CN106861661B - 单糖聚合物富集材料及其制备和在糖肽富集中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及单糖聚合物富集材料及其制备和在糖肽富集中的应用,单糖功能单体通过席夫碱缩合的方法共聚到聚合物主链上,并进一步接枝到基质材料上,得到糖响应性聚合物材料;所述单糖聚合物富集材料应用在糖肽的富集和/或选择性分离中;采用聚合物修饰的基质材料与糖蛋白酶解物接触,然后富集糖肽。具体操作采用固相萃取模式或分散固相萃取模式;在固相萃取(SPE)模式下采用单糖聚合物修饰的基质材料富集糖肽时,将糖蛋白酶解物上到以单糖聚合物修饰的基质材料为填料的SPE上,采用淋洗液冲洗,除去非糖肽,采用洗脱液分离出糖肽;本发明制备的聚合物修饰材料在分离富集糖肽时表现出了高选择性和高通量等特点,可以实现糖肽选择性富集。
Description
技术领域
本发明涉及糖响应性聚合物、单糖功能单体、单糖接枝表面。同时还涉及糖肽的分离富集,即糖响应性聚合物修饰材料在分离富集糖肽中的应用。和常规的亲水作用色谱富集方法(HILIC)相比,聚合物修饰的材料在富集糖肽时具有高选择性、高吸附容量和高回收率的优点。此外,富集可在固相萃取柱(SPE)模式或者分散固相萃取模式下进行,操作简单,通量高,可重复性好,适用于复杂体系中糖肽的选择性分离富集。
背景技术
蛋白质的糖基化修饰调控真核细胞许多重要的生物过程,包括免疫应答、细胞粘附和穿行。许多疾病的发生与蛋白质糖基化的变异有关。另外,现有的肿瘤标志物和蛋白类药物绝大多数都是糖蛋白。由此,对糖蛋白的结构进行表征非常重要。但是,在糖肽在生物样品中浓度低,加上在质谱中非糖肽的离子抑制作用是糖肽难于检测;因此,在质谱分析前对糖肽进行选择性富集非常重要。
目前,糖蛋白组学研究的技术策略主要集中在肽段水平上。已有的富集糖肽的策略包括凝集素亲和色谱法、肼化学法、硼酸亲和色谱法及亲水作用色谱法等。这些方法都有限固有的局限性。如凝集素亲和作用色谱存在糖基化覆盖率低的问题[Kubota,etal.Anal.Chem.2008];肼化学对糖肽的选择性高,但是破坏糖链[Zhang,H.;etal.Nat.Biotechnol.2003.];亲水作用色谱对糖肽具有普适性,但是选择性有待提高,因此无法实现复杂生物样品全面的糖蛋白组学。
本发明开发了一系列基于单糖的多氢键作用单元,通过席夫碱缩合的方法共聚到聚合物主链上,并进一步接枝到各种基质材料上,得到糖响应性聚合物表面。将聚合物修饰的材料与固相萃取模式或分散固相萃取模式有机的结合,可实现复杂混合物中糖肽高选择性、高重复性和高通量地富集。从而实现糖肽的选择性富集,可显著提高糖蛋白鉴定数目。因此,其有望在糖肽富集,进而大规模分离糖蛋白等方面获得广泛的应用。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种具有糖识别能力的智能聚合物的制备和应用。通过席夫碱缩合的方法,将单糖功能单体通过席夫碱缩合的方法共聚到聚合物主链上,并进一步接枝到各种基质材料上,在无机半导体Si、微孔SiO2、介孔SiO2、金属Au、Ag、Cu、Al或Pt,金属氧化物CuO、Al2O3、Fe3O4等基质材料表面接枝制备糖响应性聚合物薄膜。在多孔基质表面的接枝提供了一种具有高选择性、高吸附量、操作简单和重复性好的糖肽的分离富集方法,实现低化学计量学糖肽的选择性富集和分离。
本发明目的采用下述方案来实现:
单糖聚合物富集材料,单糖功能单体通过席夫碱缩合的方法共聚到聚合物主链上,并进一步接枝到基质材料上,得到糖响应性聚合物材料;
其中,单糖功能单体为阿洛糖,葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、乙酰葡萄糖胺、乙酰半乳糖胺、核糖、脱氧核糖中的一种或二种以上的1号位溴代之后与对羟基苯甲醛反应所形成的化合物;聚合物主链包括聚乙烯胺、聚天冬酰胺、聚酰胺、聚甲基丙烯酸氨基乙酯、聚甲基丙烯酸氨基丙酯或者聚丙烯酰胺中的一种或二种以上;基质材料包括无机半导体Si、微孔SiO2、介孔SiO2、金属Au、Ag、Cu、Al或Pt,金属氧化物CuO、Al2O3、Fe3O4中的一种或二种以上。
以阿洛糖为例,材料结构如下:
其中X=0.01~0.5。
富集材料为聚合物修饰的基质材料,材料的粒径是0.2-50μm,孔径为
所述单糖聚合物富集材料的制备方法:
1)在反应容器中依次加入0.1-10g聚合物,0.1g-10g的单糖功能单体,同时加1-10mL H2O以及1-15mL甲醇作溶剂,20-60℃搅拌1-48小时,得到的产物装于透析袋中用体积含量1-99%甲醇和水的混合溶液中透析1-7天后冷冻干燥后得单糖聚合物白色固体;(对应的文献为A.Baran,Turk.J.Chem.2013,37,927-935.)
