且具有操作简单，成本低廉，过程耗时短，分离的抗蛇毒蛋白种类多等优点。
亲和层析柱的构建：
称取100mg五步蛇毒溶于10mL 0.2M碳酸氢钠溶液(pH 8.3)中，用0.45μm滤膜过滤，留0.1mL以便测定偶联效率。取5mL NHS活化琼脂糖凝胶(约2mL凝胶)，用20mL 1mM盐酸洗涤，再用上述0.2M碳酸氢钠溶液(pH 8.3)平衡凝胶柱，将五步蛇毒溶液与凝胶混合，调节PH呈弱碱性后于室温翻转混合1小时或4℃过夜结合。用至少5倍柱体积的0.2M碳酸氢钠溶液平衡凝胶柱，收集穿透液，用于计算结合效率。BCA蛋白定量法测定偶联前后蛇毒浓度，用于计算凝胶的结合效率。
所述毒素蛋白为5-15mg/mL，NHS活化琼脂糖凝胶和毒素蛋白的体积比为1:0.5-1:2.0；所述反应在碱性环境中进行；毒素蛋白溶解的温度为室温4℃，时间为10-12h。
本发明提供一种亲和层析柱的应用，所述亲和层析柱用于分离出华游蛇血清中的抗毒素蛋白。
本发明还提供一种亲和层析柱的应用，包括以下步骤：
a样品处理：断头取新鲜华游蛇血液，10mL，3000rpm，低温离心30min，获取华游蛇血清，将华游蛇血清用PBS稀释2倍后，经0.45μm滤膜过滤，留取部分样品用于后续分析使用；
b平衡柱子：以流速为1mL/min PBS缓冲液平衡亲和层析柱，冲洗5个柱体积以上至基线平稳；
c上样：经蠕动泵，以0.5mL/min的流速将华游蛇血清蛋白样品上样，重复上样2-3次；继续用PBS缓冲液平衡柱子，以洗去未与填料柱结合的蛋白，至基线平稳，期间收集穿透液用于电泳检测；
d洗脱：用甘氨酸缓冲液对结合在亲和层析柱上的蛋白进行洗脱，流速为2mL/min，体积为25mL；在吸光值为280nm下检测蛋白，收集洗脱峰。
所述的亲和层析柱用兔源抗五步蛇毒血清验证其结合效能。
所述的亲和层析柱构建所用五步蛇毒可根据需要进行更换成其他毒液，以筛选针对其他毒素的抗毒素蛋白。
所述的亲和层析柱构建上样样品更换成其他物种血液或匀浆液，以筛选其中的抗毒素蛋白。
本发明的积极效果是:(1)成功构建了蛇毒亲和层析柱。经计算，每毫升NHS活化琼脂糖凝胶偶联效率为24.32％，蛇毒亲和层析柱结合率为48.56％。
(2)SDS-PAGE结果显示与蛇毒亲和柱筛选到了华游蛇血清蛋白约有15个。经质谱鉴定，华游蛇抗毒素蛋白成分包括：磷脂酶A2抑制剂(PLIγ)、胎蛋白家族蛋白(AHSG，金属蛋白酶抑制剂)、小血清蛋白(SSP,蛇血清中的一组自我防御的蛋白质)等蛋白抑制剂和一些与创伤修复和自身稳态维持相关的蛋白，如热休克蛋白、真核翻译起始因子4A(EEF4A)、糖及能量代谢相关酶(果糖二磷酸醛缩酶A、UDP-葡萄糖-6-脱氢酶、ATP合成酶亚,基β及ATP合成酶亚基α等。
传统的分离纯化的研究方法对于寻找抗毒素组分显得尤为吃力，有些以复合物形式存在的活性物质经分离后失去抗蛇毒作用，、本技术尝试采用“多钩钓鱼”的模式，将抗毒素组从华游蛇血清中捕获出来。首次使用五步蛇毒与NHS活化琼脂糖填料结合，构建蛇毒亲和层析柱，来筛选血清中的抗蛇毒组分。
附图说明
图1是本发明蛇毒与NHS填料发生化学反应的示意图：
图2是本发明蛇毒与NHS填料装柱示意图及柱结合能力图：
图3是本发明亲和层析柱的上样、平衡和洗脱示意图：
图4是本发明实例亲和层析柱分离兔血清抗毒素蛋白示意图：
图5是本发明实例亲和层析柱分离蛇血清抗毒素蛋白示意图：
图6是本发明实例亲和层析柱分离蛇肝匀浆液抗毒素蛋白示意图：
具体实施方式
实施例1：
亲和层析柱的构建：
称取100mg五步蛇毒溶于10mL 0.2M碳酸氢钠溶液(pH 8.3)中，用0.45μm滤膜过滤，留0.1mL以便测定偶联效率。取5mL NHS活化琼脂糖凝胶(约2mL凝胶)，用20mL 1mM盐酸洗涤，再用上述0.2M碳酸氢钠溶液(pH 8.3)平衡凝胶柱，将五步蛇毒溶液与凝胶混合，调节PH呈弱碱性后于室温翻转混合1小时或4℃过夜结合。用至少5倍柱体积的0.2M碳酸氢钠溶液平衡凝胶柱，收集穿透液，用于计算结合效率。BCA蛋白定量法测定偶联前后蛇毒浓度，用于计算凝胶的结合效率(图2)。结果如下：
