CN107064515A - 一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒。二价铜离子在还原剂作用下被还原成一价铜离子，从而激活点击化学反应，连接两段核酸序列，磁珠分离后可进一步组装具有催化活性的催化型核酸结构，可切割底物核酸，从而使底物核酸两端的荧光基团和淬灭基团分离，通过荧光检测鉴定铜离子浓度。本发明具有较高的灵敏度，对铜离子的检测限为2 pM，检测具有很好的特异性，常见的其他干扰离子对检测不产生影响。检测过程操作简单，成本低廉，适用于实际样品中铜离子浓度的快速检测。

Description

一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于环境分析化学领域，具体涉及一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒。
背景技术
铜离子（Cu2+）是人体必需的营养元素之一，但摄入量过多又会出现中毒症状,，Cu2 +在人体富集会对大脑、肝脏、胰腺、心肌造成严重危害。人体摄取的铜主要是从水、食物及环境中获得，因此，对Cu2+含量的分析测定，具有非常重要意义。
常见的痕量铜的测定方法主要有石墨烯原子吸收光谱法以及电感耦合等离子体质谱法等。然而这些方法使用的仪器昂贵，需要专业的操作人员，限制了它们在基层实验室的使用。基于Cu2+识别的特异核酸酶序列也可用于铜离子检测，但涉及特异性核酸序列以及二级结构变换，具有较高的背景值，干扰检测灵敏度。
因此，有必要构建一种操作简单、经济便宜、灵敏度高的Cu2+检测方法和检测试剂盒。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种点击化学介导的形成催化型核酸用于铜离子的检测方法及检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种基于点击化学的铜离子检测试剂盒，包括还原剂、杂交缓冲液和下列核酸序列：
核酸序列A：A的一端修饰叠氮基团，另一端修饰有基团并固定结合在修饰有对应基团的磁珠或者胶体金；
核酸序列B：B的一端修饰炔基基团；
核酸序列C：C的两端分别与A和B互补，形成A-B-C复合物；A-B-C复合物中A修饰叠氮基团的一端靠近B修饰炔基基团的一端；
核酸序列D：D的一端与A互补，另一端与F的部分互补；从5’向3’延伸过程中，D与A或F不互补的区域内包含有一段AGCGATTAAC的碱基序列；
核酸序列E：E的一端与B互补，另一端与F的部分互补；从5’向3’延伸过程中，E与B或F不互补的区域内包含有一段GTTACACCCATGT的碱基序列；
核酸序列F：从5’向3’延伸过程中，包含有催化核酸的识别位点TrAG，识别位点两端分别有6个碱基与D和E的一端互补；Ｆ的两端分别修饰荧光基团和相应的淬灭基团。
优选的，核酸序列A的一段修饰的基团为氨基时，固定在羟基修饰的磁珠上；如果基团为巯基，固定在胶体金上；如果基团为生物素，则固定在亲和素修饰的磁珠上。这些修饰固定有利于后续的固液分离。
优选的，C与A和B完全互补，或C的两端与A和B互补，则C中间不互补区域的碱基数不超过2个。
优选的，荧光基团包括Cy3、Cy5、FAM、HEX，相应的淬灭基团包括HBQ、Dabcyl、MGB、Eclipse。
优选的，核酸序列A、B、C、D、E、F，它们的序列以及相应的修饰基团如下所述：
A：5'-NH2-CGAATCCTGAGT-N3-3'（SEQ ID NO：1）；
B：5'-CHCH-CTACAAATACCTA-3'（SEQ ID NO：2）；
C：5'-TAGGTATTTGTAGACTCAGGATTCG-3'（SEQ ID NO：3）；
E：5'-TAGGTATTTGTAGGTTACACCCATGTTACTCT-3'（SEQ ID NO：4）；
D：5'-GATATCAGCGATTAACACTCAGGATTCG-3'（SEQ ID NO：5）；
F：5'-FAM-AGAGTATrAGGATATC-BHQ-3'（SEQ ID NO：6）。
优选的，还原剂包括抗坏血酸钠、维生素C、柠檬酸盐、硼氢化钠。
优选的，杂交缓冲液为20 mM Tris-HCl缓冲液，pH为7.5，含有100 mM NaCl以及15mM MgCl2。
一种基于点击化学的铜离子检测试剂盒，包括下列步骤：