2)首先是3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯的合成:在反应容器中加入5-30ml四氢呋喃,加1-10ml的3-氨基丙基三乙氧基硅烷,滴入1-5ml的二硫化碳搅拌1-3小时之后加入1-6g双氰胺,0.1-1ml的三乙胺,反应时间1-8小时,蒸馏出产物3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯;
3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯与基质材料中的一种或二种以上于甲苯中反应得带有异硫氰酸基团的基质材料;3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯与基质材料的用量比例为0.1-0.5g,反应条件甲苯回流(对应的文献为T.L.Sun,G.J.Wang,L.Feng,B.Q.Liu,Y.M.Ma,L.Jiang,D.B.Zhu,Angew.Chem.,Int.Ed.2004,43,357-360)
3)接有3-异硫氰酸基团的基质0.1-5g量浸入含有上述单糖聚合物1-10g水溶液10-50ml量中;将烧瓶的温度控制在20-60℃静置反应2—24小时;反应结束后用甲醇、水依次洗涤聚合物接枝表面,此聚合物表面的厚度为10-50nm,氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。
单糖功能单体按如下过程进行制备,
在反应容器内加入50-250ml的乙酸酐溶液加入0.5-3ml的高氯酸,缓慢加入所需单糖10-80g,搅拌10-80min后,置于冰浴中,依次加入5-20g红磷,10-30ml溴,10-20ml水,之后常温搅拌2-6h;所得混合物过滤,干燥,之后用1-99%石油醚乙醚溶液洗涤三次,旋干得一号位溴代其它羟基被乙酰基保护的糖的衍生物;(凌勋利,糖基给体溴代糖的合成,洛阳师范学院学报2,75-77)
于反应容器中加入上诉产物10-40g,用50-200ml三氯甲烷溶解,之后加入50-200ml饱和的碳酸钠溶液,加入0.5-10g四丁基碘化铵,1-10g对羟基苯甲醛,30-70摄氏度反应4-24h,之后除水层,干燥后混合物用柱层析法提纯的一号位接有对羟基苯甲醛其它羟基被乙酰基保护的产物;于反应容器中加入1-10g上诉产物,加入10-50ml甲醇,加入0.1-1g的甲醇钠,反应1-24h后,产物用柱层析法提纯,最后得单糖功能单体。(T.Hasegawa,M.Numata,M.Asai,M.Takeuchi,S.Shinkai,Tetrahedron 2005,61,7783-7788)
所述单糖聚合物富集材料在糖肽富集中的应用。
所述单糖聚合物富集材料应用在糖肽的富集和/或选择性分离中;采用聚合物修饰的基质材料与糖蛋白酶解物接触,然后富集糖肽。
具体操作采用固相萃取模式或分散固相萃取模式;
在固相萃取(SPE)模式下采用单糖聚合物修饰的基质材料富集糖肽时,将糖蛋白酶解物上到以单糖聚合物修饰的基质材料为填料的SPE上,采用淋洗液冲洗,除去非糖肽,采用洗脱液分离出糖肽;
或在分散固相萃取模式下采用单糖聚合物修饰的基质材料富集糖肽时,将糖蛋白酶解物上直接与富集材料混合,采用洗脱溶剂,使用离心方式、台阶梯度洗脱条件,富集出糖肽。
1)糖蛋白酶解物与材料的质量比例为1:5-200;2)富集和分离温度为10-60℃;3)淋洗流动相和洗脱流动相的体积为3-1000倍的材料体积;
1)淋洗液的组成如下a-f任一之一所示:
a.A相为水,B相为乙腈,体积比A/B:10/90-40/60;
b.A相为水,B相为甲醇,体积比A/B:10/90-40/60;
c.A相为甲酸铵水溶液(pH 3-6),B相为乙腈,体积比A/B:5/95-40/60;
d.A相为甲酸铵水溶液(pH 3-6),B相为甲醇,体积比A/B:5/95-40/60;
