CN112538514A - 一种同时富集糖肽和磷酸化肽的方法 - Google Patents

一种同时富集糖肽和磷酸化肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明合成了一种糖肽和磷酸化肽同时富集、在线酶切、分步洗脱的分析方法。该方法是将聚合物富集材料与糖蛋白和磷酸化蛋白的酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式同时富集糖肽和磷酸化肽，并对富集在聚合物富集材料上的糖肽进行酶切，切除糖链，从而释放出切掉糖链的糖肽，实现糖肽和磷酸化肽的分步洗脱。所述聚合物富集材料是利用表面引发‑原子转移自由基聚合反应机制，将组氨酸衍生物功能单体在基底表面经过聚合所得。该方法通过对富集过程pH、酶解反应时间等条件的控制，实现了复杂混合物中糖肽和磷酸化肽高选择性、高重复性和高通量的同时富集，显著提高了一次样品分析中糖蛋白的鉴定数目和磷酸化蛋白鉴定数目。

Description

一种同时富集糖肽和磷酸化肽的方法
技术领域
本发明涉及材料分析化学和翻译后修饰蛋白组学等领域，尤其涉及一种同时富集分离糖肽和磷酸化肽的方法。
背景技术
蛋白质糖基化和磷酸化是生物体内最常见、最重要的两种蛋白翻译后修饰方式，其在细胞生命活动中具有重要的调控作用，因此在分子水平研究蛋白质糖基化和磷酸化，及二者之间的相互作用对揭示其在生命过程的调节机制意义重大。以质谱为基础的蛋白组学方法是鉴定蛋白糖基化和磷酸化的常规方法。但是在质谱分析前，需要对低丰度的糖肽、磷酸化肽进行选择性的富集，以提高糖肽、磷酸化肽在质谱中信号强度和鉴定数目。已有的糖肽富集方法主要有凝集素法、肼化学法、硼酸法以及亲水作用色谱法等，其中亲水作用色谱法应用最为广泛。固定金属离子亲和色谱法和金属氧化物法常用于磷酸化肽/磷酸化蛋白的富集。目前同时富集糖肽和磷酸化肽的方法普遍基于固定金属离子亲和色谱法或金属氧化物法和亲水作用色谱法。但是这样的方法都存在一定的局限性：单一材料难以实现糖肽和磷酸化肽的分步洗脱；共富集后鉴定糖基化位点，中间过程多，造成部分糖基化和磷酸化信息丢失；多磷酸化肽死吸附等问题。因此，为了实现复杂生物样品中共同富集、分步洗脱糖肽和磷酸化肽的目的，亟需一种简单高效，在保证糖肽和磷酸化肽覆盖率的同时又能有效排除非糖肽和非磷酸化肽干扰的新型共同富集方法。
发明内容
本发明为解决上述技术问题提供一种具有高选择性、高吸附量、操作简单和重复性好的共同富集分离糖肽和磷酸化肽的方法，能对低化学计量的糖肽和磷酸化肽进行选择性富集和分离。
本发明的技术方案如下：
一种同时富集、在线酶切分离糖肽和磷酸化肽的方法，其特征在于，该方法是将聚合物富集材料与糖蛋白酶解物、磷酸化蛋白酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式同时富集糖肽和磷酸化肽，并在线对糖肽进行酶切，实现糖肽和磷酸化肽的分步洗脱并进行质谱分析。所述聚合物富集材料结构为：
Figure BDA0002190859890000021
所述聚合物富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将组氨酸类功能单体在基底材料表面经过聚合所得。
上述方案中，具体操作采用固相萃取模式(SPE)或分散固相萃取模式(dSPE)同时富集糖肽和磷酸化肽，具体步骤如下：
在SPE模式下同时富集糖肽和磷酸化肽时，将样品上到填装有基于组氨酸的聚合物材料的SPE柱上，采用淋洗流动相冲洗材料，去除其上的非糖肽和非磷酸化肽；再将结合有糖肽和磷酸化肽的材料加入PNGase F酶切掉连有糖链的肽段；再采用不同洗脱流动相冲洗，分步洗脱去糖肽段和磷酸化肽；或在dSPE模式下富集纯化糖肽和磷酸化肽时，将样品直接与基于组氨酸的聚合物材料混合，离心，弃去上清液；采用淋洗流动相冲洗材料，离心，去除其上的非糖肽和非磷酸化肽；再将结合有糖肽和磷酸化肽的材料加入PNGase F酶切掉连有糖链的肽段；再采用不同洗脱流动相冲洗，离心，分步收集去糖肽段和磷酸化肽；
