CN109668863B - 基于石墨烯和点击化学的铜离子检测方法、其试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本专利提供了一种基于石墨烯和点击化学的铜离子检测方法。通过一步化学反应，石墨烯表面即可修饰上炔烃基团，由于石墨烯具有非常强的荧光猝灭效应。因此其可以和含有叠氮基团的荧光分子在铜离子存在的情况下发生点击化学反应并猝灭铜离子的荧光，实现铜离子的高灵敏检测。由于石墨烯具有很大的比表面积，因此在修饰了炔烃的同一个石墨烯上面会有很多叠氮基团的反应位点，因此该反应的速度要快于小分子之间直接反应。该反应可以用于临床上铜离子代谢疾病的初步评估，也可以用于科研工作中细胞内铜离子的成像。
Description
技术领域
本发明属于纳米传感领域领域，具体涉及一种基于石墨烯和点击化学的铜离子检测方法及应用。
背景技术
铜是生命体内必不可少的过渡金属元素，它和生命体的许多过程，比如基因表达，金属骨架蛋白的组成都息息相关。生命体内铜含量的异常预示着许多疾病的发生，比如Menkes病，肝豆核状变性等。实时的检测生理体系中的铜含量对于预示这类疾病具有重大的意义。
目前对于铜离子的检测的金标准是基于电感等离子体耦合技术的相关方法，这些方法可以精准的测量生理体系内的铜离子含量，但这些技术往往需要昂贵的仪器和专业的操作人员，非常不利于贫困地区的疾病筛查。一些有机荧光分子也可以用于对铜离子的检测，然而，为了能和铜离子有较高的亲和作用，这类分子往往需要复杂的合成工艺和提纯方法。此外，这类分子也多存在生物毒性大，水溶性差等弊端。一些基于纳米材料的比色方法也可以用来进行铜离子的检测。但是这些方法无法对细胞中的铜离子进行成像。综上所述，制备一种成本低廉，合成用户友好，对铜离子有特异性相应并且可以用于生理体系内铜离子检测的检测体系非常有必要。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一种基于石墨烯和点击化学的铜离子检测方法及应用。
在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“HEPES缓冲液”是指：4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液；
术语“PBS缓冲液”是指：磷酸盐缓冲液；
术语“乙炔-PEG4-NHS”是指：乙炔-四聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
术语“乙炔-Cn-NHS”是指:
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种基于石墨烯和点击化学的铜离子检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将炔烃修饰的石墨烯与含有叠氮基团的罗丹明在PBS缓冲液中混合，所述炔烃修饰的石墨烯浓度优选为10～100mg/mL，更优选为30～80mg/mL，最优选为50mg/mL；
(2)将待测样品与抗坏血酸加入到步骤(1)制备的混合液中；
(3)对步骤(2)得到的混合液进行荧光光谱的测量。
根据本发明第一方面的方法，其中，所述炔烃修饰的石墨烯通过以下方法制备：
(a)将氨基修饰的石墨烯溶解在甲醇溶液中，所述甲醇溶液体积分数优选为1～20％，更优选为5～15％，最优选为10％；
(b)将步骤(a)所得的石墨烯溶液加入到HEPES缓冲液中，并加入炔烃-NHS，搅拌，制得炔烃修饰的石墨烯。
优选地，步骤(a)中，所述溶解过程为将混合溶液超声1～8小时，优选为1～5小时，最优选为3小时
步骤(b)中，所述HEPES缓冲液pH为7.4，浓度为0.01～1M，优选为0.05～0.2M，最优选为0.1M。
更优选地，步骤(b)中，优选地，所述炔烃-NHS选自乙炔-PEGn-NHS和/或乙炔-Cn-NHS；更优选地，所述乙炔-PEGn-NHS和/或乙炔-Cn-NHS中，n＝2～10；最优选地，所述炔烃-NHS为乙炔-PEG4-NHS。