e.A相为甲酸水溶液(pH 2-4),B相为乙腈,体积比A/B:5/95-40/60;
f.A相乙酸水溶液(pH 2-4),B相为甲醇,体积比A/B:5/95-40/60;
其中缓冲盐溶液浓度1-200mM;
2)洗脱液的溶剂组成如下a-f任一之一所示:
a.A相为水,B相为乙腈,体积比A/B:40/60-100/0;
b.A相为水,B相为甲醇,体积比A/B:40/60-100/0;
c.A相为氨水水溶液(pH 8-11),B相为乙腈,体积比A/B:40/60-100/0;
d.A相为碳酸氢铵水溶液(7-9),B相为甲醇,体积比A/B:40/60-100/0;
e.A相为乙酸铵水溶液(5-7),B相为乙腈,体积比A/B:40/60-100/0;
f.A相为磷酸氢钾水溶液(8-10),B相为甲醇,体积比A/B:40/60-100/0;
其中缓冲盐溶液浓度1-200mM。
列举一种常见的单糖作为糖功能单体,
P1中,x:0.01~0.5
通过席夫碱缩合的方法,将单糖功能单体通过席夫碱缩合的方法共聚到聚合物主链上,并进一步接枝到到无机半导体或金属或金属氧化物表面上,获得糖响应性聚合物功能表面;所述的无机半导体为Si或SiO2,所述的金属为Au、Ag或Pt,金属氧化物为CuO、Al2O3、TiO2、ZrO2或Fe3O4。
本发明的单糖聚合物的制备方法:将单糖功能分子共聚物衍生接枝至硅胶或其他多孔基质材料表面上,获得糖响应性聚合物薄膜;所述其他多孔基质材料为多孔氧化铝、氧化钛、氧化锆及其复合材料。
本发明的单糖聚合物应用在糖肽/糖蛋白的富集以及选择性分离等领域。富集材料可选为聚合物修饰材料,材料的粒径是2-30μm,孔径为
具体操作采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式;
采用柱固相萃取(SPE)模式用聚合物修饰材料富集糖肽时,将糖蛋白酶解物上到SPE柱上,采用洗脱溶剂台阶梯度,富集出糖肽;
或采用分散固相萃取模式用聚合物修饰材料富集糖肽时,将糖蛋白酶解物上直接与富集材料混合,采用洗脱溶剂,使用离心方式、台阶梯度洗脱条件,分别先后富集出糖肽。
上样量为富集材料与蛋白酶解物质量比例为10-200:1,富集温度为15-60℃。
本发明具有如下优点:
1.本发明制备的聚合物修饰材料在分离富集糖肽时表现出了高选择性和高通量等特点,可以实现糖肽选择性富集;
2.本发明制备的聚合物修饰材料既可以方便的装填成不同长度,不同内径的柱子,又可以直接添加到离心管,操作简单,易于重复。特别适合微量生物样品中糖肽段的分离富集;
3.本发明富集得到的糖肽可直接用于电喷雾-质谱分析(ESI-MS)或者基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD-TOF MS),提高了质谱的检测限和灵敏度。
附图说明
图1为智能单糖单体表面的表面对多种糖肽选择性吸附的QCM-D曲线。将单糖单层接枝到QCM-D芯片表面,对不同种糖进行吸附实验。条件为控温20℃,载液为水,流速为0.100mL/min。从图中可以看到该聚合物表面对不同类型的糖体现出优异的区分能力,有望被开发用于糖肽的选择性富集和分离。
图2聚合物修饰材料在离心模式下对标准糖蛋白辣根过氧化酶(HRP)(20pmol)酶解产物中糖肽富集前后的MALDI-TOF质谱图。(a)HRP酶解产物经富集前的质谱图;(b)HRP酶解产物经聚合物修饰材料富集后的糖肽馏分;(c)HRP酶解产物经商品化材料Sepharose富集后的糖肽馏分。
图3为标准糖蛋白fetuin(20pmol)酶解产物中糖肽经过不同方法富集后的ESI-MS谱图。(a)fetuin酶解产物富集前的质谱图;(b)fetuin酶解产物经商品化Sepharose富集后的糖肽馏分;(c)fetuin酶解产物经聚合物修饰材料富集后的糖肽馏分。
图4是一个图是热重分析图。
具体实施方式
实施例中所用原料及设备:
硅片由Silicon Materials Corporation(Germany)购得,HPLC柱色谱填料硅胶(氨基修饰)由上海月旭公司购得。聚丙烯酰胺溶液(重均分子量:10000)由Sigma-Aldrich公司购得。葡萄糖,甲醇,对羟基苯甲醛,溴化氢由Alfa公司购得。其他试剂均使用市售分析纯。1H spectra在Bruker ARX300spectrometer检测获得。
实施例1
葡萄糖功能单体的合成
在反应容器内加入200ml的乙酸酐溶液加入1ml的高氯酸,缓慢加入所需葡萄糖20g,搅拌30min后,置于冰浴中,依次加入6g红磷,20ml溴,14ml水,之后常温搅拌4h。所得混合物过滤,干燥,之后用50%石油醚乙醚溶液洗涤三次,旋干后得一号位溴代其它羟基被乙酰基保护的葡萄糖的衍生物;
于反应容器中加入上述产物20g,用150ml三氯甲烷溶解,之后加入150ml饱和的碳酸钠溶液,加入5g四丁基碘化铵,8g对羟基苯甲醛,60摄氏度反应12h,之后除水层,干燥后混合物用柱层析法提纯的一号位接有对羟基苯甲醛其它羟基被乙酰基保护葡糖糖。在反应容器中加入5g上述产物,加入50ml甲醇,加入1g的甲醇钠,反应4h后,产物用柱层析法提纯,最后得葡糖糖功能单体。
聚丙烯酰胺接枝葡萄糖的功能聚合物的合成
在反应容器中依次加入1g聚丙烯酰胺,0.2g的葡萄糖功能单体,同时加入10mLH2O以及15mL甲醇作溶剂,40℃搅拌12小时,得到的产物装于透析袋中用体积含量50%甲醇和水的混合溶液中透析3天后冷冻干燥后得聚丙烯酰胺接枝葡萄糖的功能聚合物白色固体
聚丙烯酰胺接枝糖的功能聚合物硅胶功能表面的制备
在50mL的圆底烧瓶中加入10g多孔或实心硅胶与30mL的5%HCl混合,常温搅拌48h。抽滤得到大量白色固体粉末,分多次用30mL超纯水洗涤;真空干燥后得到羟基化修饰的硅胶产品。
3-氨基丙基三乙氧基硅烷30mmol溶解在20ml的四氢呋喃中,再缓慢滴入二硫化碳,冰浴搅拌3h。之后恢复常温后,加入3.8g双氰胺,紧接着加入3滴三乙胺,20ml四氢呋喃,该混合物加热到40℃继续搅3h。该溶液减压蒸的的沉淀物得到3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯。将得到的3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯与羟基化修饰的硅胶加入到甲苯中滴3滴三乙胺搅拌常温搅拌12h,可得到由3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯修饰的硅胶。将该硅胶加入聚丙烯酰胺聚合物水溶液中滴入几滴三乙胺常温搅拌24h就可得由聚丙烯酰胺聚合物修饰的硅胶。使用相同的方法可以制备不同颗粒尺寸(包括硅胶粒径,孔径)、聚丙烯酰胺聚合物接枝糖的功能聚合物接枝的硅胶样品,用作糖肽/糖蛋白富集和分离柱的填充材料。
实施例2
糖聚合物薄膜的制备
糖聚合物中,x:0.01~0.5
以x=0.2为例,在50mL的烧瓶中依次加入2g聚丙烯酰胺,0.5g的单糖功能单体,同时加入10mL H2O以及15mL甲醇作溶剂,60℃搅拌48小时,得到的产物用甲醇和水的混合溶液中透析三天后冷冻干燥后得单糖聚合物白色固体。
糖聚合物表征数据1H NMR(500MHz,D2O):δ(ppm):1.62(m,20H,C-CH2),2.20(d,10H,C-CH),3.39-3.96(m,5H,CH-OH and CH2-OH),4.21(t,J=3.0Hz,1H,CH-OH),5.43(d,J=8.1Hz,1H,O-CH-O),7.21(m,2H,Ph-H),7.89(d,J=7.1Hz,2H,Ph-H),9.75(s,1H,CH=N).IR(cm-1):3346,3202,2927,1658,1606,1579,1510,1452,1429,1399,1350,1322,1257,1172,1115,1102,1072,1036,912,838,821,804,701,611.
