CN104710506A

CN104710506A - 一种糖蛋白质富集纯化方法

Info

Publication number: CN104710506A
Application number: CN201310687406.7A
Authority: CN
Inventors: 张丽华; 方菲; 赵群; 杨开广; 张玉奎
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-12-13
Also published as: CN104710506B

Abstract

本发明涉及一种糖蛋白质富集纯化方法，该方法集合了高选择性富集糖蛋白质的酰肼化学法及高效纯化的离心超滤装置的使用，于离心超滤装置上原位完成酰肼富集糖蛋白质过程。该方法于原位进行整个糖蛋白质富集过程，可以有效降低样品损失，同时，离心超滤装置的使用使得可应用增溶剂于该富集过程，从而实现可溶性蛋白质和/或不可溶性膜蛋白质中糖蛋白质的同时富集；离心超滤装置有效置换溶剂的优势，使得糖蛋白质富集过程中可以引入各类型洗脱溶液完成非糖蛋白质的有效去除，从而提高糖蛋白质富集的选择性。

Description

一种糖蛋白质富集纯化方法

技术领域

本发明涉及生物分析领域，具体涉及一种糖蛋白质富集纯化方法。

背景技术

糖基化是最复杂的蛋白质翻译后修饰之一，哺乳动物体内有50%以上的蛋白质预测为糖基化修饰蛋白。糖基化蛋白质具有包括信号传导、细胞粘附及免疫应答等丰富的生物学功能；蛋白质糖基化的异常化，与肿瘤、免疫缺陷及退行性疾病等密切相关；此外，糖蛋白质是疾病诊断、药物响应的生物标志物的重要靶标，因此，研究发展高通量分析复杂样品中糖蛋白质的新技术和新方法成为现在的研究热点。然而，由于糖肽含量低且糖肽的质谱信号易被抑制及糖型的微观不均一性，目前对糖蛋白质的研究面临着巨大的挑战。因此，为获得糖基化的全面信息并阐述蛋白之间的功能联系，对糖蛋白质的有效分离对其后续分析具有重要的功能意义。

近年来，各种富集纯化糖蛋白质的方法逐一建立，主要包括凝集素亲和法、硼亲和法、酰肼化学法及亲水作用色谱法。然而这些方法都各有优缺点，如凝集素亲和法，由于凝集素对于糖蛋白质的糖型结构专一性过强，因此对于复杂样品中的糖蛋白质的富集需使用多种凝集素联用；而亲水作用法及硼亲合法对糖蛋白质的选择性过低。

2003年提出的酰肼化学法（H.Zhang,X.J.Li,D.B.Martin&R.Aebersold,J.Nat.Biotechnol.2003(21),660-666.）对糖蛋白质的富集能力强且选择性高，但存在着样品损耗大、步骤繁琐的问题；同时，由于该方法在离心管中进行，无法实现溶剂的完全置换，因此无法进行不可溶性膜蛋白质中的糖蛋白质富集。超滤膜的使用具有去噪效果好、溶剂置换完全及样品损失量较小的优势。本发明结合了高选择性富集糖蛋白质的酰肼富集法及高效纯化的离心超滤装置，于离心超滤装置上原位完成酰肼富集糖蛋白质过程，从而发展出一种糖蛋白质富集纯化方法，具有样品损失小、富集效率高、操作简便，且可实现可溶性蛋白质和/或不可溶性膜蛋白质中糖蛋白质同时富集的优点。

发明内容

为了克服酰肼化学法富集糖蛋白质样品损耗大、步骤繁琐及溶剂无法置换等不足，本发明提供一种糖蛋白质富集纯化方法，于离心超滤装置上原位完成酰肼富集糖蛋白质过程，从而实现糖蛋白质高效富集及纯化，该方法具有样品损失小、富集效率高、操作简便，且可实现可溶性蛋白质和/或不可溶性膜蛋白质中糖蛋白质同时富集的优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

（1）糖基化修饰蛋白质的氧化：采用溶有体积浓度为1%-30%的表面活性剂（SDS、SDC、Triton X-100、CHAPS、Rapigest SF或NP-40中的一种或两种以上）或去垢剂（尿素、硫脲或盐酸胍中的一种或两种以上）的氧化缓冲液（pH为4-7的醋酸盐与氯化盐混合缓冲液或磷酸缓冲液中的一种）配制的氧化剂溶液（浓度为1-100mM的高碘化物）溶解蛋白质样品，并将样品溶液加入至离心超滤装置的超滤管中进行氧化反应5min-2h；