进一步优选地，所述方法还包括步骤(c)：将步骤(b)所得炔烃修饰的石墨烯离心提纯，并重新分散于PBS缓冲液中。
本发明的第二方面提供了一种基于石墨烯和点击化学的铜离子检测试剂盒，所述试剂盒包括：
炔烃修饰的石墨烯，所述炔烃修饰的石墨烯浓度优选为10～100mg/mL，更优选为30～80mg/mL，最优选为50mg/mL；
含有叠氮基团的罗丹明；
PBS缓冲液；和
抗坏血酸。
优选地，所述试剂盒中，以以下试剂替代所述炔烃修饰的石墨烯：
氨基修饰的石墨烯；
甲醇溶液；和
HEPES缓冲液；
炔烃-PEG4-NHS。
更优选地，所述甲醇溶液体积分数为1～20％，优选为5～15％，最优选为10％；和/或
所述HEPES缓冲液pH为7.4，浓度为0.01～1M、优选为0.05～0.5M、最优选为0.1M。
本发明的第三方面提供了本发明第二方面所述试剂盒在制备用于评估、检测和/或诊断铜离子代谢疾病的产品中的应用；优选地，所述铜离子代谢疾病为肝豆核状变性。
本发明的第四方面提供了本发明第二方面所述试剂盒在制备用于细胞内铜离子的成像的检测产品中的应用。
现有的铜离子检测体系多存在制备复杂，成本高昂，生物毒性大的特点。本发明旨在提供以一种简单方便，成本低廉的铜离子检测方法，并用于贫困的地区的铜离子代谢相关疾病的筛查和细胞内铜离子的检测。
本发明涉及一种基于石墨烯和点击化学的荧光探针的铜离子检测方法。利用功能化修饰的石墨烯和荧光分子，使得石墨烯可以在铜离子存在的情况下特异，快速的猝灭荧光分子本身的荧光，从而实现生理体系内铜离子的快速检测，进而用于疾病的辅助诊断和科学研究。
具体内容如下：
如果在一个体系中，组份A是具有荧光的，而组分B是可以猝灭荧光的。那么如果让组分A和组分B可以在铜离子存在的时候特异性的结合。那组分B就可以在铜离子存在的情况下选择性的猝灭组分A的荧光，从而产生荧光信号的变化用于铜离子的检测。基于炔烃和叠氮基团之间的点击化学反应是一种快速，特异的生物正交反应。这类反应只会在一价铜离子的存在的条件下进行。因此如果我们将A修饰上叠氮，在B上修饰上炔集团。那么在铜离子存在的情况下，在体系中加入一定的还原剂，铜离子就会被催化为一价铜进而促进A，B组分之间发生点击反应并结合。这种反应的一大优势是铜催化的点击化学反应是高度特异的生物正交反应，因此在生物体系内不容易收到一些其他基团的干扰。
金纳米颗粒是一种合成方便，便于修饰的纳米材料。金纳米颗粒在一定尺寸下可以猝灭荧光分子的荧光。于是我们将炔烃基团修饰在金纳米颗粒的表面。然后将其与含有叠氮集团的罗丹明溶液混合。这样，该体系中的金纳米颗粒就会在铜离子和还原剂同时存在的情况下和罗丹明发生反应，从而将罗丹明吸附在金纳米颗粒表面，进一步猝灭金纳米颗粒的荧光。然而，我们发现在生理体系内检测时，经常会出现金纳米颗粒无法猝灭荧光的情况，后来我们发现，金纳米颗粒在胜利体系内的稳定非常困难。即使加入了PEG作为稳定剂，仍然会有金纳米颗粒发生不可逆的聚集。
我们不得不尝试一些其他的纳米材料，氧化石墨烯是一种成本低廉，易于合成和修饰的纳米材料，有趣的是，石墨烯也可以高效猝灭大多数荧光分子的荧光。并且重要的是，即使石墨烯发生一定程度的聚集之后依然可以很有效的猝灭吸附在其表面的荧光。因此，我们选择对PEG化的氧化石墨烯进行修饰，使其表面含有炔基。再将含有叠氮基团的荧光分子与其混合。该体系在加入还原剂的情况下能够很好的对铜离子进行检测，并且可以用于生理体系(比如尿液)中的铜离子检测和细胞内铜离子的成像。
本发明的基于石墨烯和点击化学的铜离子检测探针可以具有但不限于以下有益效果：
1、通过一步化学反应，石墨烯非常容易的修饰上炔基团，由于石墨烯具有非常强的荧光猝灭效应。因此其可以和含有叠氮基团的荧光分子实现铜离子的高灵敏检测。
2、由于石墨烯具有很大的比表面积，因此在修饰了炔烃的同一个石墨烯上面会有很多叠氮基团的反应位点，再由于点击化学反应的引入，该反应的速度要远远快于现有的检测手段。