（1）先用杂交缓冲液分别溶解核酸序列A、B、C、D、E、F；将300 nM的A，300 nM的B，500 nM的C在室温充分混匀，反应30分钟，形成A-B-C复合物；
（2）将待测溶液，以及相应的还原剂溶液充分混匀，加入到A-B-C复合物中，室温反应60分钟；
（3）95℃加热5分钟，并立即冰育10分钟，磁珠分离后去上清；
（4）加入300 nM的D和E，充分混匀，室温反应30分钟；
（5）加入500 nM的F，室温反应90分钟，反应完成后，体系在495 nm激发光的激发下，记录525 nm处的荧光发射光强度；由于荧光发射光强度与铜离子浓度呈正相关来判断待测溶液中是否含有铜离子以及其浓度；
其中，还原剂、杂交缓冲液以及核酸序列A、B、C、D、E、F如上述任一项所述。
其反应原理如下所述：
（1）A核酸一端修饰氨基（-NH2），固定在羟基（-COOH）修饰的磁珠上，A也可以修饰巯基（-SH），固定在胶体金上，或者A修饰生物素，固定在亲和素修饰的磁珠上，这些修饰固定有利于后续的固液分离即可。A的另一端修饰叠氮基团。B核酸一端修饰炔基基团。C核酸与A和B互补，形成A-B-C复合物。其中A修饰叠氮基团的一端靠近B修饰炔基基团的一端。
（2）当有铜离子（Cu2+）存在时，在还原剂如抗坏血酸钠的作用下被还原成一价铜离子（Cu+），还原剂有多种可以使用，还可包括维生素C、柠檬酸盐、硼氢化钠等。A的叠氮基团和B的炔基基团在一价铜离子的催化下，通过环加成反应，形成一个三唑五元环而被连接在一起。
（3）95 ℃加热5分钟，使C和A-B分离，并立即冰育10分钟，使C与A-B保持单链。磁珠分离后去上清，保留A-B链。
（4）加入D和E，D和E中限定的核酸序列部分为催化核酸的两部分，分开无催化活性，只有靠近一起才具有催化活性。以A-B为模板，D和E靠近在一起，形成具有催化活性的催化核酸。在D序列中必须有5'-AGCGATTAAC-3'碱基，在E序列中必须有5' -GTTACACCCATGT-3'碱基，这些碱基是保证催化活性的核心。
（5）在F序列中，必须要有5'-TrAG-3'碱基，这是催化核酸的识别位点，切割位点为rA。Ｆ的两端分别修饰荧光基团和淬灭基团，只要淬灭基团能淬灭荧光基团的荧光即可。Ｆ序列在5'-TrAG-3'识别位点的两端分别有6个碱基与D和E的一端互补，过少碱基难以使F与D-E结合，过多碱基会导致背景值变高，影响检测灵敏度，优选为6个碱基数。D-E切割F，使淬灭基团和荧光基团分离，从而使荧光基团发荧光，达到检测目的。同时D-E又可以进入下一轮循环，不断切割F，最后产生大量的荧光，达到高灵敏检测目的。当体系中没有铜离子时，无法形成具有催化活性的D-E，无法切割F，此时只有背景荧光值。
本发明的有益效果是：
（1）本发明无需使用铜离子特异性核酸酶，稳定好，只需在核酸序列中修饰叠氮基团和炔基基团即可完成点击化学反应。
（2）形成的催化核酸可不断切割底物序列，产生大量荧光用于检测，灵敏度高，反应可在室温完成，催化核酸能重复切割。
（3）具有很好的选择性，常见干扰物对检测不产生影响，能用于实际样品检测，成本低廉。
附图说明
图1为本发明所述的检测方法的原理图；
图2为对不同浓度的铜离子的结果图；
图3为特异性实验结果图。
具体实施方式
一种基于点击化学的铜离子检测试剂盒，包括还原剂、杂交缓冲液和下列核酸序列：
核酸序列A：A的一端修饰叠氮基团，另一端修饰有基团并固定结合在修饰有对应基团的磁珠或者胶体金；
核酸序列B：B的一端修饰炔基基团；
核酸序列C：C的两端分别与A和B互补，形成A-B-C复合物；A-B-C复合物中A修饰叠氮基团的一端靠近B修饰炔基基团的一端；
核酸序列D：D的一端与A互补，另一端与F的部分互补；从5’向3’延伸过程中，D与A或F不互补的区域内包含有一段AGCGATTAAC的碱基序列；
核酸序列E：E的一端与B互补，另一端与F的部分互补；从5’向3’延伸过程中，E与B或F不互补的区域内包含有一段GTTACACCCATGT的碱基序列；
核酸序列F：从5’向3’延伸过程中，包含有催化核酸的识别位点TrAG，识别位点两端分别有6个碱基与D和E的一端互补；Ｆ的两端分别修饰荧光基团和相应的淬灭基团。
优选的，核酸序列A的一段修饰的基团为氨基时，固定在羟基修饰的磁珠上；如果基团为巯基，固定在胶体金上；如果基团为生物素，则固定在亲和素修饰的磁珠上。这些修饰固定有利于后续的固液分离。
