CN113588627A - 一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法及应用，该方法包括：将炔基分子修饰的牛血清蛋白、牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒、抗坏血酸钠、待测样本混合，进行点击化学反应，将反应后的上清液进行激光诱导击穿光谱检测，采集所述上清液中银纳米颗粒的LIBS信号强度，根据所述银纳米颗粒的LIBS信号强度获取二价铜离子浓度。本发明将激光诱导击穿光谱技术和点击化学相结合，通过检测银纳米颗粒的LIBS信号，间接实现了铜离子(Ⅱ)的高灵敏度的检测，且其它重金属离子对铜离子(Ⅱ)检测不存在干扰。

Description

一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法和应用
技术领域
本发明涉及重金属离子检测领域，尤其涉及一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法和应用。
背景技术
在无污染的情况下，水中重金属离子（比如：Hg2+、Cd2+、Cr3+、Cu2+等）的含量取决于 水与土壤、岩石的相互作用，其浓度值低，不会对人体健康造成危害。但随着工业的发展，生 活污水、工矿业废水等未经适当处理即向外排放，污染了土壤，使得水中重金属含量急剧升 高，导致水体受到了严重的污染，而这些重金属在水中不仅不能被分解，而且在微生物的作 用下能够转化为毒性更强的金属化合物，重金属离子污染已经变成目前最严重的环境问题 之一。因此，对地表水中重金属离子识别和检测具有重要的意义。目前已将饮用水中的铜离 子(Ⅱ)的浓度限定为15.6
Figure 389193DEST_PATH_IMAGE001
或20.3
Figure 795903DEST_PATH_IMAGE001
。铜离子(Ⅱ)作为一种必需的微量元素，在机 体的各种生理过程中发挥着重要作用，但如果铜离子(Ⅱ)过多摄入或缺乏会对人体危害很 大，引起各种神经退行性疾病。
目前，关于铜(Ⅱ)离子检测的方法和技术已经有很多报道，如电感耦合等离子体原子质谱法(ICPMS)，原子吸收光谱(AAS)，比色传感器，荧光检测，电化学发光，拉曼散射等等。虽然这些方法在某些领域具有一定优势，仍存在灵敏度低，检测范围窄，读出方法比较局限等问题，所以探索更多的检测铜离子(Ⅱ)的方法仍然是非常重要和必要的。Wu等人在文献中(J. Wu, Y. Liu, Y.W. Cui, X.H. Zhao, D.M. Dong, A laser-inducedbreakdown spectroscopy-integrated lateral flow strip(LIBS-LFS)sensor forrapid detection of pathogen, Biosens.Bioelectron. 142 (2019) 111508）报道了一种基于可视化免疫层析技术和LIBS相结合，使用AuAgBNPs作为探针进行病原体的检测传感器，但是该方法所用的探针为金银合金的纳米颗粒，因为最终检测的只有在试纸条硝酸纤维素膜处的银的LIBS信号，所以一定含量的金会降低整体的银的LIBS信号的强度。而且由于采集LIBS信号的基底为硝酸纤维素膜，也会降低整体LIBS的信号强度。
Zhou等人在文献中（Y. Zhou, S.X. Wang, K. Zhang, X.Y. Jiang. Visualdetection of copper(II) by azide-and alkyne-functionalized gold nanoparticlesusing click chemistry, Angew. Chem. Int. Ed. 120(2008)7564-7566.）首次提出了基于铜离子可以催化炔基和叠氮分子分别修饰的金纳米颗发生点击化学反应，并使得金纳米颗粒发生聚集导致颜色发生变化，通过肉眼可视化读出进行二价铜离子的检测。另外，Qu等人在文献中(W.S. Qu, Y.Y. Liu, D.B. Liu, Z. Wang, X.Y. Jiang, Copper-mediatedamplification allows readout of immunoassays by the naked eye, Angew.Chem.Int. Ed. 50(2011)3442-3445)提出了一种基于CuO纳米颗粒介导的点击化学的的大分子的可视化检测，在常规的酶联免疫反应中，利用CuO纳米颗粒标记的抗体取代传统的酶标抗体，反应完成后，CuO在酸性条件下释放出Cu2+，然后在ELISA微孔板中加入抗坏血酸钠以及炔基和叠氮分子分别修饰的金纳米颗粒，在抗坏血酸钠(AA)存在的情况下，铜离子(Ⅱ)被原位还原成铜离子(Ⅰ)，并催化炔基和叠氮之间的环加成反应(CuAAC)，使得金纳米颗粒发生聚集，附着在ELISA微孔板里的CuO纳米颗粒与被检测的目标物浓度成正比。