3、该反应可以用于临床上铜离子代谢疾病的初步评估，也可以用于科研工作中细胞内铜离子的成像。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明的原理示意图。图2示出了实施例2中GO-C2和Rho-N3混合溶液在不同浓度铜离子存在的情况下的荧光光谱。
图3示出了试验例1中GO-C2和Rho-N3在不同离子存在的情况下的荧光强度(525nm)。
图4示出了试验例3中GO-C2和Rho-N3的细胞内铜离子成像结果。
图5示出了试验例4中GO-C2和Rho-N3的用于尿液中的铜离子检测结果。
图6示出了试验例2中与不同浓度Rho-N3和GO-C2共同孵育后的细胞存活率。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
氨基修饰的石墨烯，购自Nanjing FAME Bearing Co.,Ltd.；
acetylene-PEG4-NHS，购自Click Chemistry Tools Bioconjugate TechnologyCompany,US；
甲醇、HEPES缓冲液，PBS缓冲液，Rho-N3，氯化铜，抗坏血酸钠，购买自sigmaaldrich,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购买自美国American type culture collection，Fe(III)，Al(III)，Cr(II)，Pb(II)，Hg(II)，Cu(II)，Ca(II)，Zn(II)，Sn(II)，Fe(II)，Mg(II)，Ag(I)，Na(I)，K(I)的氯化盐购自Sigma Aldrich。
仪器：
荧光光谱仪，购自日本岛津公司、型号RF5301PC；
电感耦合等离子体光谱仪，购自美国PerkinElmer公司、型号Optima5300V；
莱卡显微镜，购自德国leica公司，型号6100a；
离心机购自美国Thermal公司型号Sorvall LYNX
实施例1
本实施例用于说明石墨烯表面修饰炔烃基团的方法。
我们将氨基修饰的石墨烯(购自Nanjing FAME Bearing Co.,Ltd.)溶解在体积分数为10％的甲醇溶液中。通过在超声下3小时，石墨烯可以完全溶解，接下来将上述所得的1mL的石墨烯溶液(10mg/ml)加入到9毫升HEPES缓冲液(0.1M，pH＝7.4)中，并加入10μg的乙炔-PEG4-NHS(acetylene-PEG4-NHS，购自Click Chemistry Tools BioconjugateTechnology Company,US)。将上述溶液在常温下搅拌2h时后即可得到炔烃修饰的石墨烯(GO-C2)。石墨烯可以通过离心提纯(10000g,10min)，并重新分散在PBS缓冲液(pH＝7.4)中。
实施例2
本实施例用于说明炔烃修饰的石墨烯和含有叠氮基团的罗丹明(Rho-N3)用于PBS缓冲液中的铜离子检测。
将实施例1制备的GO-C2(500μL)与含有叠氮基团的罗丹明Rho-N3(500μL)在PBS缓冲液中混合,使GO-C2和Rho-N3的终浓度分别为50μg/mL和0.5μg/mL，然后将10μL不同浓度的氯化铜溶液加入到1mL GO-C2和Rho-N3的混合液中，接下来，我们加入过量的抗坏血酸钠(AANa，10μL)至终浓度为1mM。然后将整个体系在黑暗中轻轻搅拌混合物5分钟后，进行荧光光谱的测量。
为了评估该系统对Cu(II)检测的检测限，将不同浓度的CuCl2溶液(10μL)加入到上述GO-C2&Rho-N3的混合液中(1mL)，使Cu(II)的最终浓度范围为2.5nM至50μM，还加入10μL的AA至终浓度为1mM来保证Cu(II)全部还原为Cu(I)。结果如图2所示，该体系可以检测低达50nM的铜离子。
试验例1
本试验例用于说明GO-C2&Rho-N3对于其他金属离子的抗干扰能力。
