CN104415740A - 亲水色谱填料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亲水色谱填料及其制备方法与应用。该填料是通过表面引发原子转移自由基聚合法在硅胶颗粒表面原位聚合GMA-G亲水单体，生成亲水聚合物-硅胶杂化填料。该杂化填料表面高度粗糙，因此具有较高的比表面积。利用该亲水聚合物-硅胶杂化填料装填的固相萃取柱和高效液相色谱柱成功实现对标准糖蛋白、寡糖以及血浆复杂样品中的糖肽或寡糖的富集、分离。选择性富集、分离效果明显，在血浆糖蛋白质中可鉴定出47种寡糖糖型，而且在富集过程中可同时实现对样品的脱盐处理，降低了样品损失。在复杂生物样品的分离分析中具有很好的应用价值。

Description

亲水色谱填料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种亲水色谱填料及其制备方法与应用。
背景技术
蛋白质的糖基化修饰是最常见、最重要的翻译后修饰之一,人体内50%以上的蛋白质是糖基化修饰蛋白质（Jensen,O.N.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2006,7,391-403.）。许多蛋白质功能的实现，如免疫应答、细胞识别、粘附和迁移等都与糖基化修饰密切相关（Bertozzi,C.R.et al.Science2001,291,2357-2364.Ohtsubo,K.et al.Cell2006,126,855-867.）。糖基化蛋白质在疾病的诊断中也发挥着重要的作用，目前已知的多种疾病的临床诊断标志物及治疗靶标，如乳腺癌中的CD44、前列腺癌中的前列腺特异性抗原、卵巢癌中的CA125等都是糖蛋白(Roth,J.Chem.Rev.2002,102,285-303.)。此类糖蛋白的表达水平、糖基化程度、分布及糖链结构的异常变化与许多病理过程密切相关，特别是在肿瘤的发生、发展和转移过程中具有重要意义。鉴于此，系统的定性定量鉴定、分析糖蛋白及其方法学的发展对于肿瘤转移的研究，发现新的疾病诊断标志物及治疗靶标都有非常重要的意义。
作为目前最为有效的规模化糖蛋白鉴定策略，“鸟枪法”鉴定策略先将糖蛋白样本酶解为糖肽和寡糖，通过使用质谱对糖肽和寡糖分别进行定性和定量分析从而获得相应的蛋白质和糖链信息。但由于糖蛋白、糖肽和寡糖本身固有的特性，时至今日，该策略仍然面临着巨大的挑战。实际生物样本中蛋白质的动态范围高达10～12个数量级，大多数糖蛋白往往是其中较低丰度的蛋白质，因此其酶解产生的糖肽或寡糖很难被质谱选中进行分析。为了实现在复杂体系中规模化的分析糖蛋白，当前国际上的主要研究策略都是在质谱检测前，先对糖蛋白、糖肽或寡糖进行富集、分离，有效地降低样品的复杂程度，从而提高糖蛋白的鉴定效率。现在针对糖蛋白、糖肽和寡糖常用的富集、分离手段主要有以下三种：1.凝集素亲和法；2.酰肼、硼酸化学富集法；3.亲水相互作用色谱法。其中亲水色谱法利用糖类物质的强亲水性以及与氨基、酰胺基、羟基等固定相间的氢键、极性和静电相互作用，使得其特异性的保留在亲水固定相上。常用的亲水填料多为在硅胶填料表面键合单层两性离子、酰胺基团或乙二醇结构，因此亲和性较为有限，不利于在复杂样品中对低丰度糖肽或寡糖进行高选择性富集、分离。
原子转移自由基聚合法（Atom Transfer Radical Polymerization,ATRP）是Matyjaszewski K.教授小组于1995年提出的一种可控自由基聚合法，十余年以来得到了国际学术界和工业界的广泛关注。ATRP方法具有产物聚合物结构可控性好、分子量分布窄、适用单体范围广、反应条件要求适中等特点。表面引发原子转移自由基聚合法（SI-ATRP）是将ATRP引发剂固定于材料表面后，原位引发聚合物生长的一种方法，现已广泛应用于材料的表面修饰与功能化。
发明内容
本发明的目的是提供一种亲水色谱填料及其制备方法与应用。
本发明提供的制备色谱填料（也即亲水聚合物-硅胶杂化填料）的方法，包括如下步骤：以2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯（GMA-G）为单体，氯化亚铜为催化剂，1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺为配体，将SI-ATRP引发剂固定在硅胶填料表面后，在所述硅胶填料的表面原位引发SI-ATRP反应，生成聚2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯包裹的硅胶，也即所述色谱填料。
