CN104007092A

CN104007092A - 一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法

Info

Publication number: CN104007092A
Application number: CN201410211308.0A
Authority: CN
Inventors: 于聪; 王方远; 李永新; 张青峰; 陈健; 周会鹏
Original assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Current assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2014-05-19
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2034-05-19
Also published as: CN104007092B

Abstract

本发明提供一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，属于化学分析检测领域。该方法先将修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的核酸分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中配制成核酸溶液；然后形成混合溶液，向混合溶液中加入抗坏血酸、水和Tris-HCl缓冲溶液，形成检测体系；再向检测体系中加入待测样品，对检测体系的强度进行荧光检测；以已知铜离子浓度为横坐标，相对的荧光强度值为纵坐标，计算得出对应的待测样品中铜离子的浓度。本发明利用基于点击化学的核酸连接反应，简单快速、稳定性好、灵敏度高，在0～40nM范围内有很好的线性响应，检测限低至0.023nM。

Description

一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法

技术领域

本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法。

背景技术

铜是维持人类身体健康和其他生物体正常机能不可或缺的微量元素之一。铜通过充当酶和其它蛋白质的辅因子和/或结构组成部分而在生理过程中起着非常重要的作用，与血液、生殖系统、骨骼的发育密切相关。人体内铜的缺乏，会造成人体的发育迟缓和各种铜缺乏症相关的疾病，比如乳糜泄、贫血症、心血管损伤、脊柱的髓鞘化等等。因此世界卫生组织(WHO)和联合国粮食及农业组织(FAO)建议人体每天对铜的摄入量不能低于0.5mg/kg。然而铜是重金属元素，能抑制很多酶的活性(如碱性磷酸酶、胃蛋白酶和脂肪酶等)，铜的过量摄取会在生物体内积累并对生物体造成严重的损害，如铜会造成肝脏肾脏和其他器官损伤、肠胃功能紊乱、甚至引发各种神经系统疾病(如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症)以及癌症等等。因此美国环境保护署(EPA)规定饮用水中铜的含量不能超过1.33ppm(约为20μM)。随着工业的发展，铜被广泛的应用到工业的各个方面，特别是在冶金和电镀化工行业中，铜被过度的大量开发使用并被排放到环境中，造成了水体、土壤、空气中铜含量超标，严重威胁人类及其他生物体的健康和生存。因此检测和监测水中的铜离子浓度有着重要的意义，开发新型的灵敏检测铜离子的方法是势在必行。

目前常用的铜离子检测方法有：原子吸收及原子发射光谱法，属于常规元素分析方法，但是对痕量元素的测定灵敏度低，操作复杂；塞曼效应石墨炉原子吸收光谱法，是一种准确可靠的方法，同样操作复杂，而且费用昂贵，难以大规模应用；此外还有利用络合试剂和铜离子形成有色络合物进行比色或吸收分光光度测定的方法，但是灵敏度低，重现性差，现在很少采用；电感耦合等离子体发射光谱法和电感耦合等离子体质谱法等虽然有一定的灵敏度，但是仪器比较贵重，检测耗费较大，难以在铜离子的检测中普及应用。而荧光检测方法由于具有较高的灵敏度、很好的选择性、制备方法简单价格低廉以及样品量少等优点，一直是学者们研究的热点，并已被广泛应用于铜离子的检测。

2001年，诺贝尔化学奖获得者Sharpless[K.B.Sharpless,Angew.Chem.Int.Ed.40(2001)2004-2021]报道了一种亚铜催化的叠氮(azide)和炔烃(alkyne)的环加成反应(Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)，随后被定义为“点击化学”反应。由于该反应具有模块化、反应条件温和、副反应少、分离提纯简单、反应速率高、操作简单并且具有立体选择性和较高的转化率等优点,使得该反应在生物、化学、以及材料科学领域都得到了广泛的应用。痕量的亚铜离子即能催化叠氮和炔烃发生环加成反应(CuAAC)，而且反应的效率与亚铜离子的浓度呈正相关系，但是基于点击化学反应检测铜离子的方法很少报道。曾令文(公开号103558215A，公开日2014.02.05)等报道了一种基于点击化学反应的铜离子检测方法，但是需要加入高铁血红素(Hemin)及四甲基联苯胺(TMB)等复杂物质，操作繁琐，点击化学反应没有连接模板参与，效率较低，灵敏度也低。林振宇等报道了一种基于点击化学的便携式检测铜离子的方法(公开号103163130A，公开日2013.06.19)，该方法需要将磁纳米离子上修饰核酸，检测步骤非常繁琐，而且反应效率与有连接模板参与的相比反应效率较低。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的基于点击化学荧光检测铜离子的方法需要加入重金属或有毒染料等物质，且检测步骤繁琐灵敏度低的问题，而提供一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法。

