CN102412046A - 富集叠氮标记生物大分子的磁性纳米材料及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的表面化学修饰磁性材料以及利用该材料富集叠氮标记生物大分子的方法。本发明将磁性纳米材料与现有技术中的分离策略相结合,将末端炔基通过可断裂的基团固定在超顺磁性磁珠上,形成含有末端炔基的新型表面修饰磁珠。此外,还通过Cu(I)催化点击化学反应,使叠氮基团与磁珠表面炔基形成共价键;利用磁珠的超顺磁性,富集和分离被共价结合的物质;最后通过断裂磁珠表面的可断裂基团,游离含叠氮标记的生物大分子,达到富集叠氮基团标记的生物大分子的目的。与现有技术相比,具有操作简化,效率提高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种富集叠氮标记生物大分子的磁性纳米材料及其制备与应用,具体地讲,是涉及一种基于炔基及二硫键修饰的磁性纳米材料以及利用该材料富集叠氮标记生物大分子的新方法。
背景技术
1.蛋白质O-GalNAc糖基化与生物正交性活体代谢标记
蛋白质的糖基化是糖链(或单个单糖)在糖基转移酶作用下结合到蛋白质特定氨基酸残基上的一种修饰。据估计细胞中50%以上的蛋白质具有糖基化现象[Hagglund,P.,et al.,A newstrategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of theirglycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.Journal of ProteomeResearch,2004.3(3):p.556-566.]。糖基化修饰对蛋白质的结构功能起重要的调控作用,与各种生理现象密切相关,例如影响蛋白质的构象和折叠,进而参与各种识别过程[Varki,A.,Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins.Nature.2007.446(7139):p.1023-1029.]。但由于存在微不均一性等原因,对蛋白质糖基化的分析曾是非常困难的。近年来有许多方法学的进展,使得蛋白质糖基化的研究逐渐变得可行[Marino,K.,et al.,A systematic approach to protein glycosylation analysis:a path through the maze.NatureChemical Biology,2010.6(10):p.713-723.]。蛋白质的糖基化修饰主要有N-糖基化和O-糖基化两种形式。蛋白质的N-糖基化有较多的保守特征,因此较容易分析。在最近的研究中,Mann等从小鼠组织和血浆中鉴定了2353个蛋白上有6367个N-糖基化位点[Zielinska,D.F.,et al.,Precision Mapping of an In Vivo N-Glycoproteome Reveals Rigid Topological and SequenceConstraints.Cell,2010.141(5):p.897-907.]。蛋白质O-糖基化形式有O-GlcNAc、O-Mannose、O-Fucose、O-Glucose、O-Xylose等形式,其中最主要的是以O-GalNAc起始的黏蛋白型的O-糖基化。O-GalNAc有重要的生物学功能。例如O-GalNac起始的Core 1结构大量分布在发育分化后神经元轴突表面[Wu,A.M.,et al.,Differential binding properties of Gal/GalNAcspecific lectins available for characterization of glycoreceptors.Indian Journal ofBiochemistry & Biophysics,1997.3(1-2):p.61-71.];在细胞癌变与肿瘤发展过程中常常伴随有O-GalNAc糖基化的变化,因此,O-GalNAc糖基化的结构研究具有重要意义。但是由于蛋白质的O-GalNAc糖基化修饰不具有规律和保守性,其结构复杂,从分离富集到质谱鉴定都存在许多问题[Wang,S.,X.Zou,and Y.Zhang,Mass Spectrometry Based Analysis of ProteinO-glycosylation.Progress in Chemistry,2010.22(12):p.2428-2435.]。利用生物正交性标记方法为蛋白质糖基化研究提供了新的突破途径。
近年来生物正交性活体代谢标记技术获得了广泛的应用,如生物正交性非经典氨基酸标记(BONCAT)技术[Dieterich,D.C.,et al.,Selective identification of newly synthesizedproteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging(BONCAT).Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006.103(25):p.9482-9487.],以及天然单糖叠氮类似物标记的技术[Laughlin,S.T.and C.R.Bertozzi,Imaging the glycome.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2009.106(1):p.12-17.]。这些技术的成功是基于叠氮(或炔基)的独特性质:1)叠氮(或炔基)的体积很小,对被标记的生物大分子的物理化学性质影响较小,基本不会改变生物大分子的代谢和生化途径。例如GalNAz(单糖GalNAc的一种叠氮类似物)可以和GalNAc一样被糖基转移酶利用,对蛋白进行O-GalNAc糖基化修饰,以至形成叠氮标记的O-糖基化蛋白[Dube,D.H.,et al.,Probing mucin-type O-linked glycosylation in living animals.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006.103(13):p.4819-4824.]。