上述方法中，所述亲水试剂2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯是按照包括如下步骤的方法制备而得：
将甲基丙烯酸缩水甘油酯与0.2M的硫酸于50℃进行第一次氧化反应4小时后，加入高碘酸钠室温避光进行第二次氧化反应1-4小时后，将氧化所得产物与氨基葡萄糖的甲醇溶液混匀，室温进行schiff碱反应4-12小时，反应完毕得到所述亲水试剂2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯；
所述甲基丙烯酸缩水甘油酯、硫酸、高碘酸钠和氨基葡萄糖的投料摩尔比1：0.25-1：0.5-2：0.5-2，具体为1：0.4：1：1。
所述SI-ATRP引发剂的一端能与硅胶填料表面结合的硅烷偶联剂，另一端为ATRP引发剂。
所述SI-ATRP引发剂是按照包括如下步骤的方法制备而得：
将硅烷偶联剂和质子酸捕捉剂于冰浴中反应30min后，再加入ATRP引发剂混匀于25-80℃进行反应30min-8小时，反应完毕得到所述SI-ATRP引发剂；
所述硅烷偶联剂选自为3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷和γ-巯丙基三乙氧基硅烷中的至少一种；
所述ATRP引发剂选自2-溴异丁酰溴、α-溴代异戊酰溴和α-溴丙酰溴中的至少一种；
所述质子酸捕捉剂为三乙胺；
所述硅烷偶联剂、ATRP引发剂和三乙胺的投料摩尔比为0.5-1：1：1，优选0.8：1：1；
所述反应步骤中，时间具体为4h；
所述反应均在惰性气氛中进行；所述惰性气氛具体为氮气气氛。
所述将SI-ATRP引发剂固定在硅胶填料表面的步骤包括：将硅胶填料进行酸碱处理使其暴露出硅羟基后，将其与所述SI-ATRP引发剂于溶剂中混匀发生脱水反应生成硅氧键，完成将SI-ATRP引发剂固定在硅胶填料表面的步骤；
其中，所述溶剂选自乙醇、甲醇和环己醇中的至少一种；
所述脱水反应步骤中，温度为室温，时间为1-24小时，优选10小时；
所述硅胶填料与所述SI-ATRP引发剂的质量比1：0.37-7.4，优选1：0.74。
所述酸碱处理包括：所述酸碱处理包括：将所述硅胶填料用0.1M的HCl溶液浸泡30分钟后除去HCl溶液，用水清洗至流出液的pH值为7，再使用0.1M的NaOH水溶液浸泡30分钟后除去NaOH溶液，用水清洗至流出液的pH值为7。
上述制备色谱填料的方法中，所述单体、催化剂和配体的投料摩尔比为400-100：1：1-3，优选200：1：1.5；
所述SI-ATRP反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂选自甲醇、四氢呋喃、乙醇和环己醇中的至少一种；
所述SI-ATRP反应步骤中，温度为室温，时间为0.5-48时，优选24小时；
所述SI-ATRP反应在惰性气氛中进行；所述惰性气氛具体为氮气气氛。
该方法的原理如下：
首先将硅烷偶联剂与ATRP引发剂通过酰胺键共价偶联合成SI-ATRP引发剂。之后通过硅烷偶联剂与硅羟基反应将SI-ATRP引发剂固定到硅胶颗粒表面。之后以丙烯酸缩水甘油酯类试剂和氨基葡萄糖通过schiff碱反应合成的带有双键的葡萄糖（GMA-G）为单体，氯化亚铜为催化剂，1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺为配体（按照200:1:1.5的摩尔比），与固定了引发剂的硅胶颗粒混合均匀，引发SI-ATRP反应，在硅胶颗粒表面原位生成聚GMA-G聚合物链（poly-GMA-G），从而得到亲水聚合物-硅胶杂化填料。
上述本发明提供的色谱填料注入固相萃取柱后，可对寡糖或糖肽进行富集，并在清洗除去蛋白质、非糖肽等非极性物质和盐类杂质后，将糖肽或寡糖洗脱后，可直接将寡糖样品点在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，进行糖型分析。洗脱的糖肽在肽N-糖苷酶F（PNGase F）处理去除N-糖链后，点在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，进行糖基化位点鉴定。使用自动进样器，将寡糖混合物注入亲水聚合物-硅胶杂化填料装填的高效液相色谱柱对寡糖进行在线分离，采用梯度洗脱，检测器为蒸发光散射检测器。
