CN105254707B

CN105254707B - 基于二肽的聚合物材料及其在糖分离和糖肽富集中的应用

Info

Publication number: CN105254707B
Application number: CN201510688901.9A
Authority: CN
Inventors: 孙涛垒; 梁鑫淼; 卿光焱; 李秀玲
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS; Wuhan University of Technology WUT
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS; Wuhan University of Technology WUT
Priority date: 2015-10-21
Filing date: 2015-10-21
Publication date: 2019-05-24
Anticipated expiration: 2035-10-21
Also published as: CN105254707A

Abstract

本发明涉及一种对糖具有优异区分能力的二肽功能单体的筛选方法，构筑了基于标准偏离参数D和R值筛选后得到的二肽化合物，并进一步将筛选获得的二肽化合物与含双键的基团偶联，得到可聚合的二肽功能单体，将它们聚合到各种基体表面上，得到了一系列聚合物修饰的色谱固定相材料。该材料展现出对寡聚半乳糖，寡聚果糖，唾液酸衍生物优异的分离能力；同时该材料对于糖肽具有优异的选择性富集性能和对糖链结构的区分能力，同时具有很高的糖肽回收率和重复性，在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域将具有广阔的应用前景。

Description

基于二肽的聚合物材料及其在糖分离和糖肽富集中的应用

技术领域

本发明属于材料化学领域，尤其涉及一种基于二肽的聚合物材料及其在糖分离和糖肽富集中的应用。

背景技术

蛋白质的糖基化修饰调控真核细胞许多重要的生物过程，包括免疫应答、细胞粘附和穿行。许多疾病的发生与蛋白质糖基化的变异有关。另外，现有的肿瘤标志物和蛋白类药物绝大多数都是糖蛋白。由此，对糖蛋白的结构进行表征非常重要。但是，糖肽在生物样品中浓度很低(人体中高丰度蛋白中前22种蛋白约占血浆蛋白总量的99％，糖蛋白的含量大致是千分之一)，加上在质谱中非糖肽(特别是白蛋白和免疫球蛋白)的离子抑制作用使得糖肽难于检测；因此，在质谱分析前对糖肽进行选择性富集非常重要。

目前，糖蛋白组学研究的技术策略主要集中在肽段水平上。已有的富集糖肽的策略包括凝集素亲和色谱法、肼化学法、硼酸亲和色谱法及亲水作用色谱法等。这些方法都有固有的局限性。如凝集素亲和作用色谱存在糖基化覆盖率低的问题[Kubota,etal.Anal.Chem.2008]；肼化学对糖肽的选择性高，但破坏了糖链结构，导致糖链生物学信息的丢失[Zhang,H.；et al.Nat.Biotechnol.2003]；亲水作用色谱对糖肽具有普适性，但是选择性很低，无法实现对复杂生物样品进行全面的糖蛋白组学鉴定。

因此，研发一种新型高选择性且高吸附量的糖肽分离富集材料成为本领域技术人员的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种高选择性且高吸附量的基于二肽的聚合物材料及其在糖分离和糖肽富集中的应用。

本发明为解决上述技术问题所采用的方案为：

二肽化合物，其通过以下方法筛选获得：

1)测定N种具有不同组合方式的二肽序列与7种代表性单糖之间的结合能力，获得N组结合常数测定值Ka’，每组结合常数测定值的数目为7个，将每组的所述7个结合常数测定值分别减去其中的结合常数测定值的最小值，然后再将分别减去最小值后得到的7个数值以最大值和最小值间的差值作归一化处理，分别得到S1’至S7’，将S1’至S7’由小至大排布，得到结合常数的测定值分布；

2)提供一组归一化后的结合常数的理想Ka值的分布，其数值分布为：0，1/6，1/3，1/2， 2/3，5/6，1，这些数值在(0,1)区间内呈现出均等排布；

3)计算标准偏离参数D，所述标准偏离参数D代表结合常数的测定值分布与结合常数的理想值分布之间的偏差，共计N个D值，其具体定义如下：

4)计算步骤1)得到的每组结合常数测定值中结合力最大值与结合力最小值的比值R，共计N个R值；

5)以每种二肽序列的亲水值作为XY坐标轴中的x值，以每种二肽序列对应的D值作为XY坐标轴中的y值确定一个点，从而得到具有N个离散点的D值分布图，选取亲水值为-1.5至0且D为0至15之间的点对应的多种二肽序列；