本发明提供一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，该方法包括：

步骤一：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的核酸分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中配制成核酸溶液；

步骤二：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的核酸溶液混合，形成混合溶液，然后向混合溶液中加入抗坏血酸、水和Tris-HCl缓冲溶液，形成检测体系；

步骤三：向检测体系中加入待测样品，对检测体系的强度进行荧光检测；

步骤四：以已知铜离子浓度为横坐标，相对的荧光强度值为纵坐标，绘制曲线，得到铜离子浓度和荧光强度的线性关系方程，然后根据待测样品的读数，计算得出对应的待测样品中铜离子的浓度。

优选的是，所述的步骤二中作为连接模板的核酸选用具有发卡结构的分子信标。

优选的是，所述的步骤二中作为连接模板的核酸具有如SEQ ID No:9～SEQID No:12所示的核苷酸序列结构。

优选的是，所述的步骤二的混合溶液中，修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的核酸的浓度比例为(1～7)：(1～7)：1。

优选的是，所述的步骤二的检测体系中，修饰了叠氮基团的短的单链核酸和修饰了炔基基团的短的单链核酸的终浓度都为10nM～350nM。

优选的是，所述的步骤二的检测体系中，作为连接模板的核酸的终浓度为5nM～50nM。

优选的是，所述的步骤二的检测体系中，抗坏血酸的浓度为100～2000μM。

优选的是，所述的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM～40mM，pH7.0～8.0。

优选的是，所述的待测样品为湖水、河水或自来水。

优选的是，所述的步骤三的荧光检测时间为20分钟～4小时。

本发明的工作原理

本发明提供一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，该方法利用修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的核酸杂交形成双链结构，叠氮基团和炔基基团相互靠近，当有铜离子存在时，铜离子将会被还原剂还原成亚铜离子，从而催化炔基和叠氮基团之间发生CuAAC反应，将两条短的单链核酸连接成一条长链核酸，由于长链核酸和作为连接模板的核酸有更强的亲和力和更高的溶解温度，所以将作为连接模板的核酸打开产生很强的荧光信号。反之，如果没有没有铜离子存在，没有连接的短的单链核酸将不能打开作为连接模板的核酸，通过这一方法来检测待测样品中的铜离子。

本发明的有益效果

本发明提供一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，该方法先将修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的核酸分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中配制成核酸溶液；然后将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的核酸溶液混合，形成混合溶液，向混合溶液中加入抗坏血酸、水和Tris-HCl缓冲溶液，形成检测体系；再向检测体系中加入待测样品，对检测体系的强度进行荧光检测；以已知铜离子浓度为横坐标，相对的荧光强度值为纵坐标，绘制曲线，得到铜离子浓度和荧光强度的线性关系方程，然后根据待测样品的读数，计算得出对应的待测样品中铜离子的浓度。和现有技术相对比，本发明利用基于点击化学的核酸连接反应，简单快速、反应条件温和、选择性好、抗干扰能力强；本发明所用材料试剂很容易获得，成本低，性质稳定，不需要复杂繁琐的制备过程和预处理过程，只需要简单的溶液混合和溶液的温育过程，操作简便、采用的是标记了广泛应用的荧光基团和猝灭基团的分子信标，生物适应性强，基本无毒害，检测过程简单；同时，本发明采用的是荧光增强模式，能大大降低出现假阳性信号的可能性；本发明的检测方法稳定性好、灵敏度高，在0～40nM范围内有很好的线性响应，检测限低至0.023nM。

附图说明

图1为本发明实施例1中的检测体系中加入50nM铜离子后，检测体系随时间变化的荧光光谱图；

图2为本发明实施例1中的检测体系中加入50nM铜离子和不加入铜离子情况下检测体系荧光强度的动力学曲线图；

图3为本发明实施例2加入不同浓度的铜离子的响应曲线；

图4为本发明实施例3对铜离子检测特异性曲线；

图5为本发明实施例4加入不同浓度的铜离子的响应曲线。

具体实施方式

步骤三：向检测体系中加入待测样品，对加入待测样品的检测体系溶液的强度进行荧光检测；

按照本发明，步骤一所述的先将修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的核酸分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中配制成修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的核酸溶液，所述的修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的核酸溶液浓度相同，优选为6μM。