接有异硫氰酸基团的Si,、SiO2、Au、Ag、Pt、CuO、Al2O3、TiO2、ZrO2或Fe3O4浸入含有上述单糖聚合物水溶液中;将烧瓶的温度控制在60℃静置反应4—6小时;反应结束后用甲醇,H2O依次洗涤聚合物接枝表面,此聚合物表面的厚度为10-50nm,氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。使用相同的方法聚合得到不同摩尔比例糖聚物薄膜表面。
实施例3
糖聚合物硅胶功能表面的制备
接有异硫氰酸基团的多孔硅胶浸入含有上述单糖集合物水溶液中;将烧瓶的温度控制在60℃静置反应4—6小时;反应结束后用甲醇,H2O依次洗涤聚合物接枝的多孔硅胶,30℃真空干燥后置于干燥器中备用。使用相同的方法可以制备不同颗粒尺寸(包括硅胶粒径,孔径)、智能糖聚合物接枝的硅胶样品,用作糖肽富集和分离柱的填充材料。图4是一个图是热重分析图,接了糖智能聚合物的硅胶和接有异硫氰酸基团的硅胶热重的对比图;
功能单体的结构与合成方法
为制备上述的聚合物,需要合成糖功能单体,它们具体实施的合成方法类似,现以葡萄糖单体1为例详细说明。
实施例4
将0.11mol(19.8g)葡萄糖缓慢加入含有160ml的乙酸酐和1ml高氯酸的500毫升的三口烧瓶中,该反应的混合物保持在30℃以下维持3h,之后,将该反应混合物放置在冰浴中,依次加入12g红磷,23ml Br2,14.4ml去离子水,温度保持在20℃以下,之后去掉冰浴,常温搅拌4h,该混合物用120ml氯仿稀释,加入冰的饱和NaHCO3溶液中和,有机层用无水CaCl2干燥过夜之后旋干,可得21g黄色油状粗产物b。在250ml加入18.03g的b,5.12ml的4-羟基苯甲醛,0.08g四丁基碘化铵溶解在50ml的二氯甲烷和70ml碳酸钠水溶液中常温搅拌24h,之后有机层无水硫酸钠干燥过夜,之后旋干过柱子纯化得产物c。在100ml的圆底烧瓶中加入5.2g c,0.112g甲醇钠用40ml的甲醇溶解,常温搅拌4h,产物过柱子纯化之后得d。
初步应用实例
实施例5
图1为智能单糖单体表面的表面对多种糖肽选择性吸附的QCM-D曲线。将单糖单层接枝到QCM-D芯片表面,对不同种糖进行吸附实验。条件为控温20℃,载液为水,流速为0.100mL/min。从图中可以看到该糖表面对不同类型的糖体现出优异的区分能力,有望被开发用于糖肽的选择性富集和分离。糖与曲线从上到下一一对应。
富集应用实例
按实施例2所述方法将P1接枝到多孔硅胶表面,然后以其为柱填料制成SPE柱备用。固定相结构如下:
实施例6
将实施例1制备的1mg葡萄糖聚合物修饰材料装入凝胶吸头中,1μL(40pmol)蛋白酶解液上样后,分别用30μL的体积浓度85%乙腈/0.1%甲酸(pH 3)洗脱两次;然后用30μL含有80%乙腈/0.1%甲酸(pH 3)溶液洗脱两次;最后用20μL50%乙腈/2%甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。
由图2可见,HRP酶解产物中的糖肽被可以被从聚合物修饰材料上洗脱下来。相比于商品化Sephaorse富集得到的糖肽(图2c),采用聚合物修饰硅球得到的糖肽选择性更好,糖肽的个数更多(图2b),说明聚合物修饰材料能特异性的富集糖肽。
实施例7
调整富集的操作模式为离心,将实施例1制备的1mg葡萄糖聚合物修饰材料装入离心管中,2μL(80pmol)fetuin酶解液溶于50μL5mM的甲酸铵的80%CH3CN/0.1%甲酸溶液(pH3)并与材料混合,孵化5min,离心后收集上清液,重复此孵化和离心步骤,离心后合并上清液;最后沉淀与50μL含有20mM的甲酸铵的50%CH3CN/0.1%甲酸(pH 3)孵化5min,离心后收集上清液。各上清液直接在MALDI-TOF分析。
由图3a、3b和3c可见,解产物中的糖肽被可以被从聚合物修饰材料上洗脱下来。相比于商品化Sephaorse富集得到的糖肽(图3b),采用聚合物修饰硅球得到的糖肽选择性更好,糖肽的个数更多(图3c),说明聚合物修饰材料能特异性的富集糖肽。