（2）糖蛋白质的捕获：氧化反应结束后，向超滤管中加入氧化缓冲液配制的浓度为1-200mM亚硫酸盐溶液反应5-40min，中和多余的氧化剂；反应结束后，向超滤管中加入悬浮于氧化缓冲液的带有酰肼或氨基官能团的磁性微球、琼脂糖凝胶或硅球，室温下震荡2-24h；

（3）蛋白质样品的变性及还原：使用pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或浓度为2-10M的尿素溶液（pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液配制）清洗蛋白质样品；向蛋白质样品加入还原剂溶液（终浓度为1-200mM的DTT或β-巯基乙醇），于高温水浴下同时进行蛋白质样品的变性及还原过程；

（4）杂质的去除：使用pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或浓度为2-10M的尿素溶液（pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液配制）清洗步骤（5）中蛋白质样品；

（5）蛋白质的烷基化：向步骤（4）中离心后的超滤管中加入烷基化溶液（终浓度为1-200mM的碘代乙酸或碘乙酰胺），反应10-40min；

（6）非糖蛋白质的去除：分别使用浓度为0.1-8M的氯化钠溶液、0.1-8M的氯化钾溶液、0.1-1M的碳酸钠溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的盐酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氢铵溶液盐溶液清洗步骤（5）中的蛋白质样品，去除蛋白质中的非糖蛋白质；

（7）糖蛋白质的富集：向超滤膜上的蛋白质样品中加入pH为7.5-9的碱性缓冲溶液配制的糖基肽酶溶液，反应6-24h使连接在功能化官能团微球上的糖链断裂以获得功能化官能团微球上的糖蛋白质溶液。

本发明具有以下优点：

1、样品损失小。整个糖蛋白质样品富集纯化过程包括蛋白质样品的氧化、富集、非糖蛋白质的去除及除盐过程皆在离心超滤装置中原位进行，且样品处理过程中未引入样品转移步骤，有效降低样品的损失。

2、处理全蛋白质组。离心超滤装置的使用，使得糖蛋白质的富集过程可以引入增溶剂，从而达到可溶性蛋白质和/或不可溶性膜蛋白质中糖蛋白质同时富集的目的。

3、操作简便。离心超滤装置的使用，使得通过离心过程即可完成溶剂的置换及杂质的去除。同时，超滤膜的大分子截留量，使得通过离心过程即可完成非糖蛋白质的去除。

4、糖蛋白质富集效率高。引入了糖蛋白质富集选择性高的酰肼化学法，离心超滤装置的使用，使得可以使用各类型洗脱溶液去除非糖蛋白质；同时，在洗脱液去除非糖蛋白质步骤之前，将蛋白质进行变性、还原及烷基化处理，展开蛋白质结构，使得非糖蛋白质更易被去除，从而实现糖蛋白质的高效富集。

附图说明

图1为糖蛋白质富集纯化流程图。

图中，1-糖蛋白质的氧化；2-糖蛋白质的捕获；3-非糖蛋白质的去除；4-糖蛋白质的富集。

具体实施方式

实施例1

1.糖蛋白质的氧化

采用溶有4%SDS的氧化缓冲液（100mM醋酸钠,150mM氯化钠,pH5.5）配制的10mM高碘酸钠溶液溶解从鼠肝中提取的全蛋白质样品，将样品溶液加入至超滤膜孔径尺寸为0.45um的离心超滤装置（购自Pall Corporation,Port Washington,USA）的超滤管中反应1h；

2.多余氧化剂的去除

氧化反应结束后，向超滤管中加入氧化缓冲液配制的浓度为20mM亚硫酸盐溶液反应10min，中和多余的氧化剂；

3.糖蛋白质的捕获

向超滤管中加入悬浮于氧化缓冲液的带酰肼基团的琼脂糖凝胶，室温下震荡12h；

4.蛋白质的变性及还原

步骤3中处理的样品在3000×g转速下离心30s，弃去收集管中废液。使用10mM碳酸氢铵（ABC）溶液(pH为8.7)配制的8M尿素溶液清洗蛋白质样品；向蛋白质样品加入8M尿素溶液（使用pH为8.7的10mM碳酸氢铵（ABC）溶液配制）配制的终浓度为10mM的二硫苏糖醇（DTT）溶液，于56℃水浴下同时进行蛋白质样品的变性及还原过程；