所述的修饰了叠氮基团的短的单链核酸和修饰了炔基基团的短的单链核酸没有特殊限制，只要是具有修饰了叠氮基团和炔基基团的短的单链核酸的序列结构都能实现本发明，所述的修饰了叠氮基团的短的单链核酸优选如SEQ IDNo:1(5’-CTAAAT TCC AA-叠氮-3’)、SEQ ID No:2(5’-叠氮-TGG CAA CAGC-3’)、SEQ ID No:3(5'-GAC GGG AAC T-叠氮-3')、SEQ ID No:4(5'-叠氮-T ACAAGA CAC GG-3')所示的核苷酸序列；所述的修饰了炔基基团的短的单链核酸优选如SEQ ID No:5(5’-炔基-GAA ACT GAT AG-3’)、SEQ ID No:6(5’-GGG AGCTAG AG–炔基-3’)、SEQ ID No:7(5'-炔基-ACA AGA CAC G-3')、SEQ ID No:8(5'-CTG ACG GGA AG-炔基-3')所示的核苷酸序列。

按照本发明，所述的作为连接模板的核酸应是具有发卡结构的核酸，优选为具有发卡结构的分子信标，更优选的如SEQ ID No:9(5’-FAM-TCG CTA TCAGTT TCT TGG AAT TTA GCG A-Dabcyl-3’)、SEQ ID No:10(5’-Dabcyl-CCA CGCTGT TGC CAC TCT AGC TCC CGT GG-TAMRA-3’)、SEQ ID No:11(5'-FAM-CGA TGC CGT GTC TTG TAG TTC CCG TCG CAT CG-Dabcyl-3')、SEQ ID No:12(5'-TAMRA-CCT CTC CGT GTC TTG TAC TTC CCG TCA GAGAGG-Dabcyl-3’)所示的核苷酸序列。

按照本发明，步骤二所述的优选按照浓度比为(1～7)：(1～7)：1混合步骤一配制好的修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的核酸溶液，然后再加入抗坏血酸、水和Tris-HCl缓冲溶液，形成检测体系；

所述的检测体系中，修饰了叠氮基团的短的单链核酸和修饰了炔基基团的短的单链核酸的终浓度优选为10nM～350nM；作为连接模板的核酸的终浓度为5nM～50nM，抗坏血酸的浓度为100～2000μM，浓度过高影响反应体系的离子强度及pH值，浓度太低会影响反应速度。所述的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM～40mM，pH7.0～8.0。

按照本发明，所述的待测样品没有特殊限制，优选为湖水、河水或自来水等饮用水。所述的荧光检测温度优选为室温条件下进行，检测时间根据铜离子浓度的不同而不同，优选为20分钟～4小时。

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，实施例中涉及到的修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模版的核酸来自生工生物工程(上海)股份有限公司，人工核酸序列。

实施例1

步骤一、将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:1(5’-CTA AATTCC AA-叠氮-3’)所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:5(5’-炔基-GAA ACT GAT AG-3’)所示，和作为连接模板的核酸，如SEQ ID No:9(5’-FAM-TCG CTA TCA GTT TCT TGG AAT TTA GCG A-Dabcyl-3’)所示，分别溶解在20mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲溶液中配制成浓度都为6μM的核酸溶液；

步骤二、按3：3：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的核酸溶液混合，形成混合溶液，然后向混合溶液中加入500μM抗坏血酸、水和20mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲溶液，形成检测体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为30nM，作为连接模板的核酸溶液的终浓度为10nM；

步骤三、向检测体系中加入50nM铜离子，用荧光光谱仪检测室温条件下检测体系的荧光动力学过程，激发波长480nM，发射波长514nM。

图1为本发明实施例1中的检测体系中加入50nM铜离子后，检测体系随时间变化的荧光光谱图，图1说明在加入铜离子之后体系的荧光强度随时间逐渐增强。

图2为本发明实施例1中的检测体系中加入50nM铜离子和不加入铜离子情况下检测体系荧光强度的动力学曲线图，图2说明在不加铜离子时，荧光强度没有明显变化，而加入50nM铜离子之后荧光强度随时间逐渐增强，图1和图2能很好的说明用本发明的检测方法可以用来监测铜离子催化的核酸连接反应。