故按照上述方法制备得到的色谱填料及含有该色谱填料的固相萃取柱或高效液相色谱柱，所述色谱填料或所述固相萃取柱或高效液相色谱柱在糖肽或寡糖或糖肽的混合物或寡糖的混合物的富集和/或分离中的应用，也属于本发明的保护范围。
上述固相萃取柱可按照如下方法装填而得：将1-50mg上述色谱填料用乙腈溶解后装填；
上述高效液相色谱柱具体可为3-4g色谱填料装填入150mm*4.6mm i.d.的高效液相色谱柱而得。
上述色谱填料在寡糖或糖肽的富集和/或分离中的应用具体为：将含有寡糖或糖肽的样品溶解于上样液后，注入亲水聚合物-硅胶杂化填料装填的固相萃取柱中，进行寡糖或糖肽的富集，之后将清洗液注入固相萃取柱，重复清洗3次，除去样本中的蛋白质、非糖肽等非极性物质和盐类杂质，最后使用洗脱液对寡糖或糖肽进行洗脱；
上述色谱填料在糖肽的富集和/或分离中的应用，更具体为：
富集对象：以牛胎球蛋白为样本，使用胰蛋白酶将其酶解后所得的肽段混合物；
采用装填有所述色谱填料的固相萃取对其进行富集，富集条件为：将含有糖肽的样品用乙腈/水（80:20,v/v）溶液溶解，注入固相萃取柱中，之后将乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）清洗液注入固相萃取柱，反复3次，除去样本中的非糖肽和盐类杂质，最后使用乙腈/水/甲酸（10:80:0.1,v/v）洗脱液进行洗脱，对洗脱的样品使用肽N-糖苷酶F去除N-糖链后，进行MALDI-TOF-MS表征。可知，富集后样品中的非糖肽和其他杂质基本被去除，糖肽的质谱信号强度、信噪比和鉴定数量均获得明显提高，胎球蛋白的三个N-糖肽均成功检出。
上述色谱填料在寡糖的富集和/或分离中的应用，更具体为：
富集对象：以鸡卵清糖蛋白或人血浆糖蛋白为样本，采用肽N-糖苷酶F处理将N-糖链从糖蛋白上释放所得产物；
采用装填有所述色谱填料的固相萃取对其进行富集，富集条件为：将含有寡糖的样品用乙腈/水（80:20,v/v）溶液溶解，注入固相萃取柱中，之后将乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）清洗液注入固相萃取柱，反复3次，除去样本中的蛋白质等非极性物质和盐类杂质，最后使用乙腈/水/甲酸（10:80:0.1,v/v）洗脱液进行洗脱，并对产物进行MALDI-TOF-MS表征。可知，富集后样品中的蛋白质和其他杂质基本被去除，寡糖的质谱信号强度和信噪比获得明显提高，糖型鉴定数量也由富集前的14种增加到19种（鸡卵清糖蛋白），11种增加到47种（血浆糖蛋白）。
经过上述富集洗脱后的糖肽（肽N-糖苷酶F去除糖链）或寡糖样品可直接点于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，加入基质进行质谱分析，不需要对样品进行脱盐预处理，减少了前处理造成的样本损失。
上述色谱填料在寡糖混合物的在线分离的富集和/或分离中的应用具体为：将所述色谱填料装填入高效液相色谱柱后，采用梯度洗脱模式，以蒸发光散射仪为检测器，对寡糖混合物进行分离并对相应馏分进行检测。
更具体为：以低聚葡萄糖混合物G20为样品，使用该亲水聚合物-硅胶杂化填料装填的液相色谱柱(150mm*4.6mm i.d.)进行分离。流动相分离条件为，流速：1ml/min；流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0-10分钟30%-45%A,10-15分钟，45%A，15-25分钟，45%-65%A。该色谱柱成功用于低聚葡萄糖混合物G20的分离，使葡萄糖单糖、二糖直至葡聚糖20获得有效分离。
本发明是利用质谱技术分析鉴定糖肽、寡糖或糖蛋白样品之前，首先对其进行选择性富集、分离的一种方法，即一种通过表面引发原子转移自由基聚合法制备了一种色谱填料，也即亲水聚合物-硅胶杂化填料，实现了选择性富集、分离亲水性糖肽、寡糖或糖蛋白，进而进行质谱分析的一种方法。该填料是以GMA-G为单体，利用表面引发原子转移自由基聚合法，在硅胶填料表面原位生成亲水聚合物链而得。
该发明具有以下优点：
1）亲水聚合物-硅胶杂化填料表面由SI-ATRP法制备的亲水聚合物链所覆盖，表面高度粗糙，因此具有较高的比表面积；