6)以每种二肽序列的亲水值作为XY坐标轴中的x值，以每种二肽序列对应的R值作为XY坐标轴中的y值确定一个点，从而得到具有N个离散点的R值分布图，选取亲水值为-1.5至0且R为5至20之间的点对应的多种二肽序列；

7)选取步骤5)得到的多种二肽序列和步骤6)得到的多种二肽序列中相同的二肽序列，从而得到所述二肽化合物；

其中，N为26×26；所述7种单糖如下所示：

上述方案中，当所述单糖为唾液酸Neu5Ac时，得到N个结合常数的测定值，以每种二肽序列的亲水值作为XY坐标轴中的x值，以每种二肽序列对应的结合常数的测定值Ka作为XY坐标轴中的y值确定一个点，从而得到具有N个离散点的Ka值分布图，选取亲水值为-1.5至0且Ka 为(5-30)×10³L/mol之间的点对应的多种二肽序列。

上述方案中，所述二肽化合物为：

二肽功能单体，其由二肽化合物中的一个氨基键合一个含双键的基团得到。

基于二肽的聚合物材料，将所述的二肽功能单体通过双键聚合到基质的表面上，从而得到具有功能表面的所述聚合物材料。

上述方案中，所述基质为氧化物多孔材料、无机半导体材料、金属材料或金属氧化物材料。

所述的基于二肽的聚合物材料在分离单糖、二糖、三糖、寡聚多糖、唾液酸类单糖或多糖中的应用。

所述的基于二肽的聚合物材料在富集和纯化糖肽或糖蛋白，以及具有不同糖链结构、糖链异构体的糖肽分离中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明开发了一种基于结合常数测定和分析的组合化学筛选策略，开发了多种二肽化合物，再将双键(如丙烯酰基)接枝在这些二肽末端，进一步通过表面引发—原子转移自由基聚合的方法，将二肽功能单体接枝到各种材料基底上，得到多种均聚的聚合物色谱分离材料。通过亲水分离模式，由这些二肽聚合物填料装填的液相分析色谱柱，展现出了对单糖、二糖、寡聚多糖、唾液酸类多糖优异的分离能力。进一步将聚合物修饰的材料与柱固相萃取模式或分散固相萃取模式有机地结合，可以从复杂生物样本中实现对糖肽的高选择性、高重复性和高通量的富集，能够从1000倍的牛血清白蛋白干扰中，准确而高效地提取出目标糖肽。此外该材料还能够区分出具有不同糖链结构，糖链异构体的糖肽链片段，为糖蛋白质组学分析提供了丰富的信息。由于这些优势，基于此类聚合物材料开发的富集方法学，可以显著提高糖蛋白鉴定数目，有望在复杂人体组织样本中大批量富集糖肽，并构筑同位素定量分析方法对目标糖肽进行准确的分析鉴定，进而在大规模分离纯化糖蛋白等领域获得广泛的应用。