因此，目标物越多，最终释放的铜离子(Ⅰ)浓度也就越高，导致金纳米颗粒聚集越多，颜色从红色-紫色-蓝色发生转变，通过肉眼可视化，达到检测目的。但是，前两种方法是基于金纳米颗粒发生聚集产生不同颜色的肉眼可视化的读出，存在灵敏度低，主观读出因素等问题影响目标物的准确检测。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法和应用。本发明将LIBS光谱学技术和点击化学反应相结合，不仅利用银纳米颗粒产生较高的LIBS信号以及丰富了铜离子检测的读出方式，而且铜离子可以特异性的催化炔基和叠氮分子发生特异性反应，最终实现二价铜离子的高灵敏度、高特异性和较宽的线性范围的检测目的。本发明首先提供一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，包括将炔基分子修饰的牛血清蛋白、牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒、抗坏血酸钠、待测样本混合，进行点击化学反应，将反应后的上清液进行激光诱导击穿光谱检测，采集所述上清液中银纳米颗粒的LIBS信号强度，根据所述银纳米颗粒的LIBS信号强度获取二价铜离子浓度。
本发明发现，将激光诱导击穿光谱技术和点击化学相结合，通过借助银纳米可以产生较高的LIBS信号，间接的达到实现铜离子(Ⅱ)的高效检测且其它重金属离子对铜离子(Ⅱ)检测不存在干扰。该方法不仅对铜离子(Ⅱ)检测能达到nM级水平，且具有高选择性和抗干扰性，能在饮用水、地表水或者土壤中铜离子(Ⅱ)的检测具有应用价值。
根据本发明提供的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，所述叠氮分子为Azide-PEG4-NHS-Ester；和/或，所述炔基分子为Alkyne-PEG4-NHS-Ester。
根据本发明提供的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，包括以下步骤：将所述炔基分子修饰的牛血清蛋白固定于微孔板中，将所述牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒、抗坏血酸钠、待测样本与所述微孔板中固定的所述炔基分子修饰的牛血清蛋白混合，进行点击化学反应，然后采用激光诱导击穿光谱检测所述点击化学反应后的上清液中银纳米颗粒的LIBS信号强度，根据所述银纳米颗粒的LIBS信号强度获取二价铜离子浓度。
本发明发现，在ELISA微孔板中包被Alkyne-PEG4-NHS-Ester修饰的BSA(BSA-Alkyne)作为捕获探针，BSA和Azide-PEG4-NHS-Ester修饰的银纳米颗粒(AgNPs-BSA-Azide)作为标记探针输出LIBS信号，在抗坏血酸钠（AA）存在下，铜离子(Ⅱ)被原位还原形成铜离子(Ⅰ)，而铜离子(Ⅰ)可以催化炔基与叠氮之间发生点击化学反应(CuAAC)。在该发明中以CuAAC & LIBS体系为研究基础，在铜离子(Ⅱ)和抗坏血酸钠的存在下，AgNPs-BSA-Azide与BSA-Alkyne通过点击化学形成BSA-三唑-BSA-AgNPs夹心结合物。因此，上清液中残留AgNPs-BSA-Azide的Ag的LIBS信号与铜离子(Ⅱ)浓度成反比关系，通过分析银纳米颗粒的LIBS信号，可以间接的实现铜离子(Ⅱ)的定量检测。本发明将激光诱导击穿光谱技术和经典的点击化学反应相结合，解决饮用水或者水环境问题中铜离子(Ⅱ)的污染问题，不仅可以实现对铜离子(Ⅱ)的高效检测，而且对铜离子的检测方法探索了更多可能性的读出方式，利用银纳米颗粒具有相对其他金属纳米颗粒相对较高的LIBS信号，实现银纳米颗粒的LIBS信号介导扩增的铜离子(Ⅱ)检测的目的。
根据本发明提供的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，将所述上清液滴到抛光铝板上进行所述激光诱导击穿光谱检测。本发明中，将上清液滴到抛光铝板上，以特定的抛光铝板作为金属材料基底，可以提高整体的LIBS信号。
