CN113058577B - 糖肽富集材料及其制备方法和富集方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种糖肽富集材料的制备方法,其包括:S1、提供基质微球颗粒、以及氨基羰基化合物或多肽,将基质微球颗粒与氨基羰基化合物或多肽共价结合,在基质微球颗粒表面共价结合高密度亲水性的酰胺基、叔胺基或羟基中的一个或多个;S2、洗脱纯化得到糖肽富集材料。在基质微球颗粒表面共价结合亲水性的叔胺基、酰胺基或羟基,不但提高对N‑糖肽和O‑糖肽的富集,同时对带有负电的唾液酸糖肽和氨基酸有优异的特异性,该富集材料可广泛应用到生物医药、临床样本分析和药物开发,大大降低填充材料的成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖肽富集材料及其制备方法和富集方法,属于生物分子和临床蛋白样本分析试剂技术领域。
背景技术
蛋白质的糖基化与肿瘤的产生和发展密切关联,糖基化反应了细胞是否发生病变,因此分析人体体液中的蛋白质的糖基化异常可以预测疾病的产生和形成,与糖蛋白相关的分析技术和材料起至关重要的作用。作为糖蛋白研究中的一项重要技术,采用质谱对糖基化位点信息和糖链结构的解析使得人们对其结构和功能探索有了进一步的认识。但是糖蛋白丰度较低,酶解后产生的糖肽占总肽段的比例小,在质谱鉴定过程中糖肽信息容易被其他肽段信息所掩盖,因此在样品预处理过程中,必须要对糖肽进行有效地富集。目前富集糖肽的方法一般是化学法富集,即先将糖肽发生氧化反应生成醛基,然后醛基与富集材料偶联,再洗脱掉体系中未发生共价结合的蛋白质或肽段,最后经过糖苷酶处理释放出糖肽,该方法破坏糖肽所带聚糖结构且对O-糖肽富集困难,富集效果不理想。另外日本的Tosoh(Amide-80)对糖肽具有比较好的富集效果,其原理是基于亲水糖肽结合,但其成本非常高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低,且通过亲水的方式富集糖肽的糖肽富集材料的制备方法,以解决对糖肽富集效果不理想的难题。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:一种糖肽富集材料的制备方法,所述制备方法包括:
S1、提供基质微球颗粒、以及氨基羰基化合物或多肽,将所述基质微球颗粒与所述氨基羰基化合物或多肽共价结合,在所述基质微球颗粒表面共价结合高密度亲水性的酰胺基、叔胺基或羟基中的一个或多个;
S2、洗脱纯化得到糖肽富集材料。
进一步地,所述氨基羰基化合物包括[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙酸水合物或[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙醛;所述多肽为带有正电荷酰胺基的氨基酸。
进一步地,所述基质微球颗粒表面具有氨基或羟基。
进一步地,所述基质微球颗粒为硅胶颗粒或聚合物颗粒。
进一步地,所述硅胶颗粒为多孔硅胶微粒,所述多孔硅胶微粒的粒径为40-120um,所述多孔硅胶微粒的为微孔尺寸为80-300埃。
本发明还提供一种使用所述的糖肽富集材料的制备方法得到的糖肽富集材料,所述糖肽富集材料包括基质微球颗粒、以及与所述基质微球颗粒表面共价结合的亲水性的酰胺基、叔胺基或羟基中的一个或多个。
本发明还提供一种基于所述的糖肽富集材料的富集方法,所述糖肽富集材料通过亲水的方式用于糖肽的富集,所述富集方法包括:
(1)使用糖肽富集材料制备亲水萃取柱;
(2)预处理所述亲水萃取柱;
(3)使用蛋白酶水解糖蛋白得到多肽和糖肽的样本液,将所述样本液加入到所述亲水萃取柱中并将过滤液多次重新加到所述亲水萃取柱中;
(4)清洗所述亲水萃取柱;
(5)洗脱所述糖肽,收集洗脱液,干燥得到富集的糖肽。
进一步地,制备亲水萃取柱的具体方法为:
(11)提供SPE萃取管,将孔径小于20um的第一筛板放入所述SPE萃取管内;
(12)将糖肽富集材料清洗干净,并将所述糖肽富集材料填充至所述SPE萃取管内;