2）与单层亲水化合物键合的常规填料相比，亲水聚合物-硅胶杂化填料表面的聚合物链带有大量葡萄糖官能团并可形成三维立体亲水层，有效提高了该杂化填料的亲水性以及与寡糖和糖肽的亲和性和负载量；
3）亲水聚合物-硅胶杂化填料特别适合从微量复杂样品中富集、分离寡糖和糖肽等强亲水性物质。利用该填料装填的固相萃取柱富集复杂样品中低含量的糖肽或寡糖时，选择性富集效果明显，大幅提高了寡糖和糖肽的鉴定数量。而且在富集过程中可同时实现对样品的脱盐处理，降低了样品损失。
4）亲水聚合物-硅胶杂化填料采用硅胶基质，具有较好的机械强度。不但可以用于装填固相萃取柱，用于寡糖和糖肽的富集；而且可以装填高效液相色谱柱，对具有不同糖型的寡糖或糖肽混合物进行分离。
附图说明
图1为本发明技术方案的流程图。
图2为未经聚合物修饰的硅胶颗粒的扫描电镜图（a）；本发明提供的色谱填料的扫描电镜图（b）。
图3为未经聚合物修饰的硅胶颗粒的热重分析曲线（a）；本发明提供的色谱填料的热重分析曲线（b）。
图4为未经富集的牛胎球蛋白的胰蛋白酶酶解肽段，直接使用PNGase F酶切去除糖链后的MALDI-TOF-MS质谱图（a）；牛胎球蛋白的胰蛋白酶酶解肽段经亲水聚合物-硅胶杂化填料富集后，使用PNGase F去除糖链后的MALDI-TOF-MS质谱图（b）。
图5为卵清蛋白经PNGase F酶解释放寡糖后，未经富集直接鉴定的MALDI-TOF-MS质谱图（a）；卵清蛋白经PNGase F酶切释放寡糖后，使用色谱填料对寡糖富集后再鉴定的MALDI-TOF-MS质谱图（b）。
图6为人血浆糖蛋白经PNGase F酶解释放的寡糖，未经富集直接鉴定的MALDI-TOF-MS质谱图（a）；人血浆糖蛋白经PNGase F酶解释放的寡糖，使用色谱填料对寡糖进行富集后再鉴定的MALDI-TOF-MS质谱图（b）。
图7：色谱填料填充的色谱柱在线分离低聚葡萄糖混合物G20的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
实施例1、
SI-ATRP法制备亲水聚合物-硅胶杂化填料的制备流程图如图1所示。
1）2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯（GMA-G）单体的合成：向674.53μl甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）中加入0.2M硫酸，放置于50℃水浴中加热进行第一次氧化反应4小时后，再加入1.09g高碘酸钠混合，室温避光进行第二次氧化反应2小时后，得到氧化的GMA；
另量取20毫升甲醇，逐步加入1.1克氨基葡萄糖，搅拌至溶解。将所得氧化的GMA逐滴加入到持续搅拌的氨基葡萄糖的甲醇溶液中，室温搅拌进行schiff碱反应4小时呈黄色透明溶液，并将制备好的溶液氮气吹干挥发至呈膏状，得到GMA-G单体，密闭充氮气后放置4℃保存。
2）SI-ATRP引发剂的合成：使用硅烷偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷与ATRP引发剂2-溴异丁酰溴反应合成一端为能与硅胶填料表面结合的硅烷偶联剂，另一端为ATRP引发剂的SI-ATRP引发剂。
具体如下：将8mmol3-氨丙基三乙氧基硅烷与10mmol质子酸捕捉剂三乙胺加入到12.5ml四氢呋喃中，混合后通入氮气除氧同时冰浴反应30min，之后将10mmol2-溴异丁酰溴缓慢滴加到混合液中于50℃剧烈搅拌反应4h（持续通氮气），最后将溶液过滤后真空干燥至原始体积的1/3以去除四氢呋喃与三乙胺，离心后去除沉淀，氮气吹干后可得到黄色粘稠状SI-ATRP引发剂，充氮气后密闭4℃保存。
3）SI-ATRP引发剂的固定：利用SI-ATRP引发剂上的硅烷偶联剂与硅胶填料表面的硅羟基发生脱水反应生成硅氧键共价连接，从而将SI-ATRP引发剂固定在硅胶填料表面上。
首先按照如下步骤对硅胶填料进行酸碱处理，以暴露硅胶颗粒表面的硅羟基：用0.1M的HCl溶液浸泡硅胶填料，30分钟后将HCl溶液去除，用水清洗硅胶填料至流出液的pH值为7，再使用0.1M的NaOH溶液浸泡硅胶填料，30分钟后将NaOH溶液去除，用水清洗硅胶填料至流出液的pH值为7。
再将含有500μM SI-ATRP引发剂的乙醇溶液与经过酸碱处理后的硅胶颗粒混合，室温下进行脱水反应10小时后，去除剩余引发剂，并用甲醇溶液清洗硅胶颗粒，氮气吹干。