又例如L-azidohomoalanine可以被蛋白合成系统当作蛋氨酸(Methionine),进而对蛋白进行叠氮标记[Dieterich,D.C.,et al.,Selective identification of newlysynthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging(BONCAT).Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2006.103(25):p.9482-9487.]。2)叠氮(或炔基)在生物体内基本保持惰性,不与生物体内的其他物质发生反应。可进行叠氮(或炔基)特异性的化学反应,如叠氮可以和Phosphine发生反应[Laughlin,S.T.and C.R.Bertozzi,Metabolic labeling of glycans with azido sugars andsubsequent glycan-profiling and visualization via Staudinger ligation.Nature Protocols,2007.2(11):p.2930-2944.],叠氮可以和炔基发生铜催化的环加成反应[Demko,Z.P.and K.B.Sharpless,A click chemistry approach to tetrazoles by Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition:Synthesis of 5-acyltetrazoles from azides and acyl cyanides.Angewandte Chemie-InternationalEdition,2002.41(12):p.2113-2116.]。这些反应都是高度化学选择性的,便利后续的检测分析。但针对被叠氮标记生物大分子的富集,最适宜的反应仍是Cu(I)催化的末端炔基与叠氮的点击环加成化学反应。[Besanceney-Webler,C.,et al.,Increasing the Efficacy ofBioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation:A Comparative Study,Angewandte ChemieInternational Edition,DOI:10.1002/anie.201101817]。
在对生物体进行生物正交性标记以后,叠氮基团进入生物合成途径,并出现在相应的蛋白质上。通过后续的叠氮特异性反应,将荧光基团与含有叠氮的分子相连接,从而跟踪叠氮标记的分子。例如Bertozzi等采用了Ac4GalNAz对蛋白的O-糖链进行叠氮标记,并进一步使用荧光试剂以跟踪显示新合成的O-糖链[Laughlin,S.T.,et al.,In vivo imaging ofmembrane-associated glycans in developing zebrafish.Science,2008.320(5876):p.664-667.]。
2.富集手段
生物正交性标记加荧光检测的方法能获取的信息十分有限。为了真正解决生物学问题,解析糖基化或其他相关生物大分子的功能,必须鉴定这些标记了叠氮基团的蛋白(多肽)。由于在细胞中被叠氮标记的蛋白含量很少,首先需要解决利用叠氮基团修饰的蛋白(多肽)的富集问题。
现有的针对叠氮修饰蛋白(多肽)的富集技术主要有如下几种:1)利用叠氮特异性的反应使这些蛋白通过与生物素和亲和素结合的亲和纯化技术,富集标记蛋白。为了提高本策略的效率,出现了一些易于断裂的生物素试剂。这种试剂一般是线性分子,一端是生物素,另一端是叠氮反应性基团,中间是容易断裂的基团[Szychowski,J.,et al.,CleavableBiotin Probes for Labeling of Biomolecules via Azide-Alkyne Cycloaddition.Journal of theAmerican Chemical Society,2010.132(51):p.18351-18360.][Zaro,B.W.,et al.,Chemicalreporters for fluorescent detection and identification of O-GlcNAc-modified proteins revealglycosylation of the ubiquitin ligase NEDD4-1.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America,2011.108(20):p.8146-8151.]。2)将叠氮反应性基团(例如环辛炔)和容易断裂的二硫键基团固定在高聚物上,从而实现富集分离的目的[Nessen,M.A.,et al.,Selective Enrichment of Azide-Containing Peptides from Complex Mixtures.Journalof Proteome Research,2009.8(7):p.3702-3711.]。3)利用叠氮被还原生成氨基根据相关物质色谱保留值的改变而进行目标蛋白的富集分离[Kramer,G.,et al.,Identification andQuantitation of Newly Synthesized Proteins in Escherichia coli by Enrichment ofAzidohomoalanine-labeled Peptides with Diagonal Chromatography.Molecular & CellularProteomics,2009.8(7):p.1599-1611.]。但这些富集方法存在操作步骤较多、操作不便的缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足,提供一种基于炔基及二硫键修饰的磁性纳米材料以及利用该材料富集叠氮标记生物大分子的新方法,以简化现有技术中富集分离叠氮标记生物大分子的操作过程。