优选的，C与A和B完全互补，或C的两端与A和B互补，则C中间不互补区域的碱基数不超过2个。
优选的，荧光基团包括Cy3、Cy5、FAM、HEX，相应的淬灭基团包括HBQ、Dabcyl、MGB、Eclipse。
优选的，核酸序列A、B、C、D、E、F，它们的序列以及相应的修饰基团如下所述：
A：5'-NH2-CGAATCCTGAGT-N3-3'（SEQ ID NO：1）；
B：5'-CHCH-CTACAAATACCTA-3'（SEQ ID NO：2）；
C：5'-TAGGTATTTGTAGACTCAGGATTCG-3'（SEQ ID NO：3）；
E：5'-TAGGTATTTGTAGGTTACACCCATGTTACTCT-3'（SEQ ID NO：4）；
D：5'-GATATCAGCGATTAACACTCAGGATTCG-3'（SEQ ID NO：5）；
F：5'-FAM-AGAGTATrAGGATATC-BHQ-3'（SEQ ID NO：6）。
优选的，还原剂包括抗坏血酸钠、维生素C、柠檬酸盐、硼氢化钠。
优选的，杂交缓冲液为20 mM Tris-HCl缓冲液，pH为7.5，含有100 mM NaCl以及15mM MgCl2。
一种基于点击化学的铜离子检测试剂盒，包括下列步骤：
（1）先用杂交缓冲液分别溶解核酸序列A、B、C、D、E、F；将300 nM的A，300 nM的B，500 nM的C在室温充分混匀，反应30分钟，形成A-B-C复合物；
（2）将待测溶液，以及相应的还原剂溶液充分混匀，加入到A-B-C复合物中，室温反应60分钟；
（3）95℃加热5分钟，并立即冰育10分钟，磁珠分离后去上清；
（4）加入300 nM的D和E，充分混匀，室温反应30分钟；
（5）加入500 nM的F，室温反应90分钟，反应完成后，体系在495 nm激发光的激发下，记录525 nm处的荧光发射光强度；由于荧光发射光强度与铜离子浓度呈正相关来判断待测溶液中是否含有铜离子以及其浓度；
其中，还原剂、杂交缓冲液以及核酸序列A、B、C、D、E、F如上述任一项所述。
其反应原理（见图1）如下所述：
（1）A核酸一端修饰氨基（-NH2），固定在羟基（-COOH）修饰的磁珠上，A也可以修饰巯基（-SH），固定在胶体金上，或者A修饰生物素，固定在亲和素修饰的磁珠上，这些修饰固定有利于后续的固液分离即可。A的另一端修饰叠氮基团。B核酸一端修饰炔基基团。C核酸与A和B互补，形成A-B-C复合物。其中A修饰叠氮基团的一端靠近B修饰炔基基团的一端。
（2）当有铜离子（Cu2+）存在时，在还原剂如抗坏血酸钠的作用下被还原成一价铜离子（Cu+），还原剂有多种可以使用，还可包括维生素C、柠檬酸盐、硼氢化钠等。A的叠氮基团和B的炔基基团在一价铜离子的催化下，通过环加成反应，形成一个三唑五元环而被连接在一起。
（3）95℃加热5分钟，使C和A-B分离，并立即冰育10分钟，使C与A-B保持单链。磁珠分离后去上清，保留A-B链。
（4）加入D和E，D和E中限定的核酸序列部分为催化核酸的两部分，分开无催化活性，只有靠近一起才具有催化活性。以A-B为模板，D和E靠近在一起，形成具有催化活性的催化核酸。在D序列中必须有5'-AGCGATTAAC-3'碱基，在E序列中必须有5' -GTTACACCCATGT-3'碱基，这些碱基是保证催化活性的核心。
（5）在F序列中，必须要有5'-TrAG-3'碱基，这是催化核酸的识别位点，切割位点为rA。Ｆ的两端分别修饰荧光基团和淬灭基团，只要淬灭基团能淬灭荧光基团的荧光即可。Ｆ序列在5'-TrAG-3'识别位点的两端分别有6个碱基与D和E的一端互补，过少碱基难以使F与D-E结合，过多碱基会导致背景值变高，影响检测灵敏度，优选为6个碱基数。D-E切割F，使淬灭基团和荧光基团分离，从而使荧光基团发荧光，达到检测目的。同时D-E又可以进入下一轮循环，不断切割F，最后产生大量的荧光，达到高灵敏检测目的。当体系中没有铜离子时，无法形成具有催化活性的D-E，无法切割F，此时只有背景荧光值。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
一种基于点击化学的铜离子检测方法，按照如下步骤进行：
（1）先用Tris-HCl缓冲液（20 mM，pH为7.5，含有100 mM NaCl以及15 mM MgCl2）分别溶解核酸序列A、B、C、D、E、F。300 nM的A，300 nM的B，500 nM的C在室温充分混匀，反应30分钟，形成A-B-C复合物；