4）引发SI-ATRP反应，在硅胶颗粒表面原位生成聚GMA-G聚合物链：所用单体为1.1中合成的一端带有双键另一端带有葡萄糖的GMA-G。
将步骤1）所得单体2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯（GMA-G）、催化剂氯化亚铜、配体1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺按照摩尔比200：1：1.5的比例加入甲醇中，超声处理使其溶解并混合均匀。将上述反应液与表面已固定了SI-ATRP引发剂的硅胶填料混合，采用冷冻-抽真空-解冻-冲氮气的方法除去体系中的氧气，如此循环3次，之后用封口膜封口，于室温在硅胶填料的表面原位引发ST-ATRP反应24小时。反应完成后反复用甲醇清洗、去除剩余反应物，得到聚2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯包裹的硅胶，也即本发明提供的色谱填料。
取上述方法所得色谱填料和未经修饰的硅胶颗粒分别进行扫描电镜分析，所得结果见图2。
由图可知，未修饰的硅胶填料（图2a）与色谱填料（图2b）的表面形态有明显区别。未修饰的硅胶填料表面光滑，而色谱填料表面有明显的聚合物包裹，表面粗糙度较高。证明通过SI-ATRP法在硅胶颗粒表面修饰亲水聚合物是成功的。
分别称取100mg克色谱填料和未经修饰的硅胶填料，进行热重分析，所得结果见图3。
由于色谱填料由可热分解从而导致质量损失的聚合物层和不可热分解的硅胶颗粒核心两部分组成。故从图3中可看出，未修饰聚合物的硅胶颗粒随热处理温度的提高无明显质量损失（曲线a）。而色谱填料颗粒随热处理温度的提高，有两个失重区，从30℃-120℃的失重是吸附水和结合水失重区，从120℃-420℃表现出的失重区是由硅胶上的GMA-G聚合物热分解导致（曲线b）。证明通过SI-ATRP法在硅胶颗粒表面原位聚合生成GMA-G聚合物链是高度有效的。
实施例2、利用实施例1所得色谱填料进行糖肽的富集
1）取10mg实施例1制备所得色谱填料用乙腈溶解，装填到200ul移液器枪头里，自然沉淀，制备固相萃取柱；
2）称取适量牛胎球蛋白（Sigma公司，CAS:9014-81-7），溶解于50mM碳酸氢铵溶液中，终浓度为1μg/μl。加入终浓度为10mM的巯基乙醇，56℃水浴中还原1小时，之后加入IAA于暗处放置1小时将糖蛋白变性。取变性糖蛋白按质量比1:50（胰蛋白酶：蛋白质）加入胰蛋白酶，放置于37℃水浴孵育12小时后加入0.1%TFA将胰蛋白酶灭活，得到酶解产物。
将所得酶解产物均分为两份，一份冷冻干燥后用乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）重溶，终浓度1μg/μl。将该固相萃取柱用30μl乙腈/水/甲酸（10:90:0.1,v/v）溶液润洗，60μl乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）溶液平衡后，取10μl酶解产物上样，乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）溶液洗涤3次，最后用30μl乙腈/水/甲酸（10:90:0.1,v/v）溶液洗脱。洗脱液中加入50mM碳酸氢铵后，加入PNGase F（购自Sigma公司）（酶和蛋白的质量比为1:10），置于37℃水浴中孵育16小时。
向上述另一份胰蛋白酶酶解产物中直接加入PNGase F（酶和蛋白的质量比为1:10），置于37℃水浴中孵育16小时。
分别从未经富集和经固相萃取柱富集后的PNGase F酶解产物中取1μl样品点于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，干燥后，点上α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液（50%乙腈，0.1%H3PO4）作为基质，待靶上溶液结晶后进行质谱分析。所得结果图如4所示。谱图中的峰均为去糖链后糖肽。
由图可知，未经富集的样品的MALDI-TOF-MS质谱图中存在大量非糖肽信号干扰，导致糖肽信号被严重抑制，难以检测；