本发明提出了一种与已报道的方法不同的利用磁性纳米材料分离生物正交性(叠氮)标记大分子的方法:将末端炔基通过可断裂的二硫键基团固定在超顺磁性磁珠上,首先制备出特殊化学修饰的超顺磁性纳米材料(磁珠),然后再利用该磁珠的超顺磁性和磁珠表面的特异性修饰达到富集分离生物大分子的目的。
为达到上述目的,本发明一方面提供了一种富集叠氮标记生物大分子的磁性纳米材料,采用的技术方案如下:
一种磁性纳米材料,其特征在于,包括SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒,且该SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒的表面共价连接含有可断裂基团的分子;所述含有可断裂基团的分子的末端为可与叠氮特异性反应的基团。
所述含有可断裂基团的分子是指,可断裂基团的两端分别通过具有一定结构的分子结构单元,连接于SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒的表面和可与叠氮特异性反应的基团(末端炔基)。
较佳的,所述可断裂基团选用二硫键;所述可与叠氮特异性反应的基团选用末端为炔基的基团。即所述含有可断裂基团的分子中,二硫键的两端分别通过具有一定结构的分子结构单元,连接于SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒的表面和末端炔基上。
较佳的,所述末端为炔基的基团可以是具有如下结构式的基团:
HC≡C-R
其中:R选自以下基团:任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基。
较佳的,所述可断裂基团的结构通式如式(I)所示:
式中:R1与磁珠相连接,R2与末端炔基相连接,R1和R2的分子结构不限。优选的,R1和R2分别为含有酰胺键的基团。
优选的,所述含有可断裂基团的分子的结构式如下:
R1为任意共价线型或分叉的结构,R2为任意共价线型或分叉的结构,并且R2共价结合在磁珠的表面上。进一步优选的,R1和R2分别为含有酰胺键的基团。
较佳的,所述SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒的直径为50~450nm,SiO2包覆层的厚度为5~100nm。
作为本发明中的一种优选实施方式,所述含有可断裂基团的分子的结构式如下:
式中:m为2-10的整数,n为1-8的整数;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;R、R4和R5分别选自以下基团:任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基。
进一步优选的,m为2-10的整数,n为1-8的整数;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;R、R4和R5分别任选取代或未取代的C1-C12烷基。
更进一步优选的,m=3,n=3;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;R任选取代或未取代的C2-C5烷基;R4和R5分别为乙基。即所述含有可断裂基团的分子的结构式如下:
本发明还进一步公开了当含有可断裂基团的分子的结构式为式(III)时,所述磁性纳米材料的制备方法,包括如下步骤:
1)制备表面具有羧基修饰的SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒;
2)使SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面的羧基与H2N-R8-NH2的一个氨基缩合形成酰胺键;
3)使步骤2)中所述H2N-R8-NH2的另一个氨基与末端为可与叠氮特异性反应的基团的羧酸发生缩合反应,形成所述磁性纳米材料;
其中:R8为包含二硫键的分子基团。所述末端为可与叠氮特异性反应的基团的羧酸选用末端为炔基的羧酸。
较佳的,所述末端为炔基的羧酸的结构式为C≡C-R-COOH;其中:
R选自以下基团:氢、任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基。
优选的,R任选取代或未取代的C1-C12烷基。进一步优选的,R任选取代或未取代的C1-C4烷基;例如4-戊炔酸和6-庚炔酸,5-己炔酸,3-丁炔酸等。
优选的,所述H2N-R8-NH2为胱胺。
步骤1)中,所述制备表面具有羧基修饰的SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒,包括如下步骤:
a)将SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒超声分散于如式(1)所示的硅烷的甲苯溶液中,然后室温搅拌或振摇10~24h,获得氨基修饰的SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒;
式中:m为2-10的整数;R9选自甲氧基、乙氧基;优选的,m=3,R9为乙氧基;
b)向步骤1)获得的产物分散于四氢呋喃(THF)中加入酸酐和吡啶,室温搅拌1~24h,获得表面具有羧基修饰的SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒。
步骤a)中,所述式(1)所示的硅烷的甲苯溶液中含有5~25%(v/v)的式(1)所示的硅烷。
步骤b)中,所述酸酐为二酸酐,例如戊二酸酐、马来酸酐、丁二酸酐,己二酸酐等,优选为戊二酸酐。
较佳的,步骤b)中,所述酸酐与吡啶的摩尔比为(0.5~10)∶1。
作为本发明中的另一种优选实施方式,所述含有可断裂基团的分子的结构式如下:
式中:m为2-10的整数;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;R、R4和R5分别选自以下基团:任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基。
进一步优选的,m为2-10的整数;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;R、R4和R5分别任选取代或未取代的C1-C12烷基。