本发明具有如下有益效果：
1.本发明的糖肽和磷酸化肽共富集方法在分离富集糖肽时表现出了高选择性和高效率等特点，可以实现糖肽和磷酸化肽的共富集和分步洗脱；
2.本发明制备的同时聚合物富集材料既可以方便的装填成不同长度，不同内径的柱子，又可以直接添加于离心管，操作简单，易于重复，特别适合微量生物样品中糖肽的分离富集；
3.本发明富集得到的磷酸化肽可直接用于电喷雾-质谱分析(ESI-MS)或者基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD–TOF MS)，提高了质谱的检测限和灵敏度。
本发明是将聚合物富集材料与糖蛋白和磷酸化蛋白的酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式同时富集糖肽和磷酸化肽，并对富集在聚合物富集材料上的糖肽进行酶切，切除糖链，从而释放出切掉糖链的糖肽，实现糖肽和磷酸化肽的分步洗脱。所述聚合物富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将组氨酸衍生物功能单体在基底表面经过聚合所得。该方法通过对富集过程pH、温度、有机相浓度、酶解反应时间等条件的控制，实现了复杂混合物中糖肽和磷酸化肽高选择性、高重复性和高通量的同时富集，显著提高了一次样品分析中糖蛋白的鉴定数目和磷酸化蛋白鉴定数目。
附图说明
图1为采用SPE模式经聚合物修饰多孔硅胶富集后，牛胎球蛋白酶解产物中的非糖肽质谱信号示意图。
图2为采用SPE模式经聚合物修饰多孔硅胶富集后，牛胎球蛋白酶解产物中的糖肽质谱信号示意图。
图3为采用SPE模式经聚合物修饰多孔硅胶富集后，α-酪蛋白酶解产物中的非磷酸化肽质谱信号示意图。
图4为采用SPE模式经聚合物修饰多孔硅胶富集后，α-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽质谱信号示意图。
图5为采用离心模式，经聚合物修饰多孔硅胶富集后牛胎球蛋白酶解产物中的非糖肽质谱信号示意图。
图6为采用离心模式，经聚合物修饰多孔硅胶富集后牛胎球蛋白酶解产物中的糖肽质谱信号示意图。
图7为采用离心模式，经聚合物修饰多孔硅胶富集后α-酪蛋白酶解产物中的非磷酸化肽质谱信号示意图。
图8为采用离心模式，经聚合物修饰多孔硅胶富集后α-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽质谱信号示意图。
具体实施方式
为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。
实施例中所用原料及设备:
HPLC柱色谱填料硅胶(氨基修饰)由上海月旭公司购得。溴化亚铜(CuBr，99.999％)，N,N,N’,N’,N”-Pentamethyl-diethylenetriamine(PMDETA)，联吡啶，吡啶由Sigma-Aldrich公司购得。组氨酸功能单体从上海强耀生物科技有限公司购得。所用水为去离子水，其他试剂如甲醇，乙腈，丙酮，DMF，氢氧化钠等均使用市售色谱级。质谱分析结果由MALD-TOF MS获得。
本发明以在多孔硅胶上聚合组氨酸为例，制备以下实施例所使用的聚合物富集材料，其结构式为：
Figure BDA0002190859890000041
其中聚合度n＝5-20。
制备方法：
在25mL的烧瓶中3.0g丙烯酸化组氨酸功能单体(丙烯酸-His)，同时加入5mL H2O，5mL CH3OH以及5mL DMF作溶剂；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，加入1.5g溴化处理后的多孔硅胶(粒径5μm，孔径
Figure BDA0002190859890000042