表(例1)NHS琼脂糖凝胶柱结合效率的计算
Figure BDA0002912328900000041
实施例2：
将五步蛇毒与佐剂充分混匀，免疫新西兰白兔，制备抗五步蛇毒血清。通过双向免疫扩散检测抗体是否产生，通过皮下注射法检测抗体的抗出血毒活性。计算蛇毒亲和柱对兔血清抗体的结合率。
(1)Protein G亲和层析分离兔血清总Ig G
a样本预处理：血清用平衡缓冲液以1:2稀释，4℃，10000rpm离心20min，离心后样品用0.45μm滤膜过滤。
b平衡：用5-10倍柱体积的平衡缓冲液平衡Protein G亲和层析柱，保持流速为0.6mL/min。
c上样：样品经蠕动泵上样至层析柱，重复循环上样2次，保持流速为0.5mL/min。
d洗杂：用5倍柱体积的平衡缓冲液冲洗亲和层析柱，保持流速为0.6mL/min。
e洗脱：吸附在Protein G亲和层析柱上的抗体用洗脱液洗脱，收集于15mL离心管中。
f保存：平衡好的Protein G亲和层析柱放于4℃冰箱保存。用碱性缓冲液调节抗体pH至7.0左右。经BCA定量测定抗体浓度后分装，保存于-80℃。
(2)蛇毒亲和层析柱分离抗蛇毒Ig G
a取1mL纯化后的兔血清抗体，通过BCA定量计算样品蛋白含量。
b以5倍柱体积PBS缓冲液平衡蛇毒亲和层析柱(2mL)，流速为1mL/min；以0.5mL/min的流速将蛋白样品过柱；继续用PBS缓冲液平衡柱子，以洗去未与填料柱结合的蛋白，再用甘氨酸盐缓冲(PH 3.0)液对结合在凝胶柱五步蛇毒上的蛋白进行洗脱，流速为2mL/min，体积为25mL。在吸光值为280nm下检测蛋白，收集洗脱峰。
c洗脱峰蛋白作聚丙烯酰胺凝胶电泳与考马斯亮蓝染色分析。通过BCA定量检测洗脱组分蛋白浓度，并计算蛇毒凝胶柱的结合效率。
(3)兔血清抗蛇毒Ig G抗出血毒性验证
选取12只大小、重量相似的健康昆明小鼠，随机分成4组：阴性对照组、阳性对照组和实验组1，2。给每组小鼠背部相同部位皮下给药，给药剂量如下表所示。4小时后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下小鼠背部皮肤，观察背部皮肤的出血斑块大小及出血程度。
表(例2)抗蛇毒Ig G抗出毒性给药剂量
Figure BDA0002912328900000061
上述抗五步蛇毒兔血清，通过Protein G亲和层析柱纯化得到总抗体蛋白，洗脱峰最大的吸收为1.5，通过蛇毒琼脂糖亲和层析柱对Ig G进行二次纯化，洗脱峰的峰高为0.3，结果见图4。
兔血清总Ig G和抗蛇毒Ig G二次纯化抗体经12％变性SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色结果显示，其中泳道1-3分别为兔血清、Protein G穿透峰、兔血清总Ig G，泳道4，5分别为蛇毒亲和层析柱穿透峰及抗蛇毒Ig G；M:10-180kDa标准蛋白Marker。泳道3-5在55及25kDa有条带，与重链和轻链位置相符，说明为Ig G(泳道3，)，通过BCA定量测定兔血清抗体结合前后的浓度(泳道3，泳道5)，经计算抗蛇毒Ig G约占兔血清总Ig G的48.56％。通过小鼠皮下注射法检测Ig G抗出血毒活性，五步蛇毒组小鼠皮下可见明显的出血斑，血管肿大、明显充血，皮肤解剖时可见有黄色渗出液。总Ig G组(c)及二次纯化Ig G组(d)小鼠皮下出血斑显著减轻，血管有少许肿胀，且两者出血斑接近，基本完全抑制出血状况，说明二次纯化基本将总Ig G中的蛇毒抗体完全纯化，说明蛇毒亲和层析柱可作为捕获抗毒素蛋白的工具。
实施例3：
取华游蛇的血清上柱，洗去未结合组分。使用Gly-HCl(pH 3.0)缓冲液，洗脱结合的组分，即华游蛇血清抗蛇毒蛋白(SAV)溶液。通过SDS-PAGE及质谱鉴定，分析华游蛇体内的抗五步蛇毒成分。