附图说明

图1为理想情况下的结合常数(Ka)分布和实际测量得到的结合常数(Ka’)分布。

图2为结合常数的离散分布偏离指数(D)与二肽亲水值之间的关系。

图3为结合常数最大值与最小值的比值(R)与二肽亲水值之间的关系。

图4为针对唾液酸的结合常数Ka与二肽亲水值之间的关系。

图5为以丙烯酰胺化Pro-Asp，Pro-Glu，Tyr-Asp为例的合成步骤图。

图6为Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶的热重分析曲线。

图7为Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶的等温吸附曲线。

图8为Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶的XPS碳元素组成。

图9为Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶的XPS氮元素组成。

图10为Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶的Zeta电势与pH值的关联。

图11为Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶的扫描电镜照片。

图12为Pro-Asp聚合物修饰的色谱材料对寡聚半乳糖混合物的分离色谱图。

图13为Pro-Asp或Pro-Glu聚合物修饰的色谱材料对寡聚果糖混合物的分离色谱图。

图14为Pro-Asp聚合物修饰的色谱材料对两种连接方式不同的唾液酸三糖的分离色谱图。

图15为基于Pro-Asp聚合物色谱固定相材料的结构图。

图16为Pro-Asp聚合物材料对糖肽的富集效果图。

图17为Asp-Tyr聚合物材料对糖肽的富集效果图。

图18为Pro-Glu聚合物修饰的色谱材料对糖肽的分离色谱图。

具体实施方式

为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。

实施例中所用原料及设备:

硅片由Silicon Materials Corporation(Germany)购得，HPLC柱色谱填料硅胶(氨基修饰)由富士硅胶(上海)公司购得。CuBr(99.999％),N,N,N’,N’,N”-Pentamethyl-diethylenetriamine(PMDETA)，联吡啶，吡啶，丙烯酰氯由Sigma-Aldrich公司购得。丙酮，甲醇，DMF，氢氧化钠由Alfa公司购得。各种序列的二肽，从上海强耀生物科技有限公司购得。其他试剂均使用市售分析纯。¹H和¹³C NMR图谱在Bruker ARX300spectrometer检测获得。

实施例1

本实施例提供二肽化合物，其通过以下方法筛选获得：

第一步：测定54种具有不同组合方式的二肽序列与7种代表性单糖之间的结合能力，获得 54组结合常数测定值Ka’，每组结合常数测定值的数目为7个，将每组的所述7个结合常数测定值分别减去其中的结合常数测定值的最小值，然后再将分别减去最小值后得到的7个数值以最大值和最小值间的差值作归一化处理，分别得到S1’至S7’，将S1’至S7’由小至大排布，得到结合常数的测定值分布，请参见图1。

在本实施例中，N选取为54，主要是根据氨基酸的亲水特性以及氨基酸原料的可获得性等因素选取。可以理解的是，其余种类的氨基酸组成的二肽序列均可参照此方法进行筛选从而获得二肽化合物。

7种代表性单糖的结构式如下：

此外，表1列举了常见氨基酸的名称、英文缩写以及Eisenberg亲水值。下文中出现的氨基酸均以表1中提到的缩写形式出现。

表1

第二步：提供一组归一化后的结合常数的理想Ka值的分布，其数值分布为：0，1/6，1/3，1/2，2/3，5/6，1，这些数值在(0,1)区间内呈现出均等排布，请参见图1。

第三步：计算标准偏离参数D，所述标准偏离参数D代表结合常数的测定值分布与结合常数的理想值分布之间的偏差，共计54个D值，显然，这一数值越小，对七个样本的分离能力越好。其具体定义如下：

第四步：计算步骤1)得到的每组结合常数测定值中结合力最大值与结合力最小值的比值R，共计54个R值。

在本实施例中，以Pro-Asp组合的二肽序列为例，详细说明D和R值的计算方法。

表2为Pro-Asp二肽序列与7种单糖的结合常数测定值Ka’。

表2

将每组的所述7个结合常数测定值分别减去其中的结合常数测定值的最小值，然后再将分别减去最小值后得到的7个数值以最大值和最小值间的差值作归一化处理，分别得到S1’至S7’，将S1’至S7’由小至大排布，得到结合常数的测定值分布。在本实施例中，如表2所示，结合常数测定值的最小值为1260，最大值和最小值间的差值为15150-1260＝13890。故将7个结合常数测定值Ka’分别减去其中的结合常数测定值的最小值Ka’_最小值，并按从小到大排序，结果如表3所示：

表3

Ka’-Ka’<sub>最小值</sub>	S1’至S7’
		0	0
1320	0.095032397
		5430	0.390928726
7140	0.514038877
		9300	0.669546436
11280	0.812095032
		13890	1