更进一步优选的,m=3;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;R任选取代或未取代的C2-C5烷基;R4和R5分别为甲基。即所述含有可断裂基团的分子的结构式如下:
本发明还进一步公开了当含有可断裂基团的分子的结构式为式(V)时,所述磁性纳米材料的制备方法,包括如下步骤:
1)制备表面具有氨基修饰的SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒;
2)使SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面的氨基与HOOC-R8-COOH的一个羧基缩合形成酰胺键;
3)使步骤2)中所述HOOC-R8-COOH的另一个羧基与末端为可与含有叠氮特异性反应的基团的伯胺发生缩合反应,形成所述磁性纳米材料;
其中:R8为包含二硫键的分子基团。所述末端为可与叠氮特异性反应的基团的伯胺选用末端为炔基的伯胺。
较佳的,所述末端为炔基的伯胺的结构式为C≡C-R-NH2;其中:
R选自以下基团:任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基。
优选的,R任选取代或未取代的C1-C12烷基。进一步优选的,R任选取代或未取代的C1-C4烷基;例如4-戊炔胺、6-庚炔胺、5-己炔胺、3-丁炔胺、丙炔胺等。
优选的,所述HOOC-R8-COOH为
步骤1)中,所述制备表面具有羧基修饰的SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒,包括如下步骤:将SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒超声分散于如式(1)所示的硅烷的甲苯溶液中,然后室温搅拌或振摇10~24h,获得氨基修饰的SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒;
式中:m为2-10的整数;R9选自甲氧基、乙氧基;优选的,m=3,R9为乙氧基。所述式(1)所示的硅烷的甲苯溶液中含有5~25%(v/v)的式(1)所示的硅烷。
作为本发明中的另一种优选实施方式,所述含有可断裂基团的分子的结构式如下:
式中:m为2-10的整数;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;
R、R4和R5分别选自以下基团:任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基;
R6和R7分别选自以下基团:氢、任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基。
进一步优选的,m为2-10的整数;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;R、R4和R5分别任选取代或未取代的C1-C12烷基;R6和R7分别选自氢、取代或未取代的C1-C12烷基。
更进一步优选的,m=3;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;R任选取代或未取代的C2-C5烷基;R4和R5分别为甲基;R6和R7为氢。即所述含有可断裂基团的分子的结构式如下:
本发明还进一步公开了当含有可断裂基团的分子的结构式为式(VII)时,所述磁性纳米材料的制备方法,包括如下步骤:
1)制备表面具有氨基修饰的SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒;
特异性反应的基团的伯胺反应形成亚胺,再进行还原,形成所述磁性纳米材料;
其中:R8为包含二硫键的分子基团,R6和R7分别选自以下基团:氢、任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基。
所述末端为可与叠氮特异性反应的基团的伯胺选用末端为炔基的伯胺。
较佳的,所述末端为炔基的伯胺的结构式为HC≡C-R-NH2;其中:
R选自以下基团:任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基。
优选的,R任选取代或未取代的C1-C12烷基。进一步优选的,R任选取代或未取代的C1-C4烷基;例如4-戊炔胺、6-庚炔胺、5-己炔胺、3-丁炔胺、丙炔胺等。
步骤1)中,所述制备表面具有羧基修饰的SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒,包括如下步骤:将SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒超声分散于如式(1)所示的硅烷的甲苯溶液中,然后室温搅拌或振摇10~24h,获得氨基修饰的SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒;
式中:m为2-10的整数;R9选自甲氧基、乙氧基;优选的,m=3,R9为乙氧基。所述式(1)所示的硅烷的甲苯溶液中含有5~25%(v/v)的式(1)所示的硅烷。
本发明中,所述SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒可以由下述方法获得:
i)在乙二醇中加入FeCl3·6H2O,搅拌均匀后再加入无水乙酸钠和柠檬酸三钠,室温搅拌;所得混合液于190~210℃下密封反应8~12h;冷却至室温后,在磁力作用下沉淀磁珠后,并用乙醇和水清洗后获得的Fe3O4磁珠;
ii)将步骤i)所制备的Fe3O4磁珠,加入浓氨水(质量浓度为25~28%)、去离子水和乙醇的混合液中,超声5~10min;之后再加入正硅酸乙酯(TEOS),室温搅拌过夜,得到在Fe3O4外面包覆一层SiO2的纳米颗粒。
所述步骤i)中,FeCl3·6H2O、无水乙酸钠和柠檬酸三钠的质量比优选为1∶1.6∶0.24。
所述步骤ii)中,Fe3O4磁珠、浓氨水、去离子水、乙醇和正硅酸乙酯的配比优选为:(10-700)mg∶3ml∶50ml∶150ml∶(0.5-5)ml。
本发明的另一方面,还公开了上述磁性纳米材料的用途,即所述磁性纳米材料在富集被叠氮基团修饰的生物大分子中的应用。