（2）不同浓度的铜离子（Cu2+）溶液，以及五倍浓度的抗坏血酸钠溶液充分混匀，加入到A-B-C复合物中，室温反应60分钟；
（3）95℃加热5分钟，使C和A-B分离，并立即冰育10分钟，使C与A-B保持单链。磁珠分离后去上清，保留A-B链；
（4）加入300 nM的D和E，充分混匀，室温反应30分钟；
（5）加入500 nM的F，室温反应90分钟，反应完成后，体系在495 nm激发光的激发下，记录525 nm处的荧光发射光强度。荧光发射光强度与铜离子浓度呈正相关。
实施例2
一种基于点击化学的铜离子检测试剂盒，包括以下成分：
（1）核酸序列A、B、C、D、E、F，它们的序列以及相应的修饰基团如下：
A：5'-NH2-CGAATCCTGAGT-N3-3'（SEQ ID NO：1）；
B：5'-CHCH-CTACAAATACCTA-3'（SEQ ID NO：2）；
C：5'-TAGGTATTTGTAGACTCAGGATTCG-3'（SEQ ID NO：3）；
E：5'-TAGGTATTTGTAGGTTACACCCATGTTACTCT-3'（SEQ ID NO：4）；
D：5'-GATATCAGCGATTAACACTCAGGATTCG-3'（SEQ ID NO：5）；
F：5'-FAM-AGAGTATrAGGATATC-BHQ-3'（SEQ ID NO：6）；
（2）抗坏血酸钠溶液；
（3）羟基修饰的磁珠溶液；
（4）20 mM Tris-HCl缓冲液，pH为7.5，含有100 mM NaCl以及15 mM MgCl2。
实施例3
对不同浓度铜离子的检测：
配制铜离子标准溶液，浓度分别为10 pM、100 pM、1 nM、 10 nM、100 nM、500nM以及800nM室温保存。将不同浓度的Cu2+溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图2所示，随着Cu 2+浓度的增加，对应的荧光强度逐渐增强，当Cu2+浓度超过500 nM 时，逐渐达到饱和。以Cu2+浓度的对数（lgC）为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，二者具有很好的线性关系，线性范围是从 10 pM 到 500 nM，线性方程是：F = 302 +157 lgC (R2 =0.975)（F为荧光强度，C为铜离子浓度），按照3倍信噪比标准（3S/N），检测限为 2 pM。
实施例4
特异性实验：
配制浓度为100 nM的不同干扰物标准溶液，分别是Pb2+、Hg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Cd2+、Zn2+和Cr3+。将100 nM的不同干扰物标准溶液和100 pM Cu2+标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图3所示，100 nM 的Pb2+、Hg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Cd2+、Zn2+和Cr3+的荧光强度与空白样品相比，变化不大，对检测不产生影响。只有当加入Cu2+才会使荧光强度明显增加，这证明该方法对Cu2+的检测具有很好的特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省生态环境技术研究所
<120> 一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgaatcctga gt 12
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctacaaatac cta 13
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taggtatttg tagactcagg attcg 25
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
taggtatttg taggttacac ccatgttact ct 32
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatatcagcg attaacactc aggattcg 28