而经固相萃取柱富集后的样品的MALDI-TOF-MS质谱图中，非糖肽和其他杂质的信号基本被去除，糖肽的信号强度和信噪比均获得明显提高，并鉴定到了胎球蛋白的全部3个糖基化位点。说明由此色谱填料装填的固相萃取柱对糖肽尤其是亲水性糖肽具有明显富集效果。
实施例3、利用实施例1所得色谱填料进行寡糖的富集
1）取10mg实施例1制备所得色谱填料用乙腈溶解，装填到200ul移液器枪头里，自然沉淀，制备固相萃取柱；
2）取50μg鸡卵清蛋白（Sigma公司，CAS:9006-59-1），溶解于50mM碳酸氢铵溶液中，终浓度为1μg/μl。沸水浴热变性10分钟后，冷却到室温，取适量变性蛋白加入PNGase F（酶和蛋白质质量比为1:20），置于37℃水浴中孵育16小时。酶解产物冷冻干燥后用乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）溶解，终浓度为1μg/μl。对该固相萃取柱用30μl乙腈/水/甲酸（10:90:0.1,v/v）溶液润洗，60μl乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）溶液平衡后，取10μl样品上样，乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）溶液洗涤3次，最后用30μl乙腈/水/甲酸（10:90:0.1,v/v）溶液洗脱，真空冷冻干燥，定容至10ul。
取1μl洗脱液点在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，干燥后，点上2,5-二羟基苯甲酸溶液（50%乙腈，0.1%H3PO4）作为基质，靶上溶液结晶后进行质谱分析。所得结果如图5所示。
由图可知，从未经富集的样品的MALDI-TOF-MS质谱图中只能鉴定到14种糖型，且信号强度和信噪比均较低；而经固相萃取柱富集后，寡糖的质谱信号强度和信噪比均获得显著提高。鉴定到的糖型从14种提高19种。此结果说明该亲水聚合物-硅胶杂化填料装填的固相萃取柱对标准糖蛋白的寡糖具有明显富集效果。
实施例4、利用实施例1所得色谱填料进行寡糖的富集
1）取10mg实施例1制备所得色谱填料用乙腈溶解，装填到200ul移液器枪头里，自然沉淀，制备固相萃取柱；
2）取50μg血浆全蛋白，溶解于50mM碳酸氢铵溶液中，终浓度为2μg/μl。沸水浴热变性10分钟后，冷却到室温，取适量变性蛋白加入PNGase F（酶和蛋白质质量比为1:10），置于37℃水浴中孵育16小时。酶解产物冷冻干燥后用乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）溶解，终浓度为2μg/μl。对该固相萃取柱用30μl乙腈/水/甲酸（10:90:0.1,v/v）溶液润洗，60μl乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）溶液平衡后，取30μl样品上样，乙腈/水/甲酸（80:20:0.1,v/v）溶液洗涤3次，最后用30μl乙腈/水/甲酸（10:90:0.1,v/v）溶液洗脱。
取1μl洗脱液点在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，干燥后，点上2,5-二羟基苯甲酸溶液（50%乙腈，0.1%H3PO4）作为基质，靶上溶液结晶后进行质谱分析。所得结果如图6所示。
图6a为血浆糖蛋白PNGase F酶解后的寡糖混合物未经固相萃取柱富集，直接进行质谱鉴定的谱图，共鉴定到11种糖型。如图6b所示，在经过固相萃取柱富集的血浆糖蛋白寡糖的质谱图上，蛋白质和多肽杂质已基本被除去，寡糖对应的质谱峰信号强度、信噪比及糖型鉴定数量均显著提高，共鉴定到47种糖型。此结果说明该色谱填料装填的固相萃取柱对复杂样本中糖蛋白的寡糖具有明显富集效果。
实施例5
取4g实施例1制备所得色谱填料，湿法装填高效液相色谱柱(150mm*4.6mm i.d.)后，以浓度为1mg/ml的低聚葡萄糖混合物G20（葡萄糖单糖、二糖直至葡聚糖二十）溶液作为样品进行在线分离。
分离条件为：流速：1ml/min；流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0-10分钟30%-45%A，10-15分钟，45%A，15-25分钟，45%-65%A。检测器为蒸发光散射检测器。