根据本发明提供的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，采集所述上清液中银纳米颗粒在328nm处的LIBS信号强度。
根据本发明提供的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，根据银纳米颗粒在328nm处的LIBS信号强度与二价铜离子浓度的线性曲线，获取二价铜离子浓度。
根据本发明提供的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，所述银纳米颗粒为粒径5~25nm的球形颗粒。
根据本发明提供的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，所述银纳米颗粒的制备包括将还原剂与AgNO3混合，进行化学还原反应；所述还原剂优选为柠檬酸三钠和/或NaBH4。
根据本发明提供的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，所述牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒的制备包括：将银纳米颗粒与牛血清白蛋白混合，制备银纳米颗粒和牛血清白蛋白的偶联物，将所述银纳米颗粒和牛血清白蛋白的偶联物与叠氮分子混合，制得所述牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒。
所述炔基分子修饰的牛血清蛋白的制备包括：将牛血清蛋白和炔基分子混合，制备牛血清蛋白和叠氮分子的偶联物。
本发明将LIBS技术和点击化学反应相结合用于二价铜离子的检测，并借助传统的酶联免疫夹心法检测大分子目标物的模式。首先在ELISA微孔板中包被炔基分子修饰的牛血清蛋白，然后加入牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒、抗坏血酸钠、待测样本混合并发生反应，最终在铜离子的催化作用下，使得所述牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒和炔基分子修饰的牛血清蛋白生成结合物。而这种检测模式可以把传统的免疫夹心法扩展到二价铜离子的应用中，并借助LIBS这一高灵敏度的光谱技术进行信号读取，最终实现二价铜离子的高效检测。
本发明还提供一种基于激光诱导击穿光谱检测二价铜离子的试剂盒，所述的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法中使用。
本发明还提供一种所述的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法在饮用水、地表水或土壤中二价铜离子检测中的应用。
本发明的有益效果至少在于：本发明首次将激光诱导击穿光谱技术和点击化学相结合，通过检测银纳米颗粒的LIBS信号，最终间接地实现了铜离子(Ⅱ)的高灵敏度的检测，灵敏度达到0.1nM，且Fe(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)和Cd(Ⅱ)对铜离子(Ⅱ)检测不存在干扰，并对实际样本进行了检测，在饮用水或者水体环境污染中具有潜在的实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中激光诱导击穿光谱系统示意图；图1中，1-信号延迟发生器、2-光谱仪、3-激光器、4-镜面、5-聚焦镜、6-光纤、7-3D检测平台、8-抛光铝板、9-含有银颗粒的上清液、10-等离子体；
图2为本发明中铜离子(Ⅱ)分析检测的示意图；
图3为本发明实施例中银纳米颗粒的透射电镜图；
图4为本发明实施例中不同浓度的铜离子(Ⅱ)条件下银纳米颗粒在328.0nm处的LIBS光谱图；
图5为本发明实施例中在铜离子(Ⅱ)浓度为5×10-2~1×104 nM范围内的线性曲线（误差棒表示：n=3）；
图6为本发明实施例中在不同离子存在下银纳米颗粒在328.0nm处的LIBS光谱图；
图7为本发明实施例中抗干扰检测光谱图（光谱图从上到下依次为：AA，铜离子(Ⅱ)，水，铜离子(Ⅱ)+AA+其它金属离子，铜离子(Ⅱ)+AA）。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