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agagtatrag gatatc 16

Claims (8)

1.一种基于点击化学的铜离子检测试剂盒，其特征在于，包括还原剂、杂交缓冲液和下列核酸序列：
核酸序列A：A的一端修饰叠氮基团，另一端修饰有基团并固定结合在修饰有对应基团的磁珠或者胶体金；
核酸序列B：B的一端修饰炔基基团；
核酸序列C：C的两端分别与A和B互补，形成A-B-C复合物；A-B-C复合物中A修饰叠氮基团的一端靠近B修饰炔基基团的一端；
核酸序列D：D的一端与A互补，另一端与F的部分互补；从5’向3’延伸过程中，D与A或F不互补的区域内包含有一段AGCGATTAAC的碱基序列；
核酸序列E：E的一端与B互补，另一端与F的部分互补；从5’向3’延伸过程中，E与B或F不互补的区域内包含有一段GTTACACCCATGT的碱基序列；
核酸序列F：从5’向3’延伸过程中，包含有催化核酸的识别位点TrAG，识别位点两端分别有6个碱基与D和E的一端互补；Ｆ的两端分别修饰荧光基团和相应的淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：核酸序列A的一段修饰的基团为氨基时，固定在羟基修饰的磁珠上；如果基团为巯基，固定在胶体金上；如果基团为生物素，则固定在亲和素修饰的磁珠上。
3.根据权利要求1所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：C与A和B完全互补，或C的两端与A和B互补，C中间不互补区域的碱基数不超过2个。
4.根据权利要求1所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：荧光基团包括Cy3、Cy5、FAM、HEX，相应的淬灭基团包括HBQ、Dabcyl、MGB、Eclipse。
5.根据权利要求1所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：核酸序列A、B、C、D、E、F，它们的序列以及相应的修饰基团如下所述：
A：5'-NH2-CGAATCCTGAGT-N3-3'；
B：5'-CH说明: 说明: D:\Documents\Tencent Files\495132409\Image\C2C\Image1\AL%0_DZMHI($P27{GNK7]AX.pngCH-CTACAAATACCTA-3'；
C：5'-TAGGTATTTGTAGACTCAGGATTCG-3'；
E：5'-TAGGTATTTGTAGGTTACACCCATGTTACTCT-3'；
D：5'-GATATCAGCGATTAACACTCAGGATTCG-3'；
F：5'-FAM-AGAGTATrAGGATATC-BHQ-3'。
6.根据权利要求1所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：还原剂包括抗坏血酸钠、维生素C、柠檬酸盐、硼氢化钠。
7.根据权利要求1所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：杂交缓冲液为20 mM Tris-HCl缓冲液，pH为7.5，含有100 mM NaCl以及15 mM MgCl2。
8.一种基于点击化学的铜离子检测试剂盒，其特征在于，包括下列步骤：
（1）先用杂交缓冲液分别溶解核酸序列A、B、C、D、E、F；将300 nM的A，300 nM的B，500 nM的C在室温充分混匀，反应30分钟，形成A-B-C复合物；
（2）将待测溶液，以及相应的还原剂溶液充分混匀，加入到A-B-C复合物中，室温反应60分钟；
（3）95℃加热5分钟，并立即冰育10分钟，磁珠分离后去上清；
（4）加入300 nM的D和E，充分混匀，室温反应30分钟；
（5）加入500 nM的F，室温反应90分钟，反应完成后，体系在495 nm激发光的激发下，记录525 nm处的荧光发射光强度；由于荧光发射光强度与铜离子浓度呈正相关来判断待测溶液中是否含有铜离子以及其浓度；
其中，还原剂、杂交缓冲液以及核酸序列A、B、C、D、E、F如权利要求1-7任一项所述。
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