实施例2

步骤三：向步骤二得到的检测体系中加入湖水和不同浓度的铜离子(0nM、2nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM)，在25℃温育2小时，对加入检测体系溶液的强度进行荧光检测，激发波长480nm，发射波长514nm；

步骤四：以已知铜离子浓度为横坐标，相对的荧光强度值为纵坐标，绘制曲线，得到铜离子浓度和荧光强度的关系图，其中在0～40nM范围内符合线性关系方程I＝2.73C+9.77(I代表检测体系的荧光强度，C代表以nM为单位的检测体系中铜离子浓度)。然后将不加湖水和铜离子时检测体系的荧光强度带入线性方程即可计算得到湖水中铜离子的浓度。

实验结果表明，在本实施例中本方法对湖水中铜离子的检测限约为0.063nM。

图3为本发明实施例2加入不同浓度的铜离子的响应曲线。图3说明，从0～50nM，检测体系的荧光强度随浓度升高而增强，并且体系的荧光强度在50nM时到达一个平台，说明随着铜离子的增加，连接反应的效率/速率增强；另外，检测体系在0～40nM范围内与荧光强度有良好的线性关系和较小的数据偏差，说明本方法在检测铜离子方面具有很好的重现性。

实施例3

步骤三：向步骤二得到的检测体系中加入不同金属离子(其中铜离子的浓度为50nM，干扰离子浓度为50μM，干扰离子分别为Ba²⁺,Mg²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Fe²⁺,Cd²⁺,Ca²⁺,Zn²⁺,Mn²⁺,Hg²⁺,Pb²⁺,Li⁺,Na⁺,K⁺)，在25℃温育2小时，对加入检测体系溶液的强度进行荧光检测，激发波长480nm，发射波长514nm；

图4为本发明实施例3对铜离子检测特异性曲线。其中I是检测体系温育后的荧光强度，I₀是温育之前的荧光强度，(I-I₀)/I₀是代表检测体系温育之后荧光强度增加的倍数；图4说明，在温育之后，含有50nM铜离子的检测体系荧光增强了12倍左右，而分别含有浓度千倍于铜离子(50μM)的干扰离子的检测体系的荧光强度没有明显变化，这说明检测体系中干扰离子的存在不影响铜离子的检测。

实施例4

步骤一、将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:2(5’-叠氮-TGGCAA CAG C-3’)所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:6(5’-GGGAGC TAG AG–炔基-3’)所示，和作为连接模板的核酸，如SEQ ID No:10(5’-Dabcyl-CCA CGC TGT TGC CAC TCT AGC TCC CGT GG-FAM-3’)所示，分别溶解在10mM Tris-HCl(pH7.0，60mM NaCl)缓冲溶液中配制成浓度都为6μM的核酸溶液；

步骤二、按7：7：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的核酸溶液混合，形成混合溶液，然后向混合溶液中加入2000μM抗坏血酸、水和10mM Tris-HCl(pH7.0，60mM NaCl)缓冲溶液，形成检测体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为350nM，作为连接模板的核酸溶液的终浓度为50nM；

步骤三：向步骤二得到的检测体系中加入河水和不同浓度的铜离子(0nM、2nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM)，在30℃温育20分钟，对加入检测体系溶液的强度进行荧光检测，激发波长521nm，发射波长578nm；

步骤四：以已知铜离子浓度为横坐标，相对的荧光强度值为纵坐标，绘制曲线，得到铜离子浓度和荧光强度的关系图，其中在0～80nM范围内符合线性关系方程I＝1.88C+8.41(I代表检测体系的荧光强度，C代表以nM为单位的检测体系中铜离子浓度)。然后将不加河水和铜离子时检测体系的荧光强度带入线性方程即可计算得到河水中铜离子的浓度。

实验结果表明，在本实施例中本方法对河水中铜离子的检测限约为0.44nM。

图5为本发明实施例4加入不同浓度的铜离子的响应曲线。图5说明，从0～80nM，检测体系的荧光强度随浓度升高而增强，说明随着铜离子的增加，连接反应的效率/速率增强；另外，检测体系在0～80nM范围内与荧光强度有良好的线性关系和较小的数据偏差，说明本方法在检测铜离子方面具有很好的重现性。