本发明的术语中，牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒表示为AgNPs-BSA-Azide；炔基分子修饰的牛血清蛋白表示为BSA-Alkyne；LIBS为激光诱导击穿光谱。点击化学(Click chemistry)，又译为“链接化学”、“动态组合化学” (Dynamic CombinatorialChemistry)、“速配接合组合式化学”，主要是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成各种分子的化学合成。本发明中的点击化学反应是通过铜(Ⅰ)可以特异性的催化炔烃与叠氮之间发生的环加成反应。
本发明中，激光诱导击穿光谱(LIBS)作为一种原子发射光谱技术，通过超短脉冲激光聚焦样品表面形成等离子体，进而对等离子体发射光谱进行分析以确定样品的物质成分及含量，LIBS系统包括信号延迟发生器1、光谱仪2、激光器3、镜面4、聚焦镜5、光纤6、3D检测平台7、抛光铝板8、含有银颗粒的上清液9、等离子体10（图1）。本发明检测方法中采用的激光诱导击穿光谱信号读出，该技术是通过短脉冲激光聚焦样本表面形成等离子体，进而对等离子体发射光谱进行分析。与其它方法相比，具有样品制备简单、检测速度快、现场测量设备便携等优点、使用灵活、灵敏度高等优点。
本发明实施例中，主要的化学试剂：牛血清白蛋白(BSA，编号:A8020)、用于配制PBS缓冲液的磷酸盐试剂片(编号:P1000)和Tween-20(编号:T8220) 购自索莱宝(中国北京)。AgNO3(编号s116266)和柠檬酸三钠(编号s116311)购自阿拉丁(中国上海)。抛光铝板(0.5 mm*50 mm* 50 mm，8K)来自淘宝网华晨金属材料店(中国深圳)。Azide-PEG4-NHS-Ester(编号:AZ103-25)和Alkyne-PEG4-NHS- Ester (编号:TA103-25)购自美国ClickChemistry Tools。其他化学品均为分析级，无需进一步提纯化。
根据本发明的实施方式，包括：银纳米颗粒（AgNPs）的制备，炔基分子（Alkyne- PEG4-NHS-Ester）修饰牛血清蛋白（BSA）的制备(BSA-Alkyne)，修饰牛血清蛋白（BSA）和叠 氮分子（Azide-PEG4-NHS-Ester）修饰银纳米的制备（AgNPs-BSA-Azide）；蛋白-炔基分子作 为包被蛋白在微孔板中的包被吸附以及对待测样品铜离子(Ⅱ)的检测，优选的，用CB缓冲 液对BSA-Alkyne进行稀释，然后将所述BSA-Alkyne加入酶联免疫吸附板中并固定，然后弃 去上清液，加入BSA溶液于CB缓冲液中，封闭残留位点；弃去上清液，用PBST洗涤微孔板；将 待测水样与AA、AgNPs-BSA-Azide和PBS混合滴加到微孔板内反应，然后取上清液滴在抛光 铝板上，室温干燥后，利用LIBS系统对抛光铝板上AgNPs的LIBS信号强度进行检测；采集 328.0nm处的银纳米颗粒的LIBS信号强度。并根据铜离子(Ⅱ)浓度与
Figure 356198DEST_PATH_IMAGE002
LIBS信号强度的线 性关系，得到待测水样中铜离子(Ⅱ)浓度。
根据本发明的实施方式，基于点击化学的简单且具有高灵敏度的铜离子(Ⅱ)的检测，在抗坏血酸钠（AA）存在下，铜离子(Ⅱ)被原位还原形成铜离子(Ⅰ)，而铜离子(Ⅰ)可以催化炔基与叠氮之间发生环加成反应(CuAAC)，将Alkyne-PEG4-NHS-Ester修饰的BSA(BSA-Alkyne)作为包被蛋白偶联物可以吸附在ELISA微孔板上，BSA和Azide-PEG4-NHS-Ester修饰的银纳米颗粒(AgNPs-BSA-Azide)作为探针输出LIBS信号。本发明以CuAAC & LIBS体系为研究基础，在铜离子(Ⅱ)和抗坏血酸钠(AA)的存在下，AgNPs-BSA-Azide与BSA-Alkyne通过点击化学形成BSA-三唑-BSA-AgNPs夹心结合物。因此，上清液中残留AgNPs-BSA-Azide的Ag的LIBS信号与铜离子(Ⅱ)浓度成反比关系，铜离子(Ⅱ)的检测限可达到0.1nM，并在0.05-10000 nM范围内呈线性响应，且具有高的特异性，并对自来水掺杂的铜离子(Ⅱ)水样和河水样本进行了检测，不仅实现了铜离子(Ⅱ)的高效检测，而且拓展了LIBS技术结合点击化学反应在地表水中铜离子(Ⅱ)检测中的潜在应用（图2）。
实施例1
本实施例提供一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，具体步骤包括：
1）银纳米颗粒的制备