如实施例2的方法向GO-C2和Rho-N3(1mL)的混合物中加入10μL不同金属离子和AA(0.1M)混合溶液，金属离子包括Fe(III)，Al(III)，Cr(II)，Pb(II)，Hg(II)，Cu(II)，Ca(II)，Zn(II)，Sn(II)，Fe(II)，Mg(II)和Ag(I)Na(I)和K(I)，其中除了Cu(II)的浓度为50μM，所有金属离子的终浓度均为1mM。结果如图3所示，GO-C2和Rho-N3混合液只有在铜离子和还原剂同时存在的时候才会发生荧光信号的变化。证明了其他离子不会对该检测体系造成干扰。
试验例2
本试验例用于说明GO-C2和Rho-N3的细胞毒性。
通过使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为模型来评估Rho-N3和GO-C2的细胞毒性。将不同浓度的Rho-N3和GO-C2(GO-C2的终浓度为0-50mg/L,且GO-C2与Rho-N3的质量浓度比为100：1)与HUVEC共同培养24小时后，用标准的CCK-8方案检测细胞活力。在96孔板(5000/孔)中培育100微升HUVEC，并培养24小时以使其附着，然后向培养基中加入分散在培养基中的不同浓度的GO-C2和Rho-N3细胞孵育24h，然后用含有20μLCCK-8溶液的200μL新鲜培养基代替培养基，再培养3h。接下来使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
将来自未处理平板上的细胞的吸光度定义为阴性对照(An)，并且仅含有相同体积的没有HUVEC(Ab)的CCK-8的溶液的吸光度作为空白对照。用下面的公式计算细胞活力：
细胞活力(100％)＝(A-Ab)/(An-Ab)*100％(1)
在细胞内成像的浓度下，与没有Rho-N3和GO-C2的那些细胞相比，HUVEC的存活率没有显示差异。如图6所示。
试验例3
本试验例用于说明GO-C2和Rho-N3的细胞内铜离子成像。
为了测试Rho-N3和GO-C2是否可以用于细胞内铜离子的成像，我们首先将HUVEC与Rho-N3或Rho-N3和GO-C2孵育30分钟，并观察细胞中的荧光变化来证明Rho-N3和GO-C2进入了细胞之内(图4左)。接下来，向细胞培养中加入一定浓度的铜离子和还原剂。含有Rho-N3&GO-C2的HUVECs在加入Cu后荧光强度明显降低(图4右)。
试验例4
本试验例用于说明GO-C2和Rho-N3的用于尿液中的铜离子检测。
将健康人/患者(肝豆核状变性)的尿液样品980μL(来自北京朝阳医院)以及AA 10μL(混合后的终浓度1mM)和浓缩过的Rho-N3和GO-C2的混合物10μL混合(GO-C2和Rho-N3的终浓度分别为50μg/mL和0.5μg/mL)。加入后，观察到加入病人尿液的Rho-N3&GO-C2的混合液的荧光强度明显下降，如图5所示。说明了病人对于Cu内容远远高于健康人。当与电感等离子体耦合光电子能谱(金属离子定量金标准)得到的结果(见表1)相比较时，测定结果显示出良好的一致性。
表1电感等离子体耦合光电子能谱结果
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (20)
1.一种基于石墨烯和点击化学的铜离子检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将炔烃修饰的石墨烯与含有叠氮基团的罗丹明在PBS缓冲液中混合，所述炔烃修饰的石墨烯浓度为10～100mg/mL；
(2)将待测样品与抗坏血酸加入到步骤(1)制备的混合液中；
(3)对步骤(2)得到的混合液进行荧光光谱的测量；
所述炔烃修饰的石墨烯通过以下方法制备：
(a)将氨基修饰的石墨烯溶解在甲醇溶液中，所述甲醇溶液体积分数为1～20％；
(b)将步骤(a)所得的石墨烯溶液加入到HEPES缓冲液中，并加入炔烃-NHS，搅拌，制得炔烃修饰的石墨烯；其中，