然后根据公式：

可得到D值4.267351947。

R值Ka’_最大值/Ka’_最小值为15150/1260＝12.02380952。

第五步：以每种二肽序列的亲水值作为XY坐标轴中的x值，以每种二肽序列对应的D值作为XY坐标轴中的y值确定一个点，从而得到具有54个离散点的D值分布图，选取亲水值为-1.5至0且D为0至15之间的点对应的多种二肽序列，如图2所示。

在本发明中，二肽序列的亲水值为两种氨基酸的Eisenberg亲水值(如表1所示)的加和值。

第六步：以每种二肽序列的亲水值作为XY坐标轴中的x值，以每种二肽序列对应的R值作为XY坐标轴中的y值确定一个点，从而得到具有54个离散点的R值分布图，选取亲水值为-1.5至0且R为5至20之间的点对应的多种二肽序列，如图3所示。

第七步：选取第五步得到的多种二肽序列和第六步得到的多种二肽序列中相同的二肽序列，从而得到所述二肽化合物。

下面四组二肽化合物即为根据本方法筛选得到，可以理解的是，通过该方法还可以筛选得到其他符合条件的二肽化合物，在此不再一一列举。

如图4所示，当单糖为7种单糖当中的唾液酸时，构建的是54种二肽序列针对唾液酸的结合常数与二肽亲水值之间的关联图，发明人可以根据此方法筛选得到多种对唾液酸具有强结合能力的二肽序列，即亲水值为-1.5至0且Ka为(5-30)×10³L/mol之间的点对应的多种二肽序列，其对唾液酸类物质具有很强的结合能力。

实施例2

丙烯酰胺化二肽功能单体的制备(以Pro-Asp,Pro-Glu,Tyr-Asp为例)：

冰浴条件下，将1.15g(5mmol)Pro-Asp和1.01g(5mmol)三乙胺溶解在30mL无水氯仿/DMF(体积比：1:1)的混合溶液中,搅拌条件下，将0.453g(5mmol)丙烯酰氯逐滴滴加至上述溶液中，滴加完后升至室温继续反应6小时。反应结束后用30mL纯水萃取反应液4次，合并水相溶液，减压蒸馏除去大部分水后继续冻干。粗产品用液相色谱进行分离纯化，使用了C18反相半制备色谱柱，在反相模式下进行分离。最终获得0.92g白色粉末，产率65％。产物的结构通过核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱进行了表征鉴定。具体的合成步骤如图5所示。

丙烯酰胺化Pro-Asp表征数据：

¹H NMR(300MHz,D₂O):δ(ppm):1.92-1.99(m,1H,Pro-C*-CH,2H,Pro-C-CH₂),2.22-2.27(m,1H,Pro-C*-CH),2.92(d,J＝3Hz,2H,CH₂-COOH),3.64-3.73(m,2H,Pro-NCH₂),4.44-4.46(m,1H,*H_b),4.63-4.65(m,1H,*H_a),5.77(d,J＝9Hz,1H,C＝CH₂),6.16(d,J＝9Hz,1H,C＝CH₂),6.54and 6.57(dd,J₁＝J₂＝6Hz,1H,CH＝C)；¹³C NMR(300MHz,D₂O):δ(ppm):24.3,29.5,35.5,48.0,49.0,60.4,128.0,129.1,167.2,173.8,174.2,174.3；IR:3327,3083,2948,2886,1723,1638,1566,1546,1447,1391,1340,1285,1200,1158,1061,975,882,794,694cm^-1；Elemental analysis,calcd.(％)for C₁₂H₁₆N₂O₆:C,50.70；H,5.67；N,9.85；foundC,50.63；H,5.72；N,9.78；MADLI MS:m/z calcd for C₁₂H₁₆N₂O₆:284.10；found:285.1242[M+H]⁺.