采用化学还原法分别用柠檬酸三钠和NaBH4作为还原剂制备了约10 nm（图3为银纳米的透射电镜图片）的银纳米颗粒（AgNPs）。所有的玻璃器皿都预先用新鲜王水浸泡并清洗，最后用超纯水冲洗三次。简单步骤为，将1.72 mL 1% AgNO3溶液与91.48 mL超纯水在圆烧瓶中混合，加热并回流，煮沸后立即加入6.8 mL 1%柠檬酸三钠溶液，搅拌3 min后加入2μL 100 mM 的NaBH4溶液，继续搅拌20 min后，冷却至室温后，收集银纳米颗粒，放置4℃保存备用。
2）AgNPs-BSA-Azide的制备方法
滴加30 μL K2CO3(0.25M)将5mL AgNPs的pH调节为7.2，然后加入500 μL 的BSA溶液(2 mg/mL)，搅室温拌2小时，最后，离心3次(13000 rpm, 30 min)以除去上清液中残余的BSA，AgNPs-BSA偶联物用5mL PBS缓冲液(10mM, pH 7.2)重悬后，加入60μL Azide-PEG4-NHS-Ester (25 mM, DMF溶解)，室温搅拌1h，然后加入50 μL Tris-HCl缓冲液(50mM) 反应15 min后，离心3次(13000 rpb, 30 min)，除去上清中的未连接的Azide-PEG4-NHS-Ester分子，最后用1mL PBS缓冲液(10 mM, pH 7.2)重悬，4℃保存备用。
3）BSA-Alkyne的制备
用1mL PBS缓冲液(10 mM, pH 7.2)溶解5 mg BSA与25 μL Alkyne-PEG4-NHS-Ester (25 mM, DMF溶解)以1:20(摩尔比)的比例混合。室温反应1小时，加入50 μL Tris-HCl缓冲液(50 mM)，室温下反应15 min。最后，将混合物转入超滤装置(10KD过滤器)，9000rpm离心20 min，去除未结合的炔基分子。用PBS缓冲液洗涤3次后，将BSA-Alkyne偶联物转到1mL的PBS缓冲液中，-20℃冷冻保存待用。
4）捕获蛋白（BSA-Alkyne）的包被
用CB缓冲液(50mM, pH9.5)将BSA-Alkyne作为捕获偶联蛋白稀释到终浓度为30μg/mL，然后将150μL BSA-Alkyne加入酶联免疫吸附板(ELISA)中，在4℃过夜使其固定于微孔板上。然后弃去上清液，加入150μL BSA溶液(0.5%)于CB缓冲液中，封闭微孔板中的残留位点(37℃，1h)，避免后续反应发生非特异性吸附。最后，再弃去上清液，用PBST(0.5%Tween20的PBS缓冲溶液)洗涤3次，4℃保存，用于下一步铜离子(Ⅱ)的检测。
5）铜离子(Ⅱ)的灵敏度、特异性及抗干扰性能的检测验证
为了探究该体系对铜离子(Ⅱ)的检测灵敏度，将50μL不同浓度（0, 5×10-2, 1×10-1，5×10-1, 1，5，10，1×102, 1×103, 5×103, 1×104和1×105 nM）的铜离子(Ⅱ)与10μL AA(15 mM), 30 μL AgNPs-BSA-Azide和60 μL PBS(10 mM, pH值7.2)混合滴加到步骤4）的ELISA微孔板并反应1小时，然后分别取5μL上清液滴在抛光铝板上，室温干燥后，将抛光铝板放置在LIBS系统3D平台上，在相同的条件下，利用LIBS系统对抛光铝板上AgNPs的LIBS信号强度进行采集。为了进一步评估CuAAC&LIBS系统对铜离子(Ⅱ)检测的特异性问题，在相同条件下检测了一些常见的其他金属离子，包括Fe(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)和Cd(Ⅱ)，浓度均为10μM。反应结束后，分别取5μL上清液滴在抛光铝板上，室温干燥后，将抛光铝板放置在LIBS系统3D平台上，在相同的条件下，采集328.0nm处的Ag纳米颗粒的LIBS信号强度。为了验证该体系对铜离子(Ⅱ)的抗干扰性能和AA以及铜离子(Ⅱ)在点击化学中的重要作用，在铜离子(Ⅱ) (10 μM)和AA（1 mM）存在的情况下，再添加5 μM其它各金属离子，验证其它离子对铜离子(Ⅱ)检测是否存在干扰。
检测结果及结论如下：
1）检测灵敏度分析
通过实验分析，检测不同浓度的铜离子(Ⅱ)后，从图4可以看出，随着铜离子(Ⅱ) 的浓度从0增加到1×105 nM，银在328.0 nm处LIBS光谱信号强度出现逐渐降低的趋势。当 浓度为0.1 nM时，LIBS信号强度开始出现明显差异，并在328.0 nm处的光谱信号开始逐渐 降低。且铜离子(Ⅱ)浓度与
Figure 190162DEST_PATH_IMAGE002
LIBS信号强度呈良好的线性关系，线性范围在5×10-2 nM到1 ×104 nM之间（图5所示），定量检测限为0.1 nM。并建立了
Figure 707511DEST_PATH_IMAGE002