实施例8-11
调整富集材料为木糖,岩藻糖和半乳糖聚合物修饰的硅球材料,其他条件同实施例5,富集后得到的糖肽进行质谱分析。
实施例12-14
调整富集材料为木糖,岩藻糖和半乳糖聚合物修饰的硅球材料,其他条件同实施例6,富集后得到的糖肽进行质谱分析。
实施例15-17
调整富集材料为木糖,岩藻糖和半乳糖聚合物修饰的TiO2材料,其他条件同实施例5,进行选择性富集和质谱分析。
实施例18-21
调整富集材料为木糖,岩藻糖和半乳糖聚合物修饰的TiO2材料,其他条件同实施例6,富集后得到的糖肽进行质谱分析。
实施例22-24
调整fetuin解液的上样量为20pmol、40pmol和160pmol,其他条件同实施例6,富集后得到的糖肽进行质谱分析,实验结果表明在离心操作模式下1mg的材料可以有效地保留和富集80pmol的糖蛋白中的糖肽。
实施例25-27
调整淋洗液pH为4、6和6,其他条件同实施例6,进行选择性富集和质谱分析。
本发明聚合物修饰材料对于糖肽具有很好的选择性富集性能,和常规的亲水材料相比,聚合物修饰材料富集糖肽具有更高选择性,更高糖肽回收率和更好的重复性。利用聚合物修饰材料对于糖肽的高效的特异性吸附能力,可以将其应用于复杂体系中糖肽的选择性分离富集,结合质谱,该材料在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的应用前景。
Claims (10)
1.单糖聚合物富集材料,其特征在于:单糖功能单体通过席夫碱缩合的方法共聚到聚合物主链上,并进一步接枝到基质材料上,得到糖响应性聚合物材料;
其中,单糖功能单体为阿洛糖,葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、乙酰葡萄糖胺、乙酰半乳糖胺、核糖、脱氧核糖中的一种或二种以上的1号位溴代之后与对羟基苯甲醛反应所形成的化合物;聚合物主链包括聚乙烯胺、聚天冬酰胺、聚酰胺、聚甲基丙烯酸氨基乙酯、聚甲基丙烯酸氨基丙酯或者聚丙烯酰胺中的一种或二种以上;基质材料包括无机半导体Si、微孔SiO2、介孔SiO2、金属Au、Ag、Cu、Al或Pt,金属氧化物CuO、Al2O3、Fe3O4中的一种或二种以上。
2.按照权利要求1所述单糖聚合物富集材料,其特征在于:
以阿洛糖为例,材料结构如下:
其中X=0.01~0.5。
3.按照权利要求1所述单糖聚合物富集材料,其特征在于:富集材料为聚合物修饰的基质材料,材料的粒径是0.2-50μm,孔径为
4.一种权利要求1-3任一所述单糖聚合物富集材料的制备方法,其特征是:
1)在反应容器中依次加入0.1-10g聚合物,0.1g-10g的单糖功能单体,同时加1-10mLH2O以及1-15mL甲醇作溶剂,20-60℃搅拌1-48小时,得到的产物装于透析袋中用体积含量1-99%甲醇和水的混合溶液中透析1-7天后冷冻干燥后得单糖聚合物白色固体;
2)首先是3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯的合成:在反应容器中加入5-30ml四氢呋喃,加1-10ml的3-氨基丙基三乙氧基硅烷,滴入1-5ml的二硫化碳搅拌1-3小时之后加入1-6g双氰胺,0.1-1ml的三乙胺,反应时间1-8小时,蒸馏出产物3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯;
3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯与基质材料中的一种或二种以上于甲苯中反应得带有异硫氰酸基团的基质材料;3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯与基质材料的用量比例为0.1-0.5g,反应条件甲苯回流;