(13)将孔径应小于20um的第二筛板放入所述SPE萃取管内;
(14)使用80%ACN(含0.1%TFA)清洗,得到亲水萃取柱。
进一步地,依次使用1ml的60%ACN(含0.1%TFA),1ml的40%ACN(含0.1%TFA),1ml的0.1%TFA洗脱所述糖肽。
进一步地,使用1ml的80%ACN(含0.1%TFA)清洗所述亲水萃取柱且重复五次。
本发明的有益效果在于:本发明提供的糖肽富集材料的制备方法,在基质微球颗粒表面共价结合亲水性的叔胺基、酰胺基或羟基,不但提高对N-糖肽和O-糖肽的富集,同时对带有负电的唾液酸糖肽和氨基酸有优异的特异性,该富集材料可广泛应用到生物医药、临床样本分析和药物开发,大大降低填充材料的成本。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明所示的糖肽富集材料的制备流程图;
图2为本发明所示的糖肽富集材料的另一种制备流程图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
此外,下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明一实施例所示的糖肽富集材料,其包括基质微球颗粒、以及与基质微球颗粒表面共价结合的亲水性的酰胺基、叔胺基或羟基中的一个或多个。
糖链部分中的糖肽与非糖肽在亲水性上具有差异,糖肽的亲水性强,而本发明得到的亲水性的糖肽富集材料通过范德华力、氢键等作用力实现糖肽的选择性富集,此方法在不破坏糖肽本身结构的基础上,对各种具有不同类型糖链的糖肽进行普适性的富集,同时操作条件温和,且与后续液相-质谱联用系统兼容。并且,在酸性条件下,糖肽富集材料的酰胺基或叔胺基带正电,对带负电的糖肽具有更高的选择性,富集效率高。该糖肽富集材料同样对带有负电的唾液酸糖肽和氨基酸有优异的特异性。
其中,基质微球颗粒表面具有氨基或羟基,氨基或羟基用以与其他化合物反应以化学改性基质微球颗粒表面。基质微球颗粒表面的连接的官能团不仅限于此,基还可以具有其他基团,在此不一一列举。
基质微球颗粒为硅胶颗粒或聚合物颗粒。本实施例中,硅胶颗粒为多孔硅胶微粒,多孔硅胶微粒的粒径为40-120um,多孔硅胶微粒的为微孔尺寸为80-300埃。多孔硅胶微粒提高了微粒比表面积,增加了与糖肽的接触面积,有利于糖肽的富集。
本发明还提供一种上述糖肽富集材料的制备方法,该制备方法包括:
S1、提供基质微球颗粒、以及氨基羰基化合物或多肽,将所述基质微球颗粒与所述氨基羰基化合物或多肽共价结合,在所述基质微球颗粒表面共价结合高密度亲水性的酰胺基、叔胺基或羟基中的一个或多个;
S2、洗脱纯化得到糖肽富集材料。
其中,氨基羰基化合物包括[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙酸水合物或[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙醛,但不仅限于此,氨基羰基化合物还可以其他具有叔胺基和酰胺基的化合物,在此不一一列举。氨基羰基化合物在本发明中定义为具有叔胺基和酰胺基的化合物。所述多肽为带有正电荷酰胺基的氨基酸,在此不对多肽做具体限定,只要是具有带正电荷的官能团即可。
请参见图1,基质微球颗粒具有氨基,通过碳二亚胺耦合使氨基与[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙酸水合物共价结合得到亲水性的糖肽富集材料。具体的:
步骤一、称取102.11-104.22mg[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙酸水合物并溶于500-1000ul去离子水;
步骤二、取400-500ul的[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙酸水合物溶液,加入40-50ul纯EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和10-15ul的36-38%盐酸;