5.杂质的去除

步骤4中处理的样品在3000×g转速下离心30s，弃去收集管中废液。使用10mM碳酸氢铵（ABC）溶液(pH为8.7)配制的8M尿素溶液清洗蛋白质样品；

6.蛋白质的烷基化

步骤5中处理的样品在3000×g转速下离心30s，弃去收集管中废液。向超滤管中加入8M尿素溶液（使用pH为8.7的10mM碳酸氢铵（ABC）溶液配制）配制的终浓度为20mM的碘代乙酰胺（IAA）溶液，室温下反应30min；

7.非糖蛋白质的去除

分别使用2M氯化钠、0.1M碳酸钠、8M尿素、6M盐酸胍及10mM碳酸氢铵缓冲溶液（ABC）清洗超滤膜上的蛋白质样品。

8.糖蛋白质的富集

经清洗的蛋白质样品重悬浮于10mM ABC缓冲溶液中，并加入糖基肽酶于37℃孵育12h后，在3000×g转速下离心30s，收集管中所得溶液即为所需的糖蛋白质溶液；

9.糖蛋白质的酶解

将蛋白样品转至超滤膜截留分子量为10,000Da的离心超滤装置（购自Millipore,Billerica,MA）的超滤管中,参照Mann,M.的FASP方法（Wisniewski,J.R.;Zougman,A.;Nagaraj,N.;Mann,M.Nat.Methods.2009(6),359362.）完成蛋白质样品的酶解过程，获得细胞膜蛋白质的酶解产物。

10.LTQ-Orbitrap Velos检测

酶解产物14000×g转速下离心10min，取其上清溶液，使用LTQ-Orbitrap Velos进行检测。质谱仪分析在正离子模式下进行。喷雾电压为2.0kV，加热毛细管温度为200℃。采用Xcalibur软件记录总离子流图与MS谱图；质荷比范围为300到1800。MS/MS谱图采用数据依赖模式进行采集。从一张MS全扫描中，选择15个最强的母离子进行MS/MS的分析。MS/MS扫描的碰撞能量为35%。

11.数据分析

对采集的谱图，采用Mascot进行数据检索，数据库为ncbi.RAT.REVERSE。半胱氨酸残基设为固定化修饰+57.0215Da，甲硫氨酸残基设为可变修饰+15.9949Da，天冬酰胺残基（N）设为可变修饰0.9842Da。肽段检索采用胰蛋白酶完全酶切，最多允许两个漏切位点。肽段和MS/MS质量允许偏差分别为10ppm和0.5Da。调节Xcorr值以控制肽段鉴定的假阳性率FDR<1%(FDR定义为采用正库与反库鉴定到的肽段数量)。共鉴定到3680个蛋白group，对应25849条非冗余肽段。由于N-糖基化修饰发生于特定的序列中，即N-!P-S/T，鉴定到的肽段按照此序列进行筛选，只有在N上发生可变修饰，并含有该特定序列的肽段为N-糖基化肽段，对应的蛋白质为糖蛋白质，鉴定到的3680个蛋白质中有2587个蛋白质（70%）的蛋白质为糖蛋白质。

鉴定结果

鉴定总蛋白数	鉴定糖蛋白质数（占总蛋白数比例）
		3680	2587（70%）

实施例2

将实施例1中的鼠肝中提取的全蛋白质样品更换为人宫颈癌细胞中提取的全蛋白质样品；糖蛋白质样品富集步骤同实施例1。

鉴定结果

鉴定总蛋白数	鉴定糖蛋白质数（占总蛋白数比例）
		3257	2410（74%）

实施例3

糖蛋白质的氧化方法步骤为：采用溶有1%Triton X-100的氧化缓冲液（100mM醋酸钠,150mM氯化钠,pH5.5）配制的10mM高碘酸钠溶液溶解从鼠肝中提取的全蛋白质样品；糖蛋白质样品富集步骤同实施例1。

鉴定结果

鉴定总蛋白数	鉴定糖蛋白质数（占总蛋白数比例）
		3542	2469（70%）

实施例4

糖蛋白质的氧化方法步骤为：采用溶有4%SDS的氧化缓冲液（PBS，pH6.2）配制的10mM高碘酸钠溶液溶解从鼠肝中提取的全蛋白质样品；糖蛋白质样品富集步骤同实施例1。