所述叠氮基团来自GalNAz、ManNAz、GlcNAz、6-AzFuc、SiaNAz、AHA等叠氮衍生物;所述生物大分子包括糖脂、糖肽、多肽、蛋白和核酸等。
上述叠氮基团的中英文名称如下:
GalNAz:N-azidoacetylgalactosamine(GalNAz,N-叠氮乙酰半乳糖胺);
ManNAz:N-azidoacetylmannosamine(ManNAz,N-叠氮乙酰甘露糖胺);
GlcNAz:N-azidoacetylglucosamine(GlcNAz,N-叠氮乙酰葡萄糖胺);
6AzFuc:6-azidofucose(6AzFuc,6-叠氮岩藻糖);
SiaNAz:N-azidoacetyl sialic acid(N-叠氮乙酰唾液酸)
AHA:azidohomoalanine (AHA,2-氨基-4-叠氮-丁酸)。
优选的,所述被叠氮基团修饰的生物大分子为GalNAz修饰的糖肽。
本发明的再一方面,提供了一种富集叠氮标记生物大分子的方法,包括如下步骤:
1)将上述磁性纳米材料与被叠氮基团修饰的生物大分子物质混合,在pH为6.5-8.0的溶液中,进行Cu(I)催化点击化学(Click Chemistry)反应,使叠氮基团与所述磁性纳米材料表面的可与叠氮特异性反应的基团形成共价连接;
2)去除磁性纳米材料表面未被共价结合的分子;然后采用还原条件断裂磁性纳米材料表面的可断裂基团;最后游离洗脱富集在磁性纳米材料表面的目的分子(被叠氮基团修饰的生物大分子)。
本发明提供了一种与已报道的方法不同的利用磁性纳米材料分离生物正交性(叠氮)标记大分子的方法,简化了现有技术中富集分离叠氮标记生物大分子的操作过程。本发明将磁性纳米材料与现有技术中的分离策略相结合,将末端炔基通过可断裂的基团固定在超顺磁性磁珠上,形成含有末端炔基的新型表面修饰磁珠。此外,还通过Cu(I)催化点击化学反应,使叠氮基团与磁珠表面炔基形成共价键;利用磁珠的超顺磁性,富集和分离被共价结合的物质;最后通过断裂磁珠表面的可断裂基团,游离含叠氮标记的生物大分子,达到富集叠氮基团标记的生物大分子的目的。
利用本发明所提供的磁性纳米材料(磁珠)可以从复杂的生物样本中,简单、高效和选择性地富集含有叠氮标记(如GalNAz修饰)的糖肽。该磁珠还适用于叠氮基团标记的其他生物大分子的分离富集,如单糖的叠氮类似物修饰的多肽和蛋白、叠氮取代氨基酸修饰的多肽和蛋白,叠氮修饰的核酸,脂质分子等。与现有技术相比,利用本发明所提供的磁珠对溶液中的含叠氮物质进行点击化学捕获和后续清洗、洗脱操作,具有操作简化,效率提高的优点。
附图说明
图1炔基及二硫键修饰纳米磁珠的制作原理流程图
图2磁珠捕捉和释放荧光GalNAz修饰多肽的反应原理图
图3SiO2包覆的Fe3O4磁珠的透射电子显微镜照片(Hitachi H-600)
图4(A-D)本发明磁珠制备过程中表面修饰基团的差异红外吸收光谱图
图4A.磁珠硅烷化后的红外吸收增长
图4B.戊二酸酐修饰后的红外吸收增长
图4C.胱胺修饰后的红外吸收增长
图4D.缩合6-庚炔酸后红外吸收增长
图5ppGalNAc-T酶反应前GalNAz未修饰Muc5ac-FAM多肽的HPLC色谱图
图6ppGalNAc-T酶反应后被GalNAz修饰产物多肽的HPLC色谱图
图7GalNAz未修饰Muc5ac-FAM多肽的质谱图
图8HPLC保留时间为10.585分钟的物质峰的质谱图
图9HPLC保留时间为11.048分钟的物质峰的质谱图
图10HPLC保留时间为12.270分钟的物质峰的质谱图
图11比较溶液中不同浓度标准荧光多肽的磁珠捕捉-释放效率
图12在不同结合和洗脱条件下的磁珠表面荧光多肽的结合情况
上图:点在玻片上的磁珠表面荧光扫描图(488nm通道)
下图:点在玻片上的磁珠的白光对照图
图13磁珠富集分离后的标准GalNAz糖肽的MALDI-TOFMS质谱图(Bruker Autoflex,基质为DHB)
图14磁珠富集分离后的标准GalNAz糖肽的MALDI-TOFMS质谱图(AB SCIEX TOF/TOFTM5800,基质为CHCA)
图15Ac4GalNAz标记的western blot及考马斯亮蓝效果验证
WB:一抗为anti-FLAG(1∶2000稀释,Sigma),二抗为驴抗鼠680nm(1∶10000稀释);被标记的蛋白能够清楚地被检测到。
图16:磁珠富集的荧光检测结果
图17:磁珠成功富集标记蛋白的银染结果
Input:反应前细胞裂解液蛋白和荧光多肽混合液4μl
FT:click反应后的上清4μl
Elute1:一次洗脱后的上清:20μl
Elute 2:两次洗脱后的上清:20μl
比较标记的和未标记的细胞,未标记的细胞FT中残留更多的蛋白,标记的细胞洗脱下较多被标记的蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明,而非限制本发明的范围。
以下实施例中,将术语“磁性纳米材料”简称为“磁珠”。
实施例1、用于富集的磁性纳米材料的制备:
炔基及二硫键修饰纳米磁珠的制作原理流程见图1,详述如下:
1)超顺磁性Fe3O4磁珠核心的制备:在80mL乙二醇中加入3.0g FeCl3·6H2O,室温搅拌30min,再加入4.8g无水乙酸钠和0.72g柠檬酸三钠,继续搅拌1h。将混合液倒入100mL聚四氟乙烯反应杯中并密封于不锈钢反应釜中,在200℃加热8~12h。冷却至室温后,在磁力作用下沉淀磁珠后,用乙醇和水清洗3次最终获得的Fe3O4磁珠。
2)羧基磁珠的制备:将10~700mg步骤1)所制备的Fe3O4磁珠置于50mL离心管内,加入3mL浓氨水(25~28wt%),50mL去离子水和150mL 95%乙醇,超声5~10min。之后加0.5~5mL正硅酸乙酯(TEOS),室温搅拌过夜,从而在Fe3O4外面包覆一层SiO2,记为Fe3O4SiO2。用透射电子显微镜检验确认包覆的程度(如图3所示)。图3显示,磁珠直径约100~150nm,SiO2层厚约5~20nm。将磁珠Fe3O4SiO2用乙醇、水反复清洗后,真空干燥0.5~3h。再超声分散于5~25%(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的甲苯溶液中,室温搅拌或振摇10~24h,从而将氨基修饰在磁珠表面。将氨基修饰的磁珠用乙醇、水反复清洗后,分散于100mL四氢呋喃(THF)中,加入0.5~2g戊二酸酐和1~3mL吡啶,室温搅拌1~24h,清洗后得表面修饰羧基的磁珠。