丙烯酰胺化Pro-Glu表征数据：

¹H NMR(300MHz,D₂O):δ(ppm):1.92-1.95(m,2H,Pro-C*-CH,2H,Pro-C-CH₂),2.15-2.23(m,2H,C-CH₂),2.41-2.47(m,2H,CH₂-COO),3.65-3.67(m,2H,Pro-NCH₂),4.36-4.39(m,1H,*H_b),4.41-4.43(m,1H,*H_a),5.75(d,J＝6Hz,1H,C＝CH₂),6.13(d,J＝12Hz,1H,C＝CH₂),6.52and 6.57(m,1H,CH＝C)；¹³C NMR(300MHz,D₂O):δ(ppm):24.3,25.7,29.5,29.9,48.1,51.9,60.4,128.0,129.1,167.1,174.5,174.8,177.0；IR:3311,2953,2887,1941,1717,1640,1568,1448,1388,1345,1295,1202,1163,1063,977,918,848,796,698,602cm^-1；Elemental analysis,calcd.(％)for C₁₃H₁₈N₂O₆:C,52.35；H,6.08；N,9.39；found C,52.25；H,6.15；N,9.31；MADLI MS:m/z calcd for C₁₃H₁₈N₂O₆:298.10；found:298.2556[M+H]⁺.

丙烯酰胺化Tyr-Glu表征数据：

¹H NMR(300MHz,D₂O):δ(ppm):2.78and 2.81(dd,J₁＝J₂＝3Hz,1H,CH-COOH),2.85and2.89(dd,J₁＝J₂＝3Hz,1H,CH-COOH),2.90and 2.93(dd,J₁＝J₂＝3Hz,1H,Ar-CH),3.02and 3.05(dd,J₁＝J₂＝3Hz,1H,Ar-CH),4.58-4.61(m,1H,*H_b),4.63-4.65(m,1H,*H_a),5.69(d,J＝9Hz,1H,C＝CH),6.08(d,J＝12Hz,1H,C＝CH),6.17and 6.21(dd,J₁＝J₂＝9Hz,1H,C＝CH),6.77(d,J＝6Hz,2H,Ar-H),7.09(d,J＝6Hz,2H,Ar-H)；¹³C NMR(300MHz,D₂O):δ(ppm):35.5,36.2,49.1,55.1,115.5,128.1,128.2,129.3,130.5,154.4,168.2,172.9,173.6,174.3；IR:3253,2996,2946,2825,2716,1665,1517,1471,1428,1397,1364,1265,1237,1180,1130,1071,1026,932,896,831,800,718cm^-1；Elemental analysis,calcd.(％)for C₁₆H₁₈N₂O₇:C,54.86；H,5.18；N,8.00；found C,54.74；H,5.26；N,7.93；MADLI MS:m/zcalcd for C₁₆H₁₈N₂O₇:350.11；found:352.1505[M+2H]⁺.

实施例3

二肽类聚合物在平面基底上的接枝方法：

以聚合Pro-Asp为例，在25mL的烧瓶中加入1.0g丙烯酰胺化Pro-Asp，同时加入3mLH₂O，3mL CH₃OH以及3mL DMF作溶剂；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，在氮气保护下加入催化剂CuBr 0.032g以及PMDETA或联吡啶配体0.16mL，随后反应体系抽真空—充氮气，除去反应体系中残余的氧气；将溴化处理过的Si,、SiO_2、Au、Ag、Pt、CuO、Al₂O₃、TiO₂、ZrO₂或Fe₃O₄表面浸入配置好的反应溶液；将烧瓶的温度控制在60℃静置反应4-6小时；反应结束后用DMF，H₂O依次洗涤聚合物接枝表面，得到Pro-Asp二肽聚合物材料修饰的表面，此聚合物表面的厚度为10-50nm，氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。使用相同的方法聚合可以得到其他二肽组成的聚合物材料薄膜表面。