鉴定结果

鉴定总蛋白数	鉴定糖蛋白质数（占总蛋白数比例）
		3364	2398（71%）

实施例5

糖蛋白质的捕获方法步骤为：向超滤管中加入悬浮于氧化缓冲液的带酰肼基团的硅球，室温下震荡12h；糖蛋白质样品富集步骤同实施例1。

鉴定结果

鉴定总蛋白数	鉴定糖蛋白质数（占总蛋白数比例）
		3864	3176（82%）

Claims

1.一种糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

于离心超滤装置中使用酰肼化学法富集糖蛋白质，从而实现对可溶性蛋白质和/或不可溶性膜蛋白质中糖蛋白质的鉴定与分析，具体包括：

（1）采用溶有表面活性剂或去垢剂的氧化缓冲液配制的氧化剂溶液溶解蛋白质样品，并将样品溶液加入至离心超滤装置的超滤管中进行氧化反应；

（2）氧化反应结束后，向超滤管中加入氧化缓冲液配制的亚硫酸盐溶液进行反应，中和多余的氧化剂；

（3）向超滤管中加入悬浮于氧化缓冲液的带有功能化官能团的微球，室温下震荡；

（4）使用pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或尿素溶液清洗步骤（3）中蛋白质样品；

（5）向步骤（4）中蛋白质样品加入还原剂溶液，同时进行蛋白质样品的变性及还原过程；

（6）使用pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或尿素溶液清洗步骤（5）中蛋白质样品；

（7）向步骤（6）中离心后的超滤管中加入烷基化溶液；

（8）使用盐溶液清洗步骤（7）中的蛋白质样品；

（9）使用糖基肽酶酶解的方法获得功能化官能团微球上富集的糖蛋白质，即得所需富集纯化的糖蛋白质样品溶液。

2.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

步骤（1）、（2）和（3）中所述的氧化缓冲液体系为醋酸盐和氯化盐混合缓冲液或磷酸缓冲液中的一种；所述醋酸盐和氯化盐混合缓冲液体系中醋酸盐和氯化盐浓度分别为10-200mM，氧化缓冲液体系的pH范围为4-7；

步骤（1）中所述的氧化剂为高碘化物；氧化剂浓度为1-100mM；氧化反应时间为5min-2h；

步骤（1）中所述的表面活性剂包括十二烷基磺酸钠（SDS）、脱氧胆酸钠(SDC)、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、酸性不稳定表面活性剂(Rapigest SF)或壬基酚聚氧乙烯醚-40（NP-40）中的一种或两种以上；去垢剂包括尿素、硫脲或盐酸胍中的一种或两种以上；

步骤（1）中所述的氧化缓冲液中表面活性剂或去垢剂的体积浓度为1%-30%；

步骤（1）中所述的离心超滤装置中的超滤管为底部或侧部置有热密封超滤膜的立体结构装置；超滤膜的截留分子量最小为100,000Da。

3.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（2）中所述的亚硫酸盐溶液浓度为1-200mM，反应时间为5-40min。

4.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（3）中所述的带有功能化官能团的微球包括带有功能化官能团的磁性微球、琼脂糖凝胶或硅球；

磁性微球为以四氧化三铁/二氧化硅复合纳米磁球为核，使用带酰肼或氨基官能基团的硅烷化试剂制备的磁性微球；琼脂糖凝胶为具有酰肼或氨基反应基团的具有二至二十碳连接臂的琼脂糖；硅球为具有酰肼或氨基反应基团的硅球；

带有功能化官能团的微球与经氧化的蛋白质反应时间为2-24h；

带有功能化官能团的微球的尺寸大小为大于步骤（1）中所选用的离心超滤装置中的超滤膜孔径的尺寸大小。

5.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

步骤（4）、（6）和（7）中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；

步骤（4）和（6）中所述的尿素溶液，为由pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液配制的浓度为2-10M的溶液。

6.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

步骤（5）中所述的还原剂为二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇；终浓度为1-200mM；

所述的蛋白质变性及还原条件为：

若溶液体系为权利要求5中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液，则蛋白质变性及还原条件为80-100℃水浴下进行，时间为1-20min；

若溶液体系为pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液配制的浓度为2-10M的尿素溶液，则蛋白质变性及还原条件为37-80℃水浴下进行，时间为20min-2h。

7.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

步骤（7）中所述的向超滤管中加入的烷基化溶液的溶剂为权利要求4中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液配置的浓度为2-10M的尿素溶液；

所述的烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺，终浓度为1-200mM；烷基化反应时间为10min-1h。

8.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

步骤（8）中所述的盐溶液为浓度为0.1-8M的氯化钠溶液、0.1-8M的氯化钾溶液、0.1-1M的碳酸钠溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的盐酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氢铵溶液。

9.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

步骤（9）中所述的功能化官能团微球上糖蛋白质获取方法为向细胞样品中加入权利要求4中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的糖基肽酶溶液，但碱性缓冲溶液的pH范围需调节至7.5-9，反应6-24h使连接在功能化官能团微球上的糖链断裂以获得功能化官能团微球上的糖蛋白质溶液。