CN105400855A - 一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法 - Google Patents

一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物分析与检测技术领域，具体为一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法。本发明首先在Fe3O4PEG磁性纳米材料表面修饰醛基、环氧基和三氟乙磺酸酯基等活性基团，再在其外层键合上含有二硫键的基团，得到磁性纳米材料Fe3O4PEGADC；然后采用两步酶解的策略：先用胰蛋白酶进行第一步酶切，使疏水性的膜蛋白暴露出亲水性的羧基；然后再进行还原烷基化，破坏未被酶切的肽段与材料之间的二硫键；从材料表面洗脱下来的残余肽段继续被Glu-C酶解。实验证明，两步酶解策略对于特殊膜蛋白，如细菌视紫红质，具有很好的酶解效果，在复杂样品的膜蛋白组学研究中也有很好的结果。本发明实用高效，重复性好，稳定性高，在膜蛋白的大规模鉴定中有广阔的应用前景。

Description

一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法
技术领域
本发明属于生物分析与检测技术领域，具体涉及基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法。
技术背景
目前，基于共价固定稳定性好和重复性高的特点，蛋白质共价固定到固相载体上已经得到了广泛的应用。然而，可逆共价固定发展比较缓慢，即难以做到蛋白质的洗脱和回收。已有的技术大多需要在蛋白上先修饰上活性基团，然后利用该基团与固相材料上的活性位点进行作用，例如文献中在蛋白上修饰一段DNA单链，在介孔硅材料上修饰上一段互补链，利用DNA双链之间的特异性作用，将蛋白可逆地连接到介孔硅材料上。但是该方法并不适用于高浓度十二烷基磺酸钠（SDS）存在的体系。因为高浓度SDS可能破坏DNA双链，从而导致蛋白的损失。本发明在膜蛋白共价固定方法的基础上，利用二硫键的可控断裂和两步酶解法将SDS体系中共价固定在磁性纳米材料表面的膜蛋白完全洗脱，降低了膜蛋白酶解肽段的损失，提高了鉴定效率，对于人Hela细胞膜蛋白得到了令人满意的鉴定结果。
发明内容
本发明的目的在于提出一种操作简便，肽段回收率高，酶解效率高的基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法。
本发明提供的基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法，具体步骤如下：
（1）通过一系列反应将半光胺和乙酰半胱氨酸中的两个巯基相连，形成由二硫键连接氨基与羧基而得到的化合物（amino-disulfide-carboxyl，ADC）；
（2）利用ADC的氨基与表面修饰有三氟乙磺酸酯基的磁性纳米材料（Fe3O4PEG-tresyl）进行反应，形成表面含有丰富羧基的新型磁性纳米材料（记为Fe3O4PEGADC）。该材料除了具备Fe3O4PEG-tresyl磁性纳米材料高迁移性和高亲和性的特点，还可以利用二硫键可控断裂的特点来提高膜蛋白酶解肽段回收率；
（3）将膜蛋白键合到新型磁性纳米材料Fe3O4PEGADC表面；
（4）用胰蛋白酶（trypsin）进行第一步酶解，使疏水性的膜蛋白暴露出亲水性的羧基，然后再进行还原烷基化，破坏未被酶切的肽段与材料之间的二硫键，将材料表面的残余肽段洗脱下来。这时，部分氨基（包括赖氨酸的侧链氨基）被连接上了还原烷基化的乙酰半胱氨酸，Trypsin可能无法识别赖氨酸活性位点。因此，要进行第二步酶解，即选用活性位点为谷氨酸的Glu-C进行残余肽段的酶解。这两步酶解，不光可以最大程度地回收膜蛋白的酶解肽段，而且可以提高膜蛋白的酶解效率。
本发明中，步骤（1）形成化合物ADC的具体操作过程如下：