实施例3

二肽类聚合物材料在多孔材料上的接枝方法：

以在多孔硅胶上聚合Pro-Asp为例，在25mL的烧瓶中3.0g丙烯酰胺化Pro-Asp，同时加入5mL H₂O，5mL CH₃OH以及5mL DMF作溶剂；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，加入1.5g溴化处理后的多孔硅胶或其他多孔材料，同时补充加入5mL H₂O以及5mL DMF作溶剂，超声15min；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，在氮气保护下加入催化剂CuBr0.032g，随后反应体系抽真空-充氮气，除去反应体系中残余的氧气；封闭体系中注射加入PMDETA或联吡啶配体0.16mL，将烧瓶的温度控制在60℃低速搅拌反应4-6小时；反应结束后用DMF，H₂O依次洗涤聚合物接枝的多孔硅胶，30℃真空干燥后置于干燥器中备用。使用相同的方法可以制备不同颗粒尺寸(包括硅胶粒径，孔径)、不同二肽序列修饰的硅胶样品，用作糖肽富集和分离柱的填充材料。

实施例4

以Pro-Asp聚合修饰的多孔硅胶为例，申请人通过热重分析，BET等温吸附曲线，表面电子能谱，Zeta电势，扫描电子显微镜等手段，对制备的材料进行了充分的表征，如图6-11所示。

图6为多孔硅胶修饰Pro-Asp聚合物前后的热重分析曲线。黑色表示未修饰聚合物的硅胶；灰色表示聚合物修饰后的硅胶。

图7为多孔硅胶修饰Pro-Asp聚合物前后的BET等温吸附曲线。黑色表示未修饰聚合物的硅胶；灰色表示聚合物修饰后的硅胶。

实施例5

以Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶作为色谱填充材料，装填出一只直径4.6mm，长度250mm的色谱分析柱，评价了其对寡聚半乳糖(图12)、寡聚果糖(图13)，唾液酸衍生物(图14)的分离能力。实验结果表明，二肽聚合物材料展现出对寡聚半乳糖、寡聚果糖、唾液酸衍生物优异的分离能力。

图12中的分离条件为：流动相：水/乙腈混合溶剂，梯度洗脱：0—20分钟(80％—70％乙腈)；20-25分钟(70％—50％乙腈)，温度：20℃，流速1.0mL/min，柱压30兆帕，进样量6微升。色谱峰上对应的数字表示的是寡聚半乳糖的聚合度数值。

图13为Pro-Asp(上图)或Pro-Glu(下图)聚合物修饰的色谱材料对寡聚果糖混合物的分离色谱图。分离条件为：流动相：水/乙腈混合溶剂，梯度洗脱：0—20分钟(80％—70％乙腈)；20-25分钟(70％—50％乙腈)，温度：20℃，流速1.0mL/min，柱压30兆帕，进样量10微升。色谱峰上对应的数字表示的是寡聚果糖的聚合度数值。

图14为Pro-Asp聚合物修饰的色谱材料对两种连接方式不同的唾液酸三糖的分离色谱图。分离条件为：流动相：H₂O/CH₃CN混合溶剂，梯度洗脱：0—25分钟(85％—75％乙腈)，25—40分钟(75％—50％乙腈)，温度：20℃，流速1.0mL/min，柱压30兆帕，进样量2微升。

实施例6

按实施例3所述方法将Pro-Asp二肽聚合接枝到多孔硅胶表面，然后以其为柱填料制成SPE柱备用。固定相结构如图15所示。

实施例7

样品溶液的制备：1.0mg的糖蛋白溶解在1mL碳酸氢铵溶液中(50mM,pH 8.0)，按照胰蛋白酶与糖蛋白的质量比1:40(w/w)的比例加入胰蛋白酶进行酶解，37℃反应12小时，所得蛋白酶解液进行下述实验操作。

以Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶作为富集材料，在SPE模式下富集糖肽。将1mg聚合物修饰材料装入凝胶吸头中，1μL(40pmol)蛋白酶解液上样后，分别用30μL的体积浓度85％乙腈/0.1％甲酸(pH 3)洗脱两次；然后用30μL含有80％乙腈/0.1％甲酸(pH3)溶液洗脱两次；最后用20μL50％乙腈/2％氨水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。由图16可见，胎球蛋白(fetuin)解产物中的糖肽被可以被从聚合物修饰材料上洗脱下来；即使在高达500倍牛血清蛋白的干扰下，聚合物修饰硅球对糖肽选择性依然不变，说明聚合物修饰材料能特异性的富集糖肽。