)，同时补充加入5mL H2O以及5mL DMF作溶剂，超声15min；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，在氮气保护下加入催化剂CuBr 0.032g，随后反应体系抽真空-充氮气，除去反应体系中残余的氧气；封闭体系中注射加入PMDETA或联吡啶配体0.16mL，将烧瓶的温度控制在60℃低速搅拌反应4-6小时；反应结束后用DMF，H2O依次洗涤聚合物接枝的多孔Si，30℃真空干燥后置于干燥器中备用。其中对多孔硅胶基质的溴化处理参照文献(Qing et al.,2016)进行。
参考文献：
1.Qing,G.,Li,X.,Xiong,P.,Chen,C.,Zhan,M.,Liang,X.,&Sun,T.(2016).Dipeptide-BasedCarbohydrate Receptors and Polymers for GlycopeptideEnrichment and Glycan Discrimination.Acs Applied Materials&Interfaces,8(34),22084-22092.doi:10.1021/acsami.6b07863富集应用实例
实施例1
本发明可在固相萃取(SPE)模式或者离心模式下进行，具有操作简单，通量高和重复性好等优点。
蛋白酶解溶液的制备：1.0mg的牛胎球蛋白溶解在1mL碳酸氢铵溶液中(50mM,pH8.0)，按照胰蛋白酶与胎球蛋白的质量比1:40(w/w)的比例加入胰蛋白酶进行酶解，37℃反应12小时，得蛋白酶解液进行下述实验操作。
将上述1mg聚合物富集材料装入凝胶吸头中，1μL(1μg)蛋白酶解液上样后，分别用30μL的体积浓度70％乙腈/体积浓度0.1％甲酸的水溶液(pH＝3)(V/V)洗脱两次；然后用30μL含有体积浓度50％乙腈/体积浓度0.1％甲酸的水溶液(pH 3)溶液洗脱两次；最后用20μL体积浓度30％乙腈/体积浓度3％三氟乙酸溶液的水溶液(pH 2)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。
由图1和图2可见，牛胎球蛋白酶解产物中的非糖肽和糖肽可以依次从聚合物富集材料上洗脱下来。该结果说明采用本发明的聚合物富集材料得到的糖肽选择性好，可糖肽的个数多，说明聚合物修饰的多孔硅胶聚合物富集材料能特异性地富集和纯化糖肽。
实施例2-5
调整聚合物富集材料的重量分别为2mg、3mg、4mg、5mg，其他条件同实施例1，富集后得到的糖肽进行质谱分析，质谱结果均与实施例1相同，实验结果表明在萃取模式操作模式下只需1mg的聚合物富集材料即可以有效地保留和富集1μg牛胎球蛋白中的糖肽。
实施例7-8
调整牛胎球蛋白酶解液的上样量为0.5μg、2μg和4μg，其他条件同实施例1，富集后得到的糖肽进行质谱分析。质谱结果表明，随着上样量增大，1mg聚合物富集材料富集到的糖肽逐渐增多，然后基本不变。在2μg上样量条件下，质谱鉴定到的糖肽数量最多，丰度最高。实验结果表明在萃取模式操作模式下1mg的聚合物富集材料最多可以有效地保留和富集2μg的牛胎球蛋白中的糖肽。
实施例9-11
调整实施例1中第三步洗脱溶液的pH为3、4和5，其他条件同实施例1，进行选择性富集和质谱分析。质谱结果表明，随着洗脱溶液pH的增大，被洗脱下来的糖肽数量逐渐减少。当洗脱溶液pH为2时，能将更多的糖肽从聚合物富集材料上洗脱下来，故认为其最佳pH值条件。
实施例12
调整富集的操作模式为离心，将上述1mg聚合物富集材料装入离心管中，2μL(2μg)牛胎球蛋白酶解液溶于30μL的60％乙腈/体积浓度0.1％甲酸的水溶液(pH＝3)(V/V)并与材料混合，孵化5min，离心后收集上清液，沉淀再用60％乙腈/体积浓度0.1％甲酸的水溶液(pH 3)孵化5min，离心后合并上清液。沉淀与30μL含有5mM的甲酸铵的50％乙腈/体积浓度0.1％甲酸的水溶液(pH 3)(V/V)孵化5min，离心后收集上清液，重复此孵化和离心步骤，离心后合并上清液。各上清液直接在MALDI-TOF分析。
由图5和图6可见，牛胎球蛋白酶解产物中的非糖肽没有被聚合物富集材料保留，直接被洗脱出来(图5)；糖肽可以被聚合物富集材料保留，在较低pH值条件下可以洗脱出(图6)，说明聚合物富集材料能特异性的富集糖肽将其与非糖肽分离。
实施例13-16