把0.5～1.0mL偶氮二甲基二乙酯和200～400mg半胱胺溶解在10～20mL二氯甲烷溶剂中，氮气氛围中室温下过夜反应；将二氯甲烷蒸干后，使用柱层析分离对产物进行提纯，去除水相中未反应的半胱胺；将所得中间产物重溶在3～6mL四氢呋喃中，并加入200～400mg乙酰半胱氨酸，在氩气中30～40℃反应48～72h；经过柱色谱分离后便得到较纯的ADC。
本发明中，步骤（2）形成表面含有丰富羧基的新型磁性纳米材料（Fe3O4PEGADC）的具体操作过程如下：
将所得ADC重溶在1～2mL乙腈中，转移到装有20～40mLPBS缓冲溶液(0.5～1.0M，pH8.0～9.0)的圆底烧瓶中，超声使其分散均匀。加入1.0～2.0gFe3O4PEG-tresyl磁性纳米材料，在室温下过夜反应。磁性分离，去除未反应ADC后，加入封闭缓冲液（0.1M,Tris-HCl，0.5MNaCl，pH8.0）反应掉多余的tresyl活性基团。反应0.5～1h后，除去多余封闭缓冲液，然后分别用水、乙醇洗涤数次，即得到新型磁性纳米材料Fe3O4PEGADC，烘干待用。
本发明中，步骤（3）将膜蛋白键合到新型磁性纳米材料Fe3O4PEGADC表面的具体操作过程如下：
使用EDC和NHS对Fe3O4PEGADC磁性纳米材料表面的羧基进行活化：EDC和NHS按照1：1～2：1的比例溶解在1～2mLMES缓冲溶液中，再加入10～20mgFe3O4PEGADC磁性纳米材料，常温下活化0.5min～1h后磁性分离，去除多余的反应物后。细菌视紫红质蛋白（bR）溶解在含有4%SDS的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液（MES，50～100mM，pH5.0～6.0），配制成浓度为0.5～1.0mg/mL的蛋白溶液。将Fe3O4PEGADC磁性纳米材料重新分散在90～180μLMES缓冲溶液中，并加入10～20μL蛋白溶液，在30～40℃条件下，震荡反应2～3小时。
本发明中，步骤（4）所述进行两步酶解的具体操作过程如下：
将所得材料经过充分洗涤后，重新分散在50～100μLNH4HCO3（25～50mM）溶液中，进行两步法酶解：第一步，加入1.0～2.0μgTrypsin，37℃下过夜酶解；磁性分离后分别得到1号肽段样品；第二步，材料中加入10～20mMDTT溶液，在50～60℃下反应45min～1h，随即加入IAA至终浓度为25～50mM，在室温下避光反应0.5～1小时；磁性分离后得到还原烷基化的残余肽段，并加入0.5～1.0μgGlu-C，继续在37℃下过夜酶解，得到2号肽段样品。
两个肽段样品冻干后进行RPLC-MS/MS分离鉴定。
本发明利用tresyl基团与ADC氨基之间高效的反应，将ADC修饰到Fe3O4PEG-Tresyl磁性纳米材料表面形成了Fe3O4PEGADC磁性纳米材料。图2为两种材料的傅里叶变换红外光谱图。对比两根红外光谱曲线，修饰上ADC后，在800-1200cm-1范围内出现了五个较大的吸收峰（895、958、1089、1143和1191cm-1）。这些峰大致归属于N-H和C=O，由此可以证明，ADC已经被成功地修饰到PEG包裹的磁球表面。插表列出了Fe3O4PEG-Tresyl材料各种元素含量的比例，S元素与N元素的比例约为1:1，与ADC基团中两者的比值相当，再次证明ADC的成功修饰。
接着，本发明将基于二硫键可控断裂特性的膜蛋白组学研究路线对一种特殊膜蛋白--细菌视紫红质蛋白（bR）进行酶解效果的考察，并且将鉴定结果与过滤辅助样品辅助法（FASP）的鉴定结果进行比较。bR蛋白含有7个跨膜结构域，疏水性较强，其序列中共有262个氨基酸，其中仅有7个赖氨酸，因此在常规方法中很难被酶解鉴定。而且，在常规方法中（如FASP法），膜蛋白的酶解之前常常需要先进行还原烷基化来破坏其三维结构，而在本发明的研究路线中第一步酶解前不可进行还原烷基化，为了保证比较的对等性，序列中没有半胱氨酸的bR蛋白正是合适的研究模型。实验结果表明，FASP法和本发明提出的两步酶解法的第一步酶解中均鉴定到3条肽段，而在第二步酶解中共鉴定到5条肽段，包括N末端肽段（mLELLPTAVE），如表1。