图16为标准糖蛋白fetuin(20pmol)与牛血清蛋白(BSA)酶解产物中糖肽经过Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶富集后的ESI-MS谱图。(a)fetuin：BSA＝1:500(摩尔比)。图中黑色五角星代表糖肽，非糖肽直接用数值表示。

实施例8

以Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶作为富集材料，调整富集的操作模式为离心，将1mg聚合物修饰材料装入离心管中，2μL(80pmol)fetuin解液溶于50μL5mM的甲酸铵的80％CH₃CN/0.1％甲酸溶液(pH 3)并与材料混合，孵化5min,离心后收集上清液，重复此孵化和离心步骤，离心后合并上清液；最后沉淀与50μL含有20mM的甲酸铵的50％CH₃CN/0.1％甲酸(pH 3)孵化5min,离心后收集上清液。各上清液直接在MALDI-TOF分析。

实施例9

调整Pro-Asp聚合物修饰的多孔硅胶的重量为2mg、3mg、4mg、5mg,其他条件同实施例7，富集后得到的糖肽进行质谱分析，实验结果表明在萃取模式操作模式下1mg的材料可以有效地保留和富集80pmol的糖蛋白中的糖肽。

实施例10

调整fetuin解液的上样量为20pmol、40pmol和160pmol,其他条件同实施例7，富集后得到的糖肽进行质谱分析，实验结果表明在萃取模式操作模式下1mg的材料可以有效地保留和富集80pmol的糖蛋白中的糖肽。

实施例11

调整富集材料为Pro-Glu,Tyr-Asp和Asp-Tyr聚合物修饰的多孔硅胶,其他条件同实施例7，进行糖肽选择性富集和质谱分析。实验结果表明Pro-Glu，Tyr-Asp，Asp-Try聚合物修饰的多孔硅胶材料，分别能够从100倍，1000倍，500倍的牛血清蛋白干扰物中，准确地提取出目标糖肽。抗干扰倍数越高，表明材料的富集选择性越好。以Asp-Tyr为例，图17说明。

图17为标准糖蛋白fetuin(20pmol)与牛血清蛋白(BSA)酶解产物中糖肽经过Asp-Tyr聚合物修饰的多孔硅胶富集后的ESI-MS谱图。(a)fetuin：BSA＝1:500(摩尔比)。图中黑色五角星代表糖肽，非糖肽直接用数值表示。这一数据表明，依据发明人提供的二肽筛选策略，能够获得多种高效的聚合物基富集材料，应用于糖蛋白质组学的分析中。

实施例12

以Pro-Asp聚合物修饰的TiO₂、Al₂O₃和ZrO₂作为富集材料，其他条件同实施例7，进行糖肽选择性富集和质谱分析。实验结果表明Pro-Asp聚合物修饰的TiO₂、Al₂O₃和ZrO₂材料能够从500倍牛血清蛋白干扰物中，准确地提取出目标糖肽。

实施例13

以Pro-Asp聚合物修饰的介孔材料MCM41、SAB作为富集材料，其他条件同实施例7，进行糖肽选择性富集和质谱分析。实验结果表明Pro-Asp聚合物修饰的介孔材料MCM41、SAB材料能够从500倍牛血清蛋白干扰物中，准确地提取出目标糖肽。

实施例14

调整洗脱溶液的pH为4、5和6,其他条件同实施例7，进行选择性富集和质谱分析。实验结果表明针对不同种类的二肽聚合物材料，调整洗脱液的pH值，能够获得更高的富集选择性和吸附容量。

实施例15

以Pro-Glu聚合物修饰的二氧化硅色谱填充材料，装填出一只直径4.6mm，长度250mm的色谱分析柱，评价了色谱柱对不同糖型结构糖肽的分离能力，同时还能够区分糖肽链异构体，如图18所示。