实施例5

步骤一、将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:3(5'-GAC GGGAAC T-叠氮-3')所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:7(5'-炔基-ACA AGA CAC G-3')所示，和作为连接模板的核酸，如SEQ ID No:11(5'-FAM-CGA TGC CGT GTC TTG TAG TTC CCG TCG CAT CG-Dabcyl-3')所示，分别溶解在40mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液中配制成浓度都为6μM的核酸溶液；

步骤二、按5：5：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的核酸溶液混合，形成混合溶液，然后向混合溶液中加入100μM抗坏血酸、水和20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液，形成检测体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为25nM，作为连接模板的核酸溶液的终浓度为5nM；

步骤三：向步骤二得到的检测体系中加入自来水和不同浓度的铜离子(0nM、2nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM)，在15℃温育4小时，对加入检测体系溶液的强度进行荧光检测，激发波长480nm，发射波长514nm；

步骤四：以已知铜离子浓度为横坐标，相对的荧光强度值为纵坐标，绘制曲线，得到铜离子浓度和荧光强度的关系图，其中在0～80nM范围内符合线性关系方程I＝2.05C+9.41(I代表检测体系的荧光强度，C代表以nM为单位的检测体系中铜离子浓度)。然后将不加自来水和铜离子时检测体系的荧光强度带入线性方程即可计算得到自来水中铜离子的浓度。

实验结果表明，在本实施例中本方法对河水中铜离子的检测限约为0.21nM。

实施例6

步骤一、将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:4(5'-叠氮-TACAAGA CAC GG-3')所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:8(5'-CTG ACG GGA AG-炔基-3')所示，和作为连接模板的核酸，如SEQ ID No:12(5'-TAMRA-CCT CTC CGT GTC TTG TAC TTC CCG TCA GAGAGG-Dabcyl-3’)所示，分别溶解在10mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲溶液中配制成浓度都为6μM的核酸溶液；

步骤二、按1：1：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的核酸溶液混合，形成混合溶液，然后向混合溶液中加入700μM抗坏血酸、水和10mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲溶液，形成检测体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为10nM，作为连接模板的核酸溶液的终浓度为10nM；

步骤三：向步骤二得到的检测体系中加入不同浓度的铜离子(0nM、2nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM)，在25℃温育2小时，对加入检测体系溶液的强度进行荧光检测，激发波长521nm，发射波长578nm；

步骤四：以已知铜离子浓度为横坐标，相对的荧光强度值为纵坐标，绘制曲线，得到铜离子浓度和荧光强度的关系图，其中在0～80nM范围内符合线性关系方程I＝2.35C+8.69(I代表检测体系的荧光强度，C代表以nM为单位的检测体系中铜离子浓度)。

实验结果表明，在本实施例中本方法对纯水中铜离子的检测限约为0.023nM。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，其特征在于，该方法包括：

2.根据权利要求1所述的一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，其特征在于，所述的步骤二中作为连接模板的核酸选用具有发卡结构的分子信标。

3.根据权利要求1所述的一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，其特征在于，所述的步骤二中作为连接模板的核酸具有如SEQ ID No:9～SEQ IDNo:12所示的核苷酸序列结构。

4.根据权利要求1所述的一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，其特征在于，所述的步骤二的混合溶液中，修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的核酸的浓度比为(1～7)：(1～7)：1。

5.根据权利要求1所述的一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，其特征在于，所述的步骤二的检测体系中，修饰了叠氮基团的短的单链核酸和修饰了炔基基团的短的单链核酸的终浓度都为10nM～350nM。

6.根据权利要求1所述的一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，其特征在于，所述的步骤二的检测体系中，作为连接模板的核酸的终浓度为5nM～50nM。

7.根据权利要求1所述的一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，其特征在于，所述的步骤二的检测体系中，抗坏血酸的浓度为100～2000μM。

8.根据权利要求1所述的一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，其特征在于，所述的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM～40mM，pH7.0～8.0。

9.根据权利要求1所述的一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，其特征在于，所述的待测样品为湖水、河水或自来水。

10.根据权利要求1所述的一种基于点击化学的铜离子荧光检测方法，其特征在于，所述的步骤三的荧光检测时间为20分钟～4小时。