调整聚合物富集材料的重量分别为2mg、3mg、4mg、5mg,其他条件同实施例12，富集后得到的糖肽进行质谱分析，质谱结果均与实施例1相同，实验结果表明在离心操作模式下只需1mg的聚合物富集材料即可以有效地保留和富集2μg的牛胎球蛋白中的糖肽。
实施例17-19
调整牛胎球蛋白酶解液的上样量为1μg、4μg、6μg，其他条件同实施例12，富集后得到的糖肽进行质谱分析。质谱结果表明，随着上样量增大，1mg聚合物富集材料富集到的糖肽逐渐增多，然后基本不变。在4μg上样量条件下，质谱鉴定到的糖肽数量最多，丰度最高。实验结果表明在离心操作模式下1mg的聚合物富集材料最多可以有效地保留和富集4μg的牛胎球蛋白中的糖肽。
实施例19-21
调整实施例12中第三步洗脱溶液的pH为3、4和5，其他条件同实施例12，进行选择性富集和质谱分析。质谱结果表明，随着洗脱溶液pH的增大，被洗脱下来的糖肽数量逐渐减少。当洗脱溶液pH为2时能将更多的糖肽从聚合物富集材料上洗脱下来，故认为其最佳pH值条件。
实施例22
蛋白酶解溶液的制备：1.0mg的α-酪蛋白溶解在1mL碳酸氢铵溶液中(50mM,pH8.0)，按照胰蛋白酶与胎球蛋白的质量比1:40(w/w)的比例加入胰蛋白酶进行酶解，37℃反应12小时，得蛋白酶解液进行下述实验操作。
将1mg聚合物修饰硅胶材料装入凝胶吸头中，1μL蛋白酶解液(其中含多肽1μg)上样后，分别用30μL的体积浓度为85％乙腈/0.1％甲酸(pH＝3)的水溶液洗脱两次；然后用30μL含有70％乙腈/0.1％甲酸(pH 3)的水溶液洗脱两次；最后用20μL50％乙腈/3％三氟乙酸(pH 2)的水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。上述整个过程在20℃条件下进行。
由图3和图4可见，α-酪蛋白酶解产物中的非磷酸化肽和磷酸化肽可以依次从聚合物富集材料上洗脱下来。这说明采用本发明的聚合物富集材料得到的磷酸化肽选择性好，可富集到的磷酸化肽的个数多，说明聚合物修饰的多孔硅胶聚合物富集材料能特异性地富集和纯化磷酸化肽。
实施例22-25
调整聚合物富集材料的重量分别为2mg、3mg、4mg、5mg，其他条件同实施例22，富集后得到的磷酸化肽进行质谱分析，质谱结果均与实施例1相同，实验结果表明在萃取模式操作模式下1mg的材料即可以有效地保留和富集1μg的α-酪蛋白中的磷酸化肽。
实施例25-27
调整α-酪蛋白酶解液的上样量为2μg、4μg和8μg，其他条件同实施例22，富集后得到的磷酸化肽进行质谱分析。质谱结果表明，随着上样量增大，1mg聚合物富集材料富集到的磷酸化肽逐渐增多，然后基本不变。在2μg上样量条件下，质谱鉴定到的磷酸化肽数量最多，丰度最高。实验结果表明在固相萃取模式操作模式下1mg的材料最多可以有效地保留和富集2μg的α-酪蛋白中的磷酸化肽。
实施例27-29
调整最后一步洗脱磷酸化肽时的洗脱溶液的pH为3、4和5，其他条件同实施例22，进行选择性富集和质谱分析。质谱结果表明，随着洗脱溶液pH的增大，被洗脱下来的糖肽数量逐渐减少。质谱结果表明当洗脱溶液pH为2时能将更多的磷酸化肽从聚合物富集材料上洗脱下来，故认为其最佳pH值条件。
实施例30
调整富集的操作模式为离心，将1mg聚合物富集材料装入离心管中，2μL(其中含多肽2μg)α-酪蛋白酶解液溶于30μL的30％CH3CN/0.1％甲酸的水溶液(pH＝3)并与材料混合，孵化5min，离心后收集上清液，沉淀再用30％乙腈/0.1％甲酸的水溶液(pH 2)孵化5min，离心后合并上清液。沉淀与30μL含有5mM的甲酸铵的50％CH3CN/0.1％甲酸的水溶液(pH 2)孵化5min，离心后收集上清液，重复此孵化和离心步骤，离心后合并上清液；最后沉淀与30μL含有20mM的甲酸铵的80％CH3CN/0.1％甲酸的水溶液(pH 2)孵化5min，离心后收集上清液。各上清液直接在MALDI-TOF分析。