利用本发明提出的基于二硫键可控断裂特性的膜蛋白组学研究路线来研究人Hela细胞膜蛋白组。被固定到Fe3O4PEGADC材料表面的Hela细胞膜蛋白，经过两步酶解后，得到两份酶解肽段，并通过RPLC-MS/MS系统进行分析。经过三次重复实验，从第一步酶解肽段中鉴定到1055种蛋白，从第二步酶解肽段中共鉴定到437种蛋白。根据GO分析结果、GRAVY值及跨膜结构数可知膜蛋白数分别为477（45.2%）和212（48.5%）。根据图3的维恩图可知，第二步酶解额外鉴定到126种蛋白，其中70种为膜蛋白。经过第二步酶解鉴定到的膜蛋白比例更高，由此可见该路线的两步酶解法更适用于序列中赖氨酸比例较少的膜蛋白组学的研究，这一特点对膜蛋白组学的研究具有深远意义。
本发明实用高效，重复性好，稳定性高，能够很好解决膜蛋白研究中的实际问题，在膜蛋白的大规模鉴定中有广阔的应用前景。
附图说明
图1蛋白可逆固定两部酶解法实验流程图，第一步在材料表面修饰含有二硫键的基团；第二步将蛋白共价键和到材料表面；第三部进行两步酶解。
图2Fe3O4PEG-Tresyl（红色）和Fe3O4PEGADC（黑色）的傅里叶变换红外光谱图。
图3两步酶解法所鉴定到的总蛋白维恩图及膜蛋白维恩图（每个数据均经过三次重复实验得到）。
具体实施方式
实施例1：基于二硫键可控断裂特性的膜蛋白组学研究路线对特殊膜蛋白的酶解效果考察，并与过滤辅助样品预处理法进行比较
细菌视紫红质蛋白（bR）溶液（浓度为0.5～1.0mg/mL）与经过EDC、NHS活化的Fe3O4PEGADC磁性纳米材料混合后，在37℃条件下，震荡反应2小时。所得材料经过充分洗涤后，重新分散在50μLNH4HCO3（25mM）溶液中，进行两步法酶解。第一步：加入1.0～2.0μgTrypsin，37℃下过夜酶解。磁性分离后分别得到1号肽段样品。第二步：材料中加入10～20mMDTT溶液，在56℃下反应1小时，随即加入IAA至终浓度为25～50mM，在室温下避光反应1小时。磁性分离后得到还原烷基化的残余肽段，并加入0.5～1.0μgGlu-C，继续在37℃下过夜酶解，得到2号肽段样品。，冻干后进行1DRPLC-MS/MS的检测。
过滤辅助样品预处理法操作步骤：50μgbR溶液在含有4%SDS的PBS溶液（50mM，pH8.0），并转移到超滤管（滤膜规格为10K，体积为500μL）中，加入置换缓冲液（0.1MTris-HCl，8M尿素，pH8.0）至200μL的刻度，在12,000g的转速下进行溶液置换。相同操作重复五次，除去SDS后，改用50mMNH4HCO3溶液进行置换，除去高浓度的尿素。最后在超滤管中加入200μL浓度为10ng/μL的Trypsin溶液进行过夜酶解。最后经过离心得到肽段溶液，冷冻干燥后进行1DRPLC-MS/MS的检测。
实施例2：基于二硫键可控断裂特性的膜蛋白组学研究路线在Hela细胞膜蛋白大规模鉴定中的应用
10～20mgFe3O4PEGADC磁性纳米材料分散在含有0.1～0.2mmolEDC和0.1～0.2mmolNHS的MES缓冲溶液中，常温下反应30分钟。除去多余EDC和NHS后，加入50μgHela细胞膜蛋白提取液（含有4%SDS的MES溶液，pH5.0～6.0），在37℃下反应3小时。材料经过去离子水洗涤除去SDS后，进行两步法酶解。第一步：材料分散在50μLNH4HCO3（25mM）溶液中，并加入1μgTrypsin，37℃下过夜酶解。磁性分离后分别得到1号肽段样品。第二步：材料中加入10mMDTT溶液，在56℃下反应1小时，随即加入IAA至终浓度为25mM，在室温下避光反应1小时。磁性分离后得到还原烷基化的残余肽段，并加入0.5μgGlu-C，继续在37℃下过夜酶解，得到2号肽段样品。所得到的两个肽段样品冻干后进行1DRPLC-MS/MS的检测。
表1，通过过滤辅助样品辅助法（FASP）和可逆共价固定法（RCI）对细菌视紫红质蛋白（bR）进行酶解鉴定到的肽段（小写字母表示该氨基酸含有烷基化乙酰半胱氨酸修饰）