步骤(b)中，所述炔烃-NHS为乙炔-PEGn–NHS，其中，n＝2～10。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述炔烃修饰的石墨烯浓度为30～80mg/mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述炔烃修饰的石墨烯浓度为50mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇溶液体积分数为5～15％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述甲醇溶液体积分数为10％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(a)中，所述溶解过程为将混合溶液超声1～8小时；和/或
步骤(b)中，所述HEPES缓冲液pH为7.4，浓度为0.01～1M。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
步骤(a)中，所述溶解过程为将混合溶液超声1～5小时；和/或
步骤(b)中，所述HEPES缓冲液浓度为0.05～0.2M。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
步骤(a)中，所述溶解过程为将混合溶液超声3小时；和/或
步骤(b)中，所述HEPES缓冲液浓度为0.1M。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述炔烃-NHS为乙炔-PEG4-NHS。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(c)：将步骤(b)所得炔烃修饰的石墨烯离心提纯，并重新分散于PBS缓冲液中。
11.一种基于石墨烯和点击化学的铜离子检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
炔烃修饰的石墨烯，所述炔烃修饰的石墨烯浓度为10～100mg/mL；
含有叠氮基团的罗丹明；
PBS缓冲液；和
抗坏血酸；
所述炔烃修饰的石墨烯通过以下方法制备：
(a)将氨基修饰的石墨烯溶解在甲醇溶液中，所述甲醇溶液体积分数为1～20％；
(b)将步骤(a)所得的石墨烯溶液加入到HEPES缓冲液中，并加入炔烃-NHS，搅拌，制得炔烃修饰的石墨烯；其中，
步骤(b)中，所述炔烃-NHS为乙炔-PEGn–NHS，其中，n＝2～10。
12.根据权利要求11所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于，所述炔烃修饰的石墨烯浓度为30～80mg/mL。
13.根据权利要求12所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于，所述炔烃修饰的石墨烯浓度为50mg/mL。
14.根据权利要求11所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，以下试剂替代所述炔烃修饰的石墨烯：
氨基修饰的石墨烯；
甲醇溶液；和
HEPES缓冲液；
炔烃-PEG4-NHS。
15.根据权利要求14所述的检测试剂盒，其特征在于：
所述甲醇溶液体积分数为1～20％；和/或
所述HEPES缓冲液pH为7.4，浓度为0.01～1M。
16.根据权利要求15所述的检测试剂盒，其特征在于：
所述甲醇溶液体积分数为5～15％；和/或
所述HEPES缓冲液的浓度为0.05～0.5M。
17.根据权利要求16所述的检测试剂盒，其特征在于：
所述甲醇溶液体积分数为10％；和/或
所述HEPES缓冲液的浓度为0.1M。
18.根据权利要求11至17中任一项所述试剂盒在制备用于评估、检测和/或诊断铜离子代谢疾病的产品中的应用。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述铜离子代谢疾病为肝豆核状变性。
20.根据权利要求11至17中任一项所述试剂盒在制备用于细胞内铜离子的成像的检测产品中的应用。
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