(1)分离华游蛇血清抗蛇毒蛋白
a样品处理：断头取新鲜华游蛇血液，约10mL，3000rpm，低温离心30min，获取华游蛇血清，将蛇血清用PBS稀释2倍后，经0.45μm滤膜过滤，留取部分样品用于后续分析使用。
b平衡柱子：以流速为1mL/min PBS缓冲液平衡蛇毒亲和层析柱(2mL)，冲洗5个柱体积以上至基线平稳。
c上样：经蠕动泵，以0.5mL/min的流速将蛇血清蛋白样品上样，重复上样2-3次；继续用PBS缓冲液平衡柱子，以洗去未与填料柱结合的蛋白，至基线平稳，期间收集穿透液用于电泳检测。
d洗脱：用E液对结合在凝胶柱五步蛇毒上的蛋白进行洗脱，流速为2mL/min，体积为25mL。在吸光值为280nm下检测蛋白，收集洗脱峰。
e收集组分及洗脱峰蛋白作聚丙烯酰胺凝胶电泳与考马斯亮蓝染色分析。
(2)华游蛇血清抗毒素组(SAV)的抗出血毒性验证
选取9只成年，大小、重量相似的健康昆明雄鼠，随机分成3组：阴性对照组、阳性对照组和实验组。给每组小鼠背部相同部位皮下注射药物，给药方法如下表所示。4小时后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下小鼠背部皮肤，观察背部皮肤的出血板斑大小。
表(例三)华游蛇SAV抗出血毒检测给药剂量
Figure BDA0002912328900000081
通过五步蛇毒亲和层析柱捕获华游蛇中SAV，经Gly-HCl溶液洗脱得到一个洗脱峰，峰高为0.26(图5)。经变性SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色，结果见图4，其中泳道1-3为华游蛇粗血清、华游蛇SAV和血清穿透峰，M为标准蛋白Marker。在10-15kDa、25-35kDa、50-70kDa及100-180kDa之间约有15个条带。
通过小鼠皮下注射法检测SAV抗出血活性，结果如图5所示，五步蛇毒组小鼠(b)具有明显的出血斑，皮肤解剖时伴有黄色渗出液。华游蛇SAV组小鼠皮下出血明显减少。表明华游蛇中的SAV具有良好的抗出血作用。
利用鸟枪法LC-MS/MS技术，在TrEMBL数据库中(http://www.uniprot.org/)搜索蛋白序列，对华游蛇中的SAV进行了分析和鉴定。经鉴定分析，该组分主要有包括：胎蛋白家族、磷脂酶A2抑制剂、小血清蛋白和一些稳态维持，创伤修复相关蛋白。
实施例4：
取华游蛇的肝脏匀浆液上柱，洗去未结合组分。使用Gly-HCl(pH 3.0)缓冲液，洗脱挂柱结合的组分，即华游蛇肝匀浆液抗蛇毒蛋白溶液(LHAV)。通过SDS-PAGE及质谱鉴定，分析华游蛇体内的抗五步蛇毒成分。
(1)分离华游蛇匀浆抗蛇毒蛋白
a样品处理：断头取新鲜华游蛇肝脏，加生理盐水研磨破碎细胞，用PBS稀释2倍后，经0.45μm滤膜过滤，留取部分样品用于后续分析使用。
b平衡柱子：以流速为1mL/min PBS缓冲液平衡蛇毒亲和层析柱(2mL)，冲洗5个柱体积以上至基线平稳。
c上样：经蠕动泵，以0.5mL/min的流速将蛇肝匀浆蛋白样品上样，重复上样2-3次；继续用PBS缓冲液平衡柱子，以洗去未与填料柱结合的蛋白，至基线平稳，期间收集穿透液用于电泳检测。
d洗脱：用E液对结合在凝胶柱五步蛇毒上的蛋白进行洗脱，流速为2mL/min，体积为25mL。在吸光值为280nm下检测蛋白，收集洗脱峰。
e收集组分及洗脱峰蛋白作聚丙烯酰胺凝胶电泳与考马斯亮蓝染色分析。
(2)华游蛇肝匀浆抗毒素组(LHAV)的抗出血毒性验证
选取9只成年，大小、重量相似的健康昆明雄鼠，随机分成3组：阴性对照组、阳性对照组和实验组。给每组小鼠背部相同部位皮下注射药物，给药方法如下表所示。4小时后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下小鼠背部皮肤，观察背部皮肤的出血板斑大小。
表(例四)华游蛇LHAV抗出血毒检测给药剂量
Figure BDA0002912328900000091