LIBS=16462.9-2313.5× CONcopper(Ⅱ) (R2=0.99)的线性曲线（其中，
Figure 917913DEST_PATH_IMAGE002
LIBS代表所测得的每个样本的Ag的实际 LIBS信号减去基底背景信号，CONcopper(Ⅱ)代表铜离子(Ⅱ)的浓度），用于铜离子(Ⅱ)的 定量分析，证明该LIBS技术结合点击化学在铜离子(Ⅱ)的定量检测中具有潜在的应用价 值。
2）选择性分析
从图6中显示只有在铜离子(Ⅱ)存在的前提下才能显著降低银纳米颗粒在328.0nm处的LIBS信号强度，而其他金属离子则不能引起银纳米颗粒的LIBS信号的降低，所以该传感器对铜离子(Ⅱ)的检测具有良好的选择性。
3）抗干扰性分析
本发明验证了铜离子(Ⅱ)+AA+其他金属离子，铜离子(Ⅱ)+AA，铜离子(Ⅱ)，AA，水，并采集各反应上清液中的银的LIBS信号。图7结果表明，其他金属离子如Fe(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)和Cd(Ⅱ)和铜离子(Ⅱ)和AA存在的条件下，对铜离子(Ⅱ)的检测基本没有影响，说明此反应抗干扰性强，可以用于铜离子(Ⅱ)的检测。另外，只有铜离子(Ⅱ)和AA同时存在时，才能生成在铜离子(Ⅰ)，并催化点击化学反应，使LIBS信号的降低，说明发生了点击化学，而单独的铜离子(Ⅱ)或者AA不会引起LIBS信号的降低。
在自来水（ICPMS检测自来水中铜离子初始浓度为10.17
Figure 332714DEST_PATH_IMAGE003
2.3 nM）中掺杂几种不 同浓度的铜离子(Ⅱ)（5000、500、50、5、0.5和0nM)来模拟真实的含有铜离子(Ⅱ)的样本用 于验证该检测体系的实用性，同时检测了真实河水（来自北京市海淀区，京密引水渠，ICPMS 检测该河水中铜离子初始浓度为13.54
Figure 337579DEST_PATH_IMAGE003
8.1 nM），对以上样本进行3次平行实验，采集样本 的LIBS信号，并用线性曲线进行分析，得到回收率和变异系数(如表1)，从结果来看，回收率 可以控制在85.56%-112.48%，变异系数在10%之内，表明该传感器可以用于实际样本中铜离 子(Ⅱ)的检测。
表1 实验例检测水样的结果
Figure 73716DEST_PATH_IMAGE004
对比例
Qu等人在文献中(W.S. Qu, Y.Y. Liu, D.B. Liu, Z. Wang, X.Y. Jiang,Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the nakedeye, Angew. Chem.Int. Ed. 50(2011)3442-3445)是采用炔基分子和叠氮分子分别修饰的金纳米颗粒进行环加成反应，炔基分子（一端为炔基，一端为巯基）和叠氮分子（一端为叠氮，一端为巯基）都是通过末端的巯基（-SH）和金纳米颗粒发生连接，并形成很强的金-硫键（Au-S）进行的修饰。而在本发明中，炔基分子（一端为炔基，一端为活泼酯）和叠氮分子（一端为叠氮，一端为活泼酯）则是通过末端的活泼酯基团和牛血清蛋白上的氨基进行反应并修饰的。这样炔基分子（Alkyne-PEG4-NHS-Ester）修饰到牛血清蛋白上才能固定在ELISA微孔板中，而叠氮分子（Azide-PEG4-NHS-Ester）则是通过牛血清蛋白才能间接修饰到银纳米颗粒上。另外，这篇基于点击化学的反应而进行大分子目标物（HIV）的检测，最终是通过肉眼可视化的读取金纳米颗粒的颜色变化，并判定目标物的含量，该方法灵敏度较低，且由于读取会带有主观因素，所以会影响检测的准确性。
Zhou等人在文献中（Y. Zhou, S.X. Wang, K. Zhang, X.Y. Jiang. Visualdetection of copper(II) by azide-and alkyne-functionalized gold nanoparticlesusing click chemistry, Angew. Chem. Int. Ed. 120(2008)7564-7566.)是通过二价铜离子在抗坏血酸钠的作用下，生成一价铜离子，并催化炔基和叠氮分别修饰的金纳米颗粒发生点击化学反应，并使得金纳米颗粒发生不同程度的聚集，颜色由红色-紫色-蓝色的渐变规律，通过肉眼可视化读取颜色变化实现二价铜离子的检测，但是该检测方法存在灵敏度低，受人为因素读取等会影响最终铜离子 的检测结果。