3)接有3-异硫氰酸基团的基质0.1-5g量浸入含有上述单糖聚合物1-10g水溶液10-50ml量中;将烧瓶的温度控制在20-60℃静置反应2—24小时;反应结束后用甲醇、水依次洗涤聚合物接枝表面,此聚合物表面的厚度为10-50nm,氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。
5.按照权利要求4所述单糖聚合物富集材料的制备方法,其特征是:单糖功能单体按如下过程进行制备,
在反应容器内加入50-250ml的乙酸酐溶液加入0.5-3ml的高氯酸,缓慢加入所需单糖10-80g,搅拌10-80min后,置于冰浴中,依次加入5-20g红磷,10-30ml溴,10-20ml水,之后常温搅拌2-6h;所得混合物过滤,干燥,之后用1-99%石油醚乙醚溶液洗涤三次,旋干得一号位溴代其它羟基被乙酰基保护的糖的衍生物;
于反应容器中加入上述 产物10-40g,用50-200ml三氯甲烷溶解,之后加入50-200ml饱和的碳酸钠溶液,加入0.5-10g四丁基碘化铵,1-10g对羟基苯甲醛,30-70摄氏度反应4-24h,之后除水层,干燥后混合物用柱层析法提纯的一号位接有对羟基苯甲醛其它羟基被乙酰基保护的产物;于反应容器中加入1-10g上述 产物,加入10-50ml甲醇,加入0.1-1g的甲醇钠,反应1-24h后,产物用柱层析法提纯,最后得单糖功能单体。
6.一种权利要求1-3任一所述单糖聚合物富集材料在糖肽富集中的应用。
7.按照权利要求6所述的应用,其特征是:所述单糖聚合物富集材料应用在糖肽的富集和/或选择性分离中;采用聚合物修饰的基质材料与糖蛋白酶解物接触,然后富集糖肽。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征是:
具体操作采用固相萃取模式或分散固相萃取模式;
在固相萃取(SPE)模式下采用单糖聚合物修饰的基质材料富集糖肽时,将糖蛋白酶解物上到以单糖聚合物修饰的基质材料为填料的SPE上,采用淋洗液冲洗,除去非糖肽,采用洗脱液分离出糖肽;
或在分散固相萃取模式下采用单糖聚合物修饰的基质材料富集糖肽时,将糖蛋白酶解物上直接与富集材料混合,采用洗脱溶剂,使用离心方式、台阶梯度洗脱条件,富集出糖肽。
9.按照权利要求8所述的应用,其特征在于:1)糖蛋白酶解物与材料的质量比例为1:5-200;2)富集和分离温度为10-60℃;3)淋洗流动相和洗脱流动相的体积为3-1000倍的材料体积。
10.按照权利要求8或9所述的应用,其特征在于:
1)淋洗液的组成如下a-f任一之一所示:
a.A相为水,B相为乙腈,体积比A/B:10/90-40/60;
b.A相为水,B相为甲醇,体积比A/B:10/90-40/60;
c.A相为pH3-6甲酸铵水溶液,B相为乙腈,体积比A/B:5/95-40/60;
d.A相为pH3-6甲酸铵水溶液,B相为甲醇,体积比A/B:5/95-40/60;
e.A相为pH2-4甲酸水溶液,B相为乙腈,体积比A/B:5/95-40/60;
f.A相为pH2-4乙酸水溶液,B相为甲醇,体积比A/B:5/95-40/60;
其中缓冲盐溶液浓度1-200mM;
2)洗脱液的溶剂组成如下a-f任一之一所示:
a.A相为水,B相为乙腈,体积比A/B:40/60-100/0;
b.A相为水,B相为甲醇,体积比A/B:40/60-100/0;
c.A相为pH8-11氨水水溶液,B相为乙腈,体积比A/B:40/60-100/0;
d.A相为pH7-9碳酸氢铵水溶液,B相为甲醇,体积比A/B:40/60-100/0;
e.A相为pH5-7乙酸铵水溶液,B相为乙腈,体积比A/B:40/60-100/0;
f.A相为pH8-10磷酸氢钾水溶液,B相为甲醇,体积比A/B:40/60-100/0;
其中缓冲盐溶液浓度1-200mM。
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