所得结果如图7所示。由图可知，该色谱柱成功用于低聚葡萄糖混合物G20的分离，使葡萄糖单糖、二糖直至葡聚糖二十获得有效分离。

Claims (10)

1.一种制备色谱填料的方法，包括如下步骤：以2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯为单体，氯化亚铜为催化剂，1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺为配体，将SI-ATRP引发剂固定在硅胶填料表面后，在所述硅胶填料的表面原位引发SI-ATRP反应，生成聚2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯包裹的硅胶，也即所述色谱填料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述单体、催化剂和配体的投料摩尔比为400-100：1：1-3，优选200：1：1.5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述SI-ATRP反应步骤中，温度为室温，时间为0.5-48小时，优选24小时。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述SI-ATRP反应在有机溶剂中进行；
所述有机溶剂具体选自甲醇、四氢呋喃、乙醇和环己醇中的至少一种；或，
所述SI-ATRP反应在惰性气氛中进行；
所述惰性气氛具体为氮气气氛。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯是按照包括如下步骤的方法制备而得：
将甲基丙烯酸缩水甘油酯与0.2M的硫酸于50℃进行第一次氧化反应4小时后，加入高碘酸钠室温避光进行第二次氧化反应1-4小时后，将氧化所得产物与氨基葡萄糖的甲醇溶液混匀，室温进行schiff碱反应4-12小时，反应完毕得到所述亲水试剂2-甲基丙烯酸3-葡萄糖氨基丙酯；
所述甲基丙烯酸缩水甘油酯、硫酸、高碘酸钠和氨基葡萄糖的投料摩尔比1：0.25-1：0.5-2：0.5-2，具体为1：0.4：1：1。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述SI-ATRP引发剂是按照包括如下步骤的方法制备而得：
将硅烷偶联剂和质子酸捕捉剂于冰浴中反应30min后，再加入ATRP引发剂混匀于25-80℃进行反应30min-8小时，反应完毕得到所述SI-ATRP引发剂；
其中，所述硅烷偶联剂选自3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷和γ-巯丙基三乙氧基硅烷中的至少一种；
所述ATRP引发剂选自2-溴异丁酰溴、α-溴代异戊酰溴和α-溴丙酰溴中的至少一种；
所述质子酸捕捉剂为三乙胺；
所述硅烷偶联剂、ATRP引发剂和三乙胺的投料摩尔比为0.5-1：1：1，优选0.8：1：1；
所述反应步骤中，时间具体为4h；
所述反应均在惰性气氛中进行；所述惰性气氛具体为氮气气氛。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述将SI-ATRP引发剂固定在硅胶填料表面的步骤包括：
将硅胶填料进行酸碱处理后，与所述SI-ATRP引发剂于溶剂中混匀发生脱水反应，完成将SI-ATRP引发剂固定在硅胶填料表面的步骤；
其中，所述溶剂选自甲醇、乙醇和环己醇中的至少一种；
所述脱水反应步骤中，温度为室温，时间为1-24时，优选10小时；
所述硅胶填料与SI-ATRP引发剂的质量比1：0.37-7.4，优选1：0.74。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述酸碱处理包括：将所述硅胶填料用0.1M的HCl溶液浸泡30分钟后除去HCl溶液，用水清洗至流出液的pH值为7，再使用0.1M的NaOH水溶液浸泡30分钟后除去NaOH溶液，用水清洗至流出液的pH值为7。
9.权利要求1-7任一所述方法制备得到的色谱填料；
含有所述色谱填料的固相萃取柱或高效液相色谱柱。
10.权利要求9所述色谱填料或9所述固相萃取柱或高效液相色谱柱在糖肽或寡糖或糖肽的混合物或寡糖的混合物的富集和/或分离中的应用。
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