Wu等人在文献中(J. Wu, Y. Liu, Y.W. Cui, X.H. Zhao, D.M. Dong, Alaser-induced breakdown spectroscopy-integrated lateral flow strip(LIBS-LFS)sensor for rapid detection of pathogen, Biosens.Bioelectron. 142 (2019)111508），则是通过免疫学原理，在免疫层试纸条上实现对金黄色葡萄球菌的定量检测。当存在目标物时，金银合金的纳米颗粒在试纸条上的测试线（T line）处发生聚集，并形成一条肉眼可见的黄色条带（即：金银纳米颗粒的条带），并用LIBS系统检测该条带处的银的信号，从而实现对目标物的定量检测。由于检测信号时是以试纸条上的硝酸纤维素膜作为基底，因此整体的LIBS信号会相对较低，本发明中以抛光铝板（金属材质）作为基底检测银信号，也会整体提高LIBS信号强度。
本发明是将LIBS技术和点击化学反应相结合，通过检测银的LIBS信号，达到间接定量检测二价铜离子的目的。而如果直接检测样本中铜的LIBS信号并实现铜离子的检测，这样灵敏度（大约10μM）会较差。因为铜和银在相同浓度的情况下，银是可以产生较高的LIBS信号，而铜的LIBS信号相对较弱。所以，在本发明中，将银纳米颗粒介导的LIBS信号扩增转化为二价铜离子的浓度，能够有效地实现高灵敏度的检测。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，其特征在于，包括：将炔基分子修饰的牛血清蛋白、牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒、抗坏血酸钠、待测样本混合，进行点击化学反应，将反应后的上清液进行激光诱导击穿光谱检测，采集所述上清液中银纳米颗粒的LIBS信号强度，根据所述银纳米颗粒的LIBS信号强度获取二价铜离子浓度。
2.根据权利要求1所述的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，其特征在于，所述叠氮分子为Azide-PEG4-NHS-Ester；和/或，所述炔基分子为Alkyne-PEG4-NHS-Ester。
3.根据权利要求2所述的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述炔基分子修饰的牛血清蛋白固定于微孔板中，将所述牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒、抗坏血酸钠、待测样本与所述微孔板中固定的所述炔基分子修饰的牛血清蛋白混合，进行点击化学反应，然后采用激光诱导击穿光谱检测所述点击化学反应后的上清液中银纳米颗粒的LIBS信号强度，根据所述银纳米颗粒的LIBS信号强度获取二价铜离子浓度。
4.根据权利要求3所述的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，其特征在于，将所述上清液滴到抛光铝板上进行所述激光诱导击穿光谱检测。
5.根据权利要求3所述的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，其特征在于，采集所述上清液中银纳米颗粒在328nm处的LIBS信号强度；根据银纳米颗粒在328nm处的LIBS信号强度与二价铜离子浓度的线性曲线，获取二价铜离子浓度。
6.根据权利要求5所述的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，其特征在于，所述银纳米颗粒为粒径5~25nm的球形颗粒。
7.根据权利要求1-6任一项所述的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，其特征在于，所述银纳米颗粒的制备包括将还原剂与AgNO3混合，进行化学还原反应；所述还原剂为柠檬酸三钠和/或NaBH4。
8.根据权利要求1-6任一项所述的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒的制备包括：将银纳米颗粒与牛血清白蛋白混合，制备银纳米颗粒和牛血清白蛋白的偶联物，将所述银纳米颗粒和牛血清白蛋白的偶联物与叠氮分子混合，制得所述牛血清白蛋白和叠氮分子修饰的银纳米颗粒。
9.权利要求1-8任一项所述的基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法在饮用水、地表水或土壤中二价铜离子检测中的应用。
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