通过五步蛇毒亲和层析柱捕获华游蛇中LHAV，经Gly-HCl溶液洗脱得到一个洗脱峰，峰高为0.05(图6)。经变性SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色，其中泳道1-3为华游蛇肝匀浆液、华游蛇LHAV和蛇肝蛋白穿透峰，M为标准蛋白Marker。
通过小鼠皮下注射法检测LHAV抗出血活性，结果如图5所示，五步蛇毒组小鼠(b)具有明显的出血斑，皮肤解剖时伴有黄色渗出液。华游蛇LHAV组小鼠皮下出血明显减少。表明华游蛇中的LHAV具有良好的抗出血作用。
利用鸟枪法LC-MS/MS技术，在TrEMBL数据库中(http://www.uniprot.org/)搜索蛋白序列，对华游蛇中的LHAV进行了分析和鉴定。经鉴定分析，该组分主要有包括：胎蛋白家族、磷脂酶A2抑制剂、小血清蛋白和一些稳态维持，创伤修复相关蛋白。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种毒素蛋白亲和层析介质及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (9)

1.一种毒素蛋白亲和层析介质，其特征在于，所述毒素蛋白亲和层析介质由基质表面N-羟基琥珀酰亚氨与蛇毒蛋白共价结合而成。
2.如权利要求1所述的毒素蛋白亲和层析介质，其特征在于，所述基质材料为NHS琼脂糖凝胶介质。
3.一种包含如权利要求1-2任一项所述的毒素蛋白亲和层析介质的亲和层析柱。
4.如权利要求3所述的亲和层析柱的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)称取100mg五步蛇毒溶于10mL碳酸氢钠溶液中，用0.45μm滤膜过滤；
(2)取5mL NHS活化琼脂糖凝胶，用20mL盐酸洗涤，再用碳酸氢钠溶液平衡凝胶柱，将蛇毒溶液与凝胶于室温翻转混合1小时或4℃过夜结合；
(3)用至少5倍柱体积的碳酸氢钠溶液平衡凝胶柱，收集穿透液，再用乙醇胺充分洗柱以封闭胶上的未偶联的活化位点。
5.如权利要求4所述的亲和层析柱的制备方法，其特征在于，
所述碳酸氢钠溶液浓度为0.2M，pH 8.3；
所述盐酸浓度为1mM；
所述步骤(3)中的乙醇胺为10mM。
6.如权利要求4所述的亲和层析柱的制备方法，其特征在于，所述毒素蛋白为5-15mg/mL，NHS活化琼脂糖凝胶和毒素蛋白的体积比为1:0.5-1:2.0；所述步骤(1)所述反应在弱碱性环境中进行；毒素蛋白溶解的温度为4℃，时间为10-12h,或室温反应2-3h。
7.如权利要求3所述的亲和层析柱的应用，其特征在于，所述亲和层析柱用于分离出华游蛇样品中的抗毒素蛋白。
8.如权利要求7所述的亲和层析柱的应用，其特征在于，包括以下步骤：
a样品处理：断头取新鲜华游蛇血液或提取的肝组织蛋白样品10mL，3000rpm，低温离心30min，获取上清，用PBS稀释2倍后，经0.45μm滤膜过滤，留取部分样品用于后续分析使用；
b平衡柱子：以流速为1mL/min PBS缓冲液平衡亲和层析柱，冲洗5个柱体积以上至基线平稳；
c上样：经蠕动泵，以0.5mL/min的流速将上述样品上样，重复上样2-3次或4℃孵育8h；用PBS缓冲液平衡柱子，以洗去未与填料柱结合的蛋白，至基线平稳，期间收集穿透液用于电泳检测；
d洗脱：用1M甘氨酸-盐酸缓冲液对结合在亲和层析柱上的蛋白进行洗脱，流速为2mL/min，体积为25mL；在吸光值为280nm下检测蛋白，收集洗脱峰。
9.如权利要求7或8所述的亲和层析柱的应用，其特征在于，所述华游蛇血清和肝匀浆液中的抗毒素蛋白的成分包括：磷脂酶A2抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、小血清蛋白。
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