3)用于富集GalNAz修饰糖肽的磁珠的制备:取羧基修饰的磁珠10~800mg,分散于10~100mL甲醇中,加0.1~0.55g胱胺二盐酸盐(Cystamine·2HCl),50~500μL三乙胺(TEA),0.1~0.55g1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)超声15min,搅拌或振摇3~24h。产物用水和乙醇各清洗3次,再分散于100mL甲醇中,加10~150μL 6-庚炔酸,50~200μL TEA(d=0.729,Mw=101,作用是中和盐酸)和0.1~0.5g EDC·HCl超声15min,搅拌或振摇4~40h。产物用水和乙醇各清洗3次,再真空干燥后备用,4℃保存。磁珠记为“KSM”(Alkyne-Disulfide-Magnetic Beads)。
红外吸收光谱分析:取少量磁珠,用KBr分散压片,测定400~4000cm-1范围的红外吸收光谱。通过差减法得知每一步修饰反应所造成的磁珠红外吸光谱的差异。在图4A中,由于硅烷化磁珠表面的羟基减少导致3500cm-1附近吸收的减弱;在图4B中,羧基修饰引起3500cm-1、1650cm-1左右的吸收增加;在图4C中,胱胺修饰引起3500cm-1,1600cm-1左右的吸收进一步增加;而在图4D中,6-庚炔酸的修饰,由于氨基被缩合形成酰胺键,产生3500cm-1、1600cm-1处的吸收大幅降低,同时由于增加了饱和和不饱和的碳链引起3000cm-1附近的吸收增加。以上结果证明,反应顺利进行,磁珠上形成了符合预期的修饰结构。而后面的质谱分析也支持了本结果。
实施例2、标准GalNAz糖基化多肽的制备
标准GalNAz糖基化多肽的制备是通过多肽:N-乙酰半乳糖基转移酶(ppGalNAc-T2)对5-FAM荧光素标记的Mucin多肽Muc5ac-FAM(序列为:SAPTTSTTSAPTK)进行叠氮化N-乙酰氨基半乳糖苷(GalNAz)的糖基化修饰反应而完成的。该反应是在含有25mM Tris-HCl(pH值为7.4),5mM MnCl2以及0.2%(v/v)Triton X-100的10μL反应体系进行的,该反应体系的糖供体底物是UDP-GalNAz(250mM,上海有机化学研究所合成),受体底物为Muc5Ac-FAM(25mM),ppGalNAc-T2在每个反应体系中为25ng。在37℃反应12个小时之后,在95℃加热3分钟以终止反应。
反应结束后,通过HPLC分离得到纯化的GalNAz糖基化的Muc5ac-FAM糖肽。具体操作如下:将10μL的反应液稀释至50μL,上样20μL,通过Cosmosil 5C18-AR反相分析柱(4.6×250mm)进行分离。柱温40℃,流速1mL/min,A相为0.05%TFA的水溶液,B相为0.05%TFA的乙腈溶液。16分钟内B相由20%升至28%。荧光检测器的扫描通道设定为:激发光495nm,发射光520nm。图5是反应前的Muc5Ac多肽的液相色谱图,图6是反应后的液相色谱图。反应前的底物峰保留时间为10.621min,反应后的产物峰保留时间分别为10.585min,11.048min和12.270min,收集相应馏分进行质谱鉴定。
对GalNAz修饰反应前后的荧光多肽进行MALDI-TOF/TOF质谱分析(Bruker AutoflexMALDI-TOF MS,分析基质为2,5-二羟基苯甲酸(DHB)),质谱分析结果分别显示在图7(反应前底物峰)、图8(保留时间为10.585分钟的产物峰),图9(保留时间为11.048分钟的产物峰)和图10(保留时间为12.270分钟的产物峰)。
根据分子量计算可知:每增加一个GalNAz修饰,分子量增加M++244(262-18)m/z;在MALDI-TOF条件下GalNAz的叠氮结构容易丢失一个N2分子,同时还原增加两个氢原子,产生26m/z的分子量丢失峰,表述为[M+-N2+2H];同时由于糖苷键的能量较肽键能量低,GalNAz集团容易先从多肽上脱落,产生244m/z的丢失,表述为[M+-GalNAz+],从而产生非修饰峰。根据以上三点离子形成规律,质谱分析结果如下:
图7显示反应前Muc5ac-FAM多肽的质谱结果
1606.945m/z未修饰Muc5ac-FAM多肽[M+]
1628.935m/z为Muc5ac-FAM多肽+Na+离子[M++Na+]、
1644.863m/z为Muc5ac-FAM多肽+K+离子[M++K+];
反应后液相色谱收集到的产物峰质谱结果分别是:
图8显示HPLC保留时间10.585分钟产物峰质谱分析:
1850.961m/z为1分子GalNAz修饰的Muc5ac-FAM多肽[M1 +]
1825.001为丢失26m/z的1分子GalNAz修饰的Muc5ac-FAM多肽[M1 +-N2+2H]
1606.823m/z为丢失了1分子GalNAz分子的Muc5ac-FAM多肽[M1 +-GalNAz+]
图9显示HPLC保留时间11.048分钟产物峰质谱分析:
2094.806m/z为2分子GalNAz修饰的Muc5ac-FAM多肽[M2 +],
2068.886m/z为丢失26m/z的2分子GalNAz修饰的Muc5ac-FAM多肽[M2 +-N2+2H]
图10显示HPLC保留时间12.270分钟产物峰质谱分析:
2338.904m/z为3分子GalNAz修饰的Muc5ac-FAM多肽[M3 +],
2312.920m/z为丢失26m/z的3分子GalNAz修饰的Muc5ac-FAM多肽[M3 +-N2+2H]
2286.790m/z为丢失2分子26m/z的3分子GalNAz修饰的Muc5ac-FAM多肽[M3 +-2(N2+2H)]。
在后续的磁珠富集分选实验中,取保留时间为10.585分钟1分子GalNAz修饰的Muc5Ac-FAM多肽作为标准GalNAz糖肽物质,根据色谱峰确定其浓度为2.2pmol/μL。
实施例3、GalNAz修饰多肽的捕捉、释放与质谱检测
1.GalNAz修饰多肽的捕捉与释放
将不同浓度(0、5、10、20pmol)的标准GalNAz糖肽,溶解在200μL 1%的Triton X-100,以及10mM pH值为7.8的磷酸盐缓冲液(PBS)中,与100μg KSM磁珠充分混合。加入抗坏血酸钠、硫酸铜、TBTA,使标准GalNAz糖肽的终浓度分别为:2mM,1mM,0.1mM。在25℃、1400rpm震荡下反应3~24个小时(图2)。