步骤三、用试纸测试溶液pH介于4-6之间,如果低于4则逐滴加入EDC直到达到范围,反之则加入36-38%盐酸直到达到范围;
步骤四、取200-300mg具有氨基的基质微球颗粒,将上述得到的溶液与基质微球颗粒混合,在室温下反应8-12小时,得到亲水性的糖肽富集材料;
步骤五、清洗亲水性的糖肽富集材料,依次使用450-550ul的10%甲酸/3次,450-550ul的10%ACN/3次,450-550ul的1M NaCl/3次,450-550ul的去离子水/3次。
另一实施例中,基质微球颗粒具有氨基,通过还原胺化使氨基与[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙醛共价结合得到亲水性的糖肽富集材料。具体的:
步骤一、称取85.05-170.11mg[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙醛并溶于500-1000ul去离子水;
步骤二、取400-500ml的[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙醛溶液,加入40-50ul的0.5MNaCNBH3(氰基硼氢化钠)和40-50ul的10x PBS缓冲液;
步骤三、取200-300mg具有氨基的基质微球颗粒,将上述得到的溶液与基质微球颗粒混合,在室温下反应8-12小时,得到亲水性的糖肽富集材料;
步骤四、清洗亲水性的糖肽富集材料,依次使用450-550ul的10%甲酸/3次,450-550ul的10%ACN/3次,450-550ul的1M NaCl/3次,450-550ul的去离子水/3次。
请参见图2,基质微球颗粒具有氨基,通过与多肽共价结合得到亲水性的糖肽富集材料。具体的:
步骤一、称取100-120ug多肽并溶于500-1000ul的1N HCl溶液;
步骤二、取400-500ul的多肽,加入40-50ul的100%EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和10-15ul 36%-38%的盐酸,调节pH 4-6;
步骤三、取200-300mg具有氨基的基质微球颗粒,将上述得到的溶液与基质微球颗粒混合,在室温下反应8-12小时,得到亲水性的糖肽富集材料;
步骤四、清洗亲水性的糖肽富集材料,依次使用450-550ul的10%甲酸/3次,450-550ul的10%ACN/3次,450-550ul的1M NaCl/3次,450-550ul的去离子水/3次。
本发明还提供一种基于的糖肽富集材料的富集方法,糖肽富集材料通过亲水的方式用于糖肽的富集,富集方法包括:
(1)使用糖肽富集材料制备亲水萃取柱;
(2)预处理亲水萃取柱;
(3)使用蛋白酶水解糖蛋白得到多肽和糖肽的样本液,将样本液加入到亲水萃取柱中并将过滤液多次重新加到亲水萃取柱中;
(4)清洗亲水萃取柱;
(5)洗脱糖肽,收集洗脱液,干燥得到富集的糖肽。
其中,制备亲水萃取柱的具体方法为:
(11)提供SPE萃取管,将孔径小于20um的第一筛板放入SPE萃取管内;
(12)将糖肽富集材料清洗干净,并将糖肽富集材料填充至SPE萃取管内;
(13)将孔径应小于20um的第二筛板放入SPE萃取管内,使得糖肽富集材料固定在SPE萃取管内;
(14)使用80%ACN(含0.1%TFA)清洗,得到亲水萃取柱。
SPE萃取管选取1-3ml规格,第一筛板和第二筛板的具体孔径在此不做具体限定,可根据实际需要进行选择。
预处理亲水萃取柱的方法为:先用1ml的0.1%TFA的清洗三次,再用1ml的80%ACN(含0.1%TFA)清洗五次。
蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、赖氨酸蛋白酶、天冬氨酸肽链内切酶等,在此不一一列举。分解得到的多肽和糖肽溶解在80%ACN(含0.1%TFA)溶液中得到样本液。将样本液加入到亲水萃取柱中,样本液在重力的作用下流过糖肽富集材料,此外,也可使用压缩空气将样本液缓慢流过糖肽富集材料。用正相液相分离方法去除样本液中的多肽,糖肽富集在亲水的硅胶微粒表面。
使用1ml的80%ACN(含0.1%TFA)清洗所述亲水萃取柱且重复五次,以此将样本液中的除了亲水性的糖肽外的多肽等清洗,而糖肽富集在糖肽富集材料的表面。然后,用水相将富集的糖肽洗脱,具体的,依次使用1ml的60%ACN(含0.1%TFA),1ml的40%ACN(含0.1%TFA),1ml的0.1%TFA洗脱糖肽,收集洗脱液,干燥得到富集的糖肽,可采用液相质谱分析糖蛋白糖基化。
综上,本发明提供的糖肽富集材料的制备方法,在基质微球颗粒表面共价结合亲水性的叔胺基、酰胺基或羟基,不但提高对N-糖肽和O-糖肽的富集,同时对带有负电的唾液酸糖肽和氨基酸有优异的特异性,该富集材料可广泛应用到生物医药、临床样本分析和药物开发,大大降低填充材料的成本。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种糖肽富集材料的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
步骤一、称取102.11-104.22mg [4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙酸水合物并溶于500-1000ul去离子水;
步骤二、取400-500ul的[4-(氨基羰基)哌啶-1-基]乙酸水合物溶液,加入40-50ul纯1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10-15ul的36-38%盐酸;
步骤三、用试纸测试溶液pH介于4-6之间,如果低于4则逐滴加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺直到达到范围,反之则加入36-38%盐酸直到达到范围;
步骤四、取200-300mg具有氨基的基质微球颗粒,将上述得到的溶液与基质微球颗粒混合,在室温下反应8-12小时,得到亲水性的糖肽富集材料;
步骤五、清洗所述亲水性的糖肽富集材料,依次使用450-550ul的10%甲酸清洗3次,450-550ul的10%ACN清洗3次,450-550ul的1M NaCl清洗3次,450-550ul的去离子水清洗3次。
2.一种使用如权利要求1所述的糖肽富集材料的制备方法得到的糖肽富集材料。
3.一种基于如权利要求2所述的糖肽富集材料的富集方法,其特征在于,所述糖肽富集材料通过亲水的方式用于糖肽的富集,所述富集方法包括:
(1)使用糖肽富集材料制备亲水萃取柱;
(2)预处理所述亲水萃取柱;
(3)使用蛋白酶水解糖蛋白得到多肽和糖肽的样本液,将所述样本液加入到所述亲水萃取柱中并将过滤液多次重新加到所述亲水萃取柱中;
(4)清洗所述亲水萃取柱;
(5)洗脱所述糖肽,收集洗脱液,干燥得到富集的糖肽。
4.如权利要求3所述的基于糖肽富集材料的富集方法,其特征在于,制备亲水萃取柱的具体方法为:
(11)提供SPE萃取管,将孔径小于20um的第一筛板放入所述SPE萃取管内;
(12)将糖肽富集材料清洗干净,并将所述糖肽富集材料填充至所述SPE萃取管内;
(13)将孔径应小于20um的第二筛板放入所述SPE萃取管内;
(14)使用80% ACN清洗,得到亲水萃取柱,其中,ACN中含有0.1%TFA。
5.如权利要求3所述的基于糖肽富集材料的富集方法,其特征在于,依次使用1ml 的60% ACN,1ml 的40% ACN,1ml的0.1% TFA洗脱所述糖肽,其中,ACN中含有0.1%TFA。
6.如权利要求3所述的基于糖肽富集材料的富集方法,其特征在于,使用1ml 的80%ACN清洗所述亲水萃取柱且重复五次,其中,ACN中含有0.1%TFA。
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