图18为Pro-Glu聚合物修饰的色谱材料对糖肽的分离色谱图。流动相：水/乙腈混合溶剂，梯度洗脱：0—20分钟(80％—70％乙腈)；20-45分钟(70％—50％乙腈)，温度：20℃，流速1.0mL/min，柱压30兆帕，进样量10微升。上图和下图所示的糖肽具有相同的肽链序列(P06)，但是它们垂挂的糖链结构却有轻微的区别，Pro-Glu聚合物色谱固定相展现出了对四分支型糖肽(下图)更强的色谱保留能力。与此同时，材料还能够清晰地区分出两至三种糖肽异构体，如图中箭头所示。

本发明聚合物修饰材料对于糖肽具有很好的选择性富集性能，和常规的亲水材料相比，聚合物修饰材料富集糖肽具有更高选择性，更高糖肽回收率和更好的重复性。利用聚合物修饰材料对于糖肽的高效的特异性吸附能力，可以将其应用于复杂体系中糖肽的选择性分离富集，结合质谱，该材料在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的应用前景。

Claims

1.一种二肽化合物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）测定N种具有不同组合方式的二肽序列与7种代表性单糖之间的结合能力，获得N组结合常数测定值Ka’，每组结合常数测定值的数目为7个，将每组的所述7个结合常数测定值分别减去其中的结合常数测定值的最小值，然后再将分别减去最小值后得到的7个数值以最大值和最小值间的差值作归一化处理，分别得到S1’至S7’，将S1’至S7’由小至大排布，得到结合常数的测定值分布；

2）提供一组归一化后的结合常数的理想Ka值的分布，其数值分布为：0，1/6，1/3，1/2，2/3，5/6，1，这些数值在（0, 1）区间内呈现出均等排布；

3）计算标准偏离参数D，所述标准偏离参数D代表结合常数的测定值分布与结合常数的理想值分布之间的偏差，共计N个D值，其具体定义如下：

4）计算步骤1）得到的每组结合常数测定值中结合力最大值与结合力最小值的比值R，共计N个R值；

5）以每种二肽序列的亲水值作为XY坐标轴中的x值，以每种二肽序列对应的D值作为XY坐标轴中的y值确定一个点，从而得到具有N个离散点的D值分布图，选取亲水值为-1.5至0且D为0至15之间的点对应的多种二肽序列；

6）以每种二肽序列的亲水值作为XY坐标轴中的x值，以每种二肽序列对应的R值作为XY坐标轴中的y值确定一个点，从而得到具有N个离散点的R值分布图，选取亲水值为-1.5至0且R为5至20之间的点对应的多种二肽序列；

7）选取步骤5）得到的多种二肽序列和步骤6）得到的多种二肽序列中相同的二肽序列，从而得到所述二肽化合物；

其中，N为54；所述7种单糖如下图所示：

。

2.如权利要求1所述的二肽化合物的筛选方法，其特征在于，当所述单糖为唾液酸Neu5Ac时，得到N个结合常数的测定值，以每种二肽序列的亲水值作为XY坐标轴中的x值，以每种二肽序列对应的结合常数的测定值Ka作为XY坐标轴中的y值确定一个点，从而得到具有N个离散点的Ka值分布图，选取亲水值为-1.5至0且Ka为（5-30）×10³L/mol之间的点对应的多种二肽序列。

3.一种二肽功能单体，其由二肽化合物中的一个氨基键合一个含双键的基团得到，所述含双键的基团为丙烯酰胺基团，其特征在于，所述二肽化合物为：

。

4.基于二肽的聚合物材料，其特征在于，将权利要求3所述的二肽功能单体通过双键聚合到基质的表面上，从而得到具有功能表面的所述聚合物材料。

5.如权利要求4所述的聚合物材料，其特征在于，所述基质为氧化物多孔材料、无机半导体材料、金属材料或金属氧化物材料。

6.如权利要求4所述的基于二肽的聚合物材料在分离单糖、二糖、三糖、寡聚多糖中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述单糖为唾液酸类单糖，所述寡聚多糖为唾液酸类多糖。

8.如权利要求4所述的基于二肽的聚合物材料在富集和纯化糖肽或糖蛋白中的应用。

9.如权利要求4所述的基于二肽的聚合物材料在具有不同糖链结构、糖链异构体的糖肽分离中的应用。