。

Claims (6)

1.一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）通过一系列反应将半光胺和乙酰半胱氨酸中的两个巯基相连，形成由二硫键连接氨基与羧基而得到的化合物，记为ADC；
（2）利用ADC的氨基与表面修饰有三氟乙磺酸酯基的磁性纳米材料Fe3O4PEG-tresyl进行反应，形成表面含有丰富羧基的新型磁性纳米材料，记为Fe3O4PEGADC；
（3）将膜蛋白键合到新型磁性纳米材料Fe3O4PEGADC表面；
（4）用胰蛋白酶进行第一步酶解，使疏水性的膜蛋白暴露出亲水性的羧基，然后再进行还原烷基化，破坏未被酶切的肽段与材料之间的二硫键，将材料表面的残余肽段洗脱下来；再进行第二步酶解，即选用活性位点为谷氨酸的Glu-C进行残余肽段的酶解。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）所述形成化合物ADC的具体操作过程如下：
把0.5～1.0mL偶氮二甲基二乙酯和200～400mg半胱胺溶解在10～20mL二氯甲烷溶剂中，氮气氛围中室温下过夜反应；将二氯甲烷蒸干，然后使用柱层析分离对产物进行提纯，去除水相中未反应的半胱胺；将所得中间产物重溶在3～6mL四氢呋喃中，并加入200～400mg乙酰半胱氨酸，在氩气中40～60℃反应48～72h；经过柱色谱分离后便得到较纯的ADC。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（2）所述形成表面含有丰富羧基的新型磁性纳米材料Fe3O4PEGADC的具体操作过程如下：
将所得ADC重溶在1～2mL乙腈中，转移到20～40mLPBS缓冲溶液中，超声使其分散均匀；加入1.0～2.0gFe3O4PEG-tresyl磁性纳米材料，在室温下过夜反应；再磁性分离，去除未反应ADC，加入封闭缓冲液，反应去掉多余的tresyl活性基团；反应0.5～1h后，除去多余封闭缓冲液，然后分别用水、乙醇洗涤数次，即得到新型磁性纳米材料Fe3O4PEGADC，烘干待用。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（3）所述将膜蛋白键合到新型磁性纳米材料Fe3O4PEGADC表面的具体操作过程如下：
使用EDC和NHS对Fe3O4PEGADC磁性纳米材料表面的羧基进行活化：EDC和NHS按照1：1～2：1的比例溶解在1～2mLMES缓冲溶液中，再加入10～20mgFe3O4PEGADC磁性纳米材料，常温下活化0.5～1h后磁性分离，去除多余的反应物；细菌视紫红质蛋白溶解在含有4%SDS的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液（MES），配制成浓度为0.5～1.0mg/mL的蛋白溶液；将Fe3O4PEGADC磁性纳米材料重新分散在90～180μLMES缓冲溶液中，并加入10～20μL蛋白溶液，在30～40℃条件下，震荡反应2～3小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（4）所述进行两步酶解的具体操作过程如下：
将所得材料经过充分洗涤后，重新分散在50～100μLNH4HCO3溶液中，进行两步法酶解：第一步，加入1.0～2.0μgTrypsin，30～40℃下过夜酶解；磁性分离后分别得到1号肽段样品；第二步，材料中加入10～20mMDTT溶液，在50～60℃下反应45min～1h，随即加入IAA至终浓度为25～50mM，在室温下避光反应0.5～1h；磁性分离后得到还原烷基化的残余肽段，并加入0.5～1.0μgGlu-C，继续在37℃下过夜酶解，得到2号肽段样品；
两个肽段样品冻干后进行RPLC-MS/MS分离鉴定。
6.如权利要求1-5之一所述方法在各种细胞或组织膜蛋白鉴定中的应用。
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