由图7和图8可见，α-酪蛋白产物中的非磷酸化肽没有被聚合物富集材料保留，直接被洗脱出来(图7)；而磷酸化肽可以被聚合物富集材料保留，并在较低pH值条件下可以洗脱出(图8)，说明聚合物富集材料能特异性的富集磷酸化肽将其与非磷酸化肽分离。
实施例31-34
调整聚合物富集材料的重量分别为2mg、3mg、4mg、5mg,其他条件同实施例30，富集后得到的磷酸化肽进行质谱分析，质谱结果均与实施例1相同，实验结果表明在离心操作模式下1mg的材料即可以有效地保留和富集2μg的α-酪蛋白中的磷酸化肽。
实施例35-37
调整α-酪蛋白酶解液的上样量为4μg、6μg和8μg，其他条件同实施例30，富集后得到的磷酸化肽进行质谱分析。质谱结果表明，随着上样量增大，1mg聚合物富集材料富集到的磷酸化肽逐渐增多，然后基本不变。在4μg上样量条件下，质谱鉴定到的磷酸化肽数量最多，丰度最高。实验结果表明在离心操作模式下1mg的材料最多可以有效地保留和富集4μg的α-酪蛋白中的磷酸化肽。
实施例38-40
调整最后一步洗脱磷酸化肽时的洗脱溶液的pH为3、4和5,其他条件同实施例30，进行选择性富集和质谱分析。质谱结果表明，随着洗脱溶液pH的增大，被洗脱下来的磷酸化肽数量逐渐减少。实验结果表明在离心操作模式下，后一步洗脱溶液pH为2时可以洗脱出更多的磷酸化肽，是为最佳pH条件。
综上所述，本发明的聚合物富集材料对于糖肽和磷酸化肽具有很好的选择性富集性能，和常规的聚合物富集材料相比，聚合物修饰多孔硅胶富集糖肽和磷酸化肽具有更高选择性，更高糖肽、磷酸化肽回收率和更好的重复性。本发明的同时富集、在线酶切、分步洗脱方法对于糖肽和磷酸化肽具有高效同时分析能力，同时鉴定到糖基化和磷酸化的信息，可以将其应用于复杂体系中糖肽和磷酸化肽的选择性分离富集分析，结合质谱，该材料在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的应用前景。

Claims (9)

1.一种同时富集、在线酶切分离糖肽和磷酸化肽的方法，其特征在于，该方法是将聚合物富集材料与糖蛋白酶解物、磷酸化蛋白酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式同时富集糖肽和磷酸化肽，并在线对糖肽进行酶切，实现糖肽和磷酸化肽的分步洗脱并进行质谱分析；所述糖肽和磷酸化肽同时聚合物富集材料是组氨酸类功能单体接枝到聚合物主链上，并通过聚合物主链进一步连接到基质材料上或者组氨酸类功能单体聚合到基质材料上，得到聚合物富集材料；
其中，组氨酸类功能单体为组氨酸及组氨酸衍生物中的任意一种或二种以上。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚合物富集材料结构示意为：
Figure FDA0002190859880000011
其中M为基底材料，其中R包括但不限于羟基、氨基、甲氧基、乙氧基中的一种或二种以上；所述聚合度n的范围为2-200。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述聚合物富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合，将带有组氨酸类功能单体的聚合物经单体在基底材料表面经过聚合所得。
4.按照权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述基底材料包括但不限于下述材料中的任意一种或者两种以上任意比例的混合
多孔材料中的多孔SiO2、多孔Al2O3、多孔TiO2或多孔ZrO2；以及表面涂覆有多孔材料(多孔SiO2、多孔Al2O3、多孔TiO2或多孔ZrO2中的一种或者两种以上)的Si、Au或Fe3O4；其中多孔基底材料的粒径是0.2-50μm；多孔材料的孔径为
Figure FDA0002190859880000012
涂覆层的厚度1-20nm。