TBTA:Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine,结构式如下:
在磁力作用下,收集磁珠,去除上清液,用洗涤液(含有1%Tween(v/v)、0.2wt%SDS、0.5M NaCl以及25mM Tris7.4,溶剂为水)清洗2次,50%(v/v)的ACN(乙腈)清洗2~4次。最后将清洗后的磁珠均分4份,每份用不同的洗脱液200μL分散。洗脱液分别为:
洗脱液①含有10mM PBS(pH7.5)和50%(v/v)ACN的水溶液
洗脱液②含有10mM PBS(pH7.5)、50%(v/v)ACN和5mM DTT的水溶液
洗脱液③含有5mM NH4HCO3和50%(v/v)ACN的水溶液
洗脱液④含有5mM NH4HCO3、50%(v/v)ACN和2%(v/v)巯基乙醇的水溶液。
洗脱液①和②所分散的磁珠在37℃振摇1h,洗脱液③和④所分散的磁珠在25℃振摇1h。通过磁场富集磁珠,对吸出的上清溶液进行荧光强度检测(Synergy 2BioTek)。因为本实验所用的标准GalNAz多肽带有荧光基团(FAM),通过检测反应前后溶液中荧光强度的变化可以推算磁珠与标准GalNAz多肽结合、游离反应过程的效率(如图11所示)。图11的结果显示,针对不同浓度的标准多肽,磁珠表面的结合效率超过75%(75%-88%);5mM DTT的游离效率约在40%左右,总的回收率达到了30%以上。该结果证明了本发明可有效地富集和游离带有叠氮集团(GalNAz)的标准糖肽,证明了本发明所提供的磁珠(磁性纳米材料)的有效性。
将由洗脱液处理后的磁珠再用20μL水分散后,取0.2μL点至载玻片上,每个样品各点4次。干燥后用荧光扫描仪(GENE PIX Professional 4200A)激发光488nm通道扫描磁珠表面的荧光多肽,得图12。图12的上图显示荧光(488nm)扫描图。左半边是本发明的磁珠,在未使用还原剂(DTT、巯基乙醇)处理的磁珠表面呈现较强的荧光信号,说明标准GalNAz糖肽结合到磁珠上,而使用还原剂处理后的磁珠表面的荧光信号较弱,说明本发明磁珠结合的标准的GalNAz糖肽可以在还原剂(DTT或巯基乙醇)的作用下从磁珠表面游离洗脱掉。作为对照右侧部分的磁珠为未经本发明所述修饰的磁珠,在同样的实验条件下未经修饰的磁珠表面没有任何荧光信号变化。说明标准GalNAz糖肽被捕捉到磁珠表面是因为GalNAz多肽与本发明所述修饰部分(炔基-二硫键)发生反应的结果。图12的下图是同一玻片上磁珠样品载量的白光对照图。
2.磁珠富集分离后标准GalNAz糖肽的质谱检测
GalNAz糖肽在被磁珠捕捉和用DTT游离后质量数会发生一定的变化,根据图2所示的反应途径,还原磁珠表面二硫键后游离分子结构的分子量增加185m/z,定义为Click Tag。为验证本发明所提出的反应过程,对上述用DTT切割二硫键,对释放出来的多肽进行了质谱分析。
1)以2,5-二羟基苯甲酸(DHB)作为基质质谱检测磁珠捕获和游离后的GalNAz糖肽
将上述实施例3中所描述的从磁珠上被释放出来的多肽溶液,真空干燥,再用10μL 0.1%(v/v)的三氟醋酸水溶液(TFA)重悬,用C18-ziptip微量层析柱除盐后,用2.5μL含有50%(v/v)ACN和0.1%TFA(v/v)的水溶液洗脱,点1.0μL到MALDI质谱板上,待溶液干燥后再加0.5μL DHB溶液作为基质,干燥后进行MALDI-TOF(Bruker AutoflexMALDI-TOF MS)分析,分析结果如图13所示。图13质谱结果显示磁珠捕获游离出来的多肽质核比。图中,峰2035.9m/z,为185m/z (一个Click Tag分子)+1850.9m/z(图8显示标准GalNAz糖肽分子量)的总和,说明该物质为结合了一个Click Tag分子(185m/z)的标准GalNAz糖肽。峰2211.845m/z,是2035.9m/z的物质与DTT(154.24m/z)结合形成二硫键后,丢失两个质子[-2H],又与一个钠离子[23Na+]结合而形成的:即2035.9+154.24-2+23≈2211.845m/z。
2)以α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)作为基质的质谱检测磁珠捕获和游离后的GalNAz糖肽
按上述1)同样处理后的样品,以CHCA为基质进行MALDI-TOF质谱分析(AB SCIEXTOF/TOFTM 5800,Applied Biosystems)。图14质谱结果显示2057.9m/z为磁珠表面Click反应后结合了一个Click Tag分子(185m/z)并结合有1个Na+离子的标准GalNAz糖肽。其余的峰(1595.97,1640.01,1684.03,1728.04,1772.08)源于表面活性剂Tween。
以上质谱结果证明本发明磁珠可以对具有叠氮基团标记的多肽分子进行有效的富集和游离释放。
实施例4、复杂体系中标准GalNAz多肽的磁珠富集效果检验
取AC4GalNAz标记的慢性白血病K562细胞裂解液,混入标准GalNAz荧光多肽:Muc5ac-NAz-F,用磁珠检验其富集效果。
1.细胞标记:
取适量Ac4GalNAz储液加入到干净的培养皿中(终浓度50μM),使酒精挥发。将细胞悬液加入到培养皿中,铺板密度5×106/10cm,每盘加培养基(1640+10%FBS)至10ml,另外铺板一盘未加Ac4GalNAz的细胞作为空白对照,37℃恒温培养3天。然后将培养皿中的细胞转移到15ml离心管,12000g离心15分钟,用PBS洗三次,将细胞沉淀转移到1.5ml离心管中,-20℃保存。
2.细胞裂解:
配置细胞裂解液:含有1%(v/v)Triton X-100、10mM Nacl、50mM Tris-HCl(pH 7.4)的水溶液,用前按比例加入7×Cooktail蛋白酶抑制剂(Roche公司),混匀。每管加入细胞裂解液200μl,30s涡旋震荡,30s冰浴,持续30分钟。然后将细胞裂解液12000g,4℃离心15分钟,进行BCA蛋白定量。
3.标记验证:
取40μg标记Ac4GalNAz和未标记的蛋白与2μL Phosphine-FLAG(5mM)混匀,加入PBS补齐体积至20μL,37℃反应6h。然后将所得的样品进行SDS-PAGE,每孔上样量为10μl,重复2块胶。一块胶进行考马斯亮蓝染色;一块胶进行western blot检测,一抗为anti-FLAG(1∶2000稀释,Sigma),二抗为驴抗鼠680nm(1∶10000稀释)。结果如图15。
4.混入标准GalNAz荧光多肽,进行磁珠富集反应。
各取标记和未标记的100μg细胞裂解液蛋白和10pmol的GalNAz-Muc5ac-F(2pm0l/μL)荧光多肽混合,用10mM PBS(pH值为7.8)补齐体积至400μL,另外用20μL细胞裂解液替换蛋白作为对照。混合后的4管溶液各取20μL作为样品:input。剩余的380μL混合溶液与200μg磁珠混合后,加入催化剂混合液(含有200mM CuSO4、20mM TBTA和400mM抗坏血酸钠)1μL。然后将4只离心管弹振,超声处理,使磁珠充分分散于溶液中。置25℃,1400rpm的恒温反应器上反应2.5小时。反应后的溶液在磁铁的帮助下吸取200μL上清放入96孔板,留作荧光检测。
配制两种不同的清洗液:清洗液1(含有8M Urea和0.4M NH4HCO3的水溶液),清洗液2(含有0.5%SDS,0.4M NH4HCO3的水溶液)。用清洗液1洗3次,清洗液2洗2次,前4次清洗液使用体积每次200μl,最后一次改用50μL。先将溶液加入到含有磁珠的离心管内,弹振、超声使磁珠充分分散,再离心,磁铁帮助下吸取上清。每次清洗的上清吸入96孔板,留作荧光检测。
配制洗脱液:含有0.5%SDS、0.4M NH4HCO3和20mM DTT的水溶液。洗脱体积每次50μl,37℃,1400rpm,振摇1h,重复2次。洗脱完毕后离心,磁铁帮助下吸取上清,上清吸入96孔板内留作荧光检测。
在96孔板内未占孔中,等体积加入各种缓冲液作为空白对照,按梯度稀释标准荧光多肽制作标准曲线,将上述96孔板中的各组分测定488通道荧光。荧光检测结果如图16(为表1的棒状图表示)及下表1、表2所示:
表1实验中各阶段上清溶液的488通道荧光检测值
表2实验中各阶段上清溶液的荧光检测值根据标准曲线算得的物质的量,单位pmol
取4μl反应前的混合溶液(input),4μl click反应后的上清(FT),20μl 2次洗脱后的上清(elute)进行SDS-PAGE和银染。银染结果如图17。
5.结论:
本发明所提供的磁珠能很好的富集复杂体系中Ac4GalNAz标记的糖蛋白。
Claims (17)
1.一种磁性纳米材料,其特征在于,包括SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒,且该SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒的表面共价连接含有可断裂基团的分子;所述含有可断裂基团的分子的末端为可与叠氮特异性反应的基团。
2.如权利要求1所述的磁性纳米材料,其特征在于,所述可断裂基团选用二硫键;所述可与叠氮特异性反应的基团选用末端为炔基的基团。
4.如权利要求3所述的磁性纳米材料,其特征在于,R1和R2分别为含有酰胺键的基团。
6.如权利要求5所述的磁性纳米材料,其特征在于,R、R4和R5均为任选取代或未取代的C1-C12烷基。
7.如权利要求6所述的磁性纳米材料,其特征在于,m=3,n=3;R任选取代或未取代的C2-C5烷基;R4和R5均为乙基。
8.如权利要求4所述的磁性纳米材料,其特征在于,所述含有可断裂基团的分子的结构式如下:
式中:m为2-10的整数;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;R、R4和R5分别选自以下基团:任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基。
9.如权利要求8所述的磁性纳米材料,其特征在于,R、R4和R5分别任选取代或未取代的C1-C12烷基。
10.如权利要求9所述的磁性纳米材料,其特征在于,m=3;R任选取代或未取代的C2-C5烷基;R4和R5均为甲基。
11.如权利要求3所述的磁性纳米材料,其特征在于,所述含有可断裂基团的分子的结构式如下:
式中:m为2-10的整数;R3是SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒表面上的二氧化硅网络;
R、R4和R5分别选自以下基团:任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基;
R6和R7分别选自以下基团:氢、任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-C18芳基和任选取代或未取代的C1-C18杂芳基。
12.如权利要求11所述的磁性纳米材料,其特征在于,R、R4和R5均为任选取代或未取代的C1-C12烷基;R6和R7均为氢、取代或未取代的C1-C12烷基。
13.如权利要求12所述的磁性纳米材料,其特征在于,m=3;R任选取代或未取代的C2-C5烷基;R4和R5均为甲基;R6和R7均为氢。
14.如权利要求1-13任一所述的磁性纳米材料,其特征在于,所述SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒的直径为50~1500nm,SiO2包覆层的厚度为5~100nm。
15.如权利要求1-14任一所述的磁性纳米材料的用途,其特征在于,所述磁性纳米材料用于富集叠氮基团标记的生物大分子。
16.如权利要求15所述的磁性纳米材料的用途,其特征在于,所述叠氮基团来自GalNAz、ManNAz、GlcNAz、6-AzFuc、SiaNAz和AHA,所述生物大分子选自糖脂、糖肽、多肽、蛋白和核酸。
17.一种富集叠氮标记生物大分子的方法,包括如下步骤:
1)将如权利要求1-14任一所述的磁性纳米材料与被叠氮基团修饰的生物大分子物质混合,在pH为6.5-8的溶液中,进行Cu(I)催化点击化学反应,使叠氮基团与所述磁性纳米材料表面的可与叠氮特异性反应的基团形成共价连接;
2)去除磁性纳米材料表面未被共价结合的分子;然后采用还原的条件断裂磁性纳米材料表面的可断裂基团;最后游离洗脱富集在磁性纳米材料表面的目的分子。
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