5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述聚合物主链包括但不限于聚乙烯、聚乙二胺、聚乙二醇、聚丙烯酸或聚丙烯酰胺中的任意一种或二种以上。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚合物富集材料组氨酸类功能单体与基底物质的质量比范围为1:0.1-200，其中优先选择组氨酸类功能单体与基底物质的质量比范围为1:1-100。
7.按照权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：同时富集、在线酶切分离具体操作采用固相萃取模式(SPE)或分散固相萃取模式(dSPE)同时富集糖肽和磷酸化肽；
在SPE模式下同时富集糖肽和磷酸化肽时，将样品上到填装有聚合物富集材料的SPE柱上，采用淋洗流动相冲洗材料，去除其上的非糖肽和非磷酸化肽；再将结合有糖肽和磷酸化肽的材料加入PNGase F酶，切掉糖肽上的糖链，释放出切掉糖链的糖肽；再采用不同洗脱流动相洗脱，分步洗脱去糖链的糖肽段和磷酸化肽；或在dSPE模式下富集纯化糖肽和磷酸化肽时，将样品直接与基于组氨酸的聚合物材料混合，离心，弃去上清液；采用淋洗流动相冲洗材料，离心，去除其上的非糖肽和非磷酸化肽；再将结合有糖肽和磷酸化肽的材料加入PNGase F酶切掉连有糖链的肽段；再采用不同洗脱流动相冲洗，离心，分步收集去糖肽段和磷酸化肽。
8.按照权利要求7所述方法，其特征在于：1)样品的上样量与材料的质量比例为1:5-200；2)富集和分离温度为10-60℃；3)淋洗流动相和洗脱流动相的体积为3-1000倍的材料体积；4)PNGase F用量与样品的上样量质量比例为：1:10-50；5)PNGase F酶切温度为10-60℃；6)PNGase F酶切反应溶剂的体积为3-1000倍的材料体积；7)PNGase F酶切反应时间为1-24h。
9.按照权利要求7或8所述方法，其特征在于：
1)淋洗流动相的流动相组成如下a-f任一之一所示：
a.A相为水，B相为乙腈，体积比A/B:10/90-40/60；
b.A相为水，B相为甲醇，体积比A/B:10/90-40/60；
c.A相为甲酸铵水溶液(pH 3-6)，B相为乙腈，体积比A/B:5/95-40/60；
d.A相为甲酸铵水溶液(pH 3-6)，B相为甲醇，体积比A/B:5/95-40/60；
e.A相为甲酸水溶液(pH 2-4)，B相为乙腈，体积比A/B:5/95-40/60；
f.A相乙酸水溶液(pH 2-4)，B相为甲醇，体积比A/B:5/95-40/60；
2)洗脱流动相的溶剂组成如下a-f任一之一所示：
a.A相为水，B相为乙腈，体积比A/B:40/60-100/0；
b.A相为水，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；
c.A相为氨水水溶液(pH 8-11)，B相为乙腈，体积比A/B:40/60-100/0；
d.A相为碳酸氢铵水溶液(pH 7-9)，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；
e.A相为乙酸铵水溶液(pH 5-7)，B相为乙腈，体积比A/B:40/60-100/0；
f.A相为磷酸氢钾水溶液(pH 8-10)，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；
其中缓冲盐溶液浓度1-200mM；
3)PNGase F酶切反应的溶剂组成如下a-c任一之一所示：
a.A相为磷酸氢钾水溶液(pH 7-9)，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；
b.A相为碳酸氢铵水溶液(pH 7-9)，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；
c.A相为Tris(三羟甲基氨基甲烷)水溶液(pH 7-9)，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；其中缓冲盐溶液浓度1-200mM。
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