CN111912830A - 一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法 - Google Patents
一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111912830A CN111912830A CN202010191036.8A CN202010191036A CN111912830A CN 111912830 A CN111912830 A CN 111912830A CN 202010191036 A CN202010191036 A CN 202010191036A CN 111912830 A CN111912830 A CN 111912830A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacteria
- sinws
- solution
- quantitative analysis
- rapid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 238000002536 laser-induced breakdown spectroscopy Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 title claims abstract description 26
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 34
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims abstract description 34
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 claims abstract description 20
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims abstract description 17
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical group [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 38
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 30
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 24
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- NJSVDVPGINTNGX-UHFFFAOYSA-N [dimethoxy(propyl)silyl]oxymethanamine Chemical compound CCC[Si](OC)(OC)OCN NJSVDVPGINTNGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 12
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 11
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 11
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 9
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000003486 chemical etching Methods 0.000 claims description 7
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 5
- 150000003376 silicon Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000005530 etching Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N Formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 2
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910004042 HAuCl4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101000694017 Homo sapiens Sodium channel protein type 5 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 241001125931 Hoplias malabaricus Species 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000001636 atomic emission spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000010249 in-situ analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/71—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light thermally excited
- G01N21/718—Laser microanalysis, i.e. with formation of sample plasma
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法。首先设计了一段同时含有适配体和聚胸腺嘧啶序列的寡聚核苷酸单链，其中聚胸腺嘧啶可以组装形成铜纳米粒子，适配体序列可以特异性地和待检测细菌结合从而实现元素标记。然后使用修饰了银包金核壳结构纳米粒子的硅纳米线阵列（SiNWs‑Au@Ag）对被标记的细菌进行富集，最后使用LIBS方法对细菌进行定量分析。本发明克服了现有技术中的通过对细菌本身固有元素进行对应检测的LIBS分析方法存在被环境基质干扰的风险，且不具备特异性的缺点，实现了对细菌的快速高效特异性定量分析，选择性和稳定性都很好，应用前景优良。
Description
技术领域
本发明属于细菌检测领域，涉及一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法。
背景技术
食品和水中的细菌污染成为全球关注的热点话题，因此科研人员也开发出一系列的细菌检测方法来保障人们的饮食安全。其中传统的方法包括纯培养，酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)，它们虽然特异性好，结果可靠，但是也存在耗时费力的缺点，难以满足现代社会高时效性的要求，因此不断有新的细菌快速检测方法被开发出来。然而目前大多数的细菌快速检测方法都聚焦于细菌的鉴别与分类，仍然缺乏一种可以对细菌进行快速特异性定量分析的方法。
随着高灵敏度电感耦合器件的快速发展和高功率激光器的出现，激光诱导击穿光谱(Laser Induced Breakdown Spectroscopy,简称LIBS)技术逐渐成为分析化学中的常用技术。LIBS是一种将高功率脉冲激光聚焦到物质表面使其产生等离子体，通过分析等离子体发射光谱中的特征谱线，实现对样品含有的元素进行定性与定量分析的一种原子发射光谱技术。LIBS由于具有分析速度快，多元素检测、样品制备少、现场原位分析等优点，已成为直接检测目标物含有元素类型和含量的一种常用分析技术。而细菌本身具有丰富的矿物离子(例如 Ca、Mg和Na)，通过建立LIBS光谱强度与细菌溶液浓度之间的定量关系，可以达到对细菌进行定量分析的目的。但是这种基于细菌本身固有元素的分析方法存在被环境基质干扰的风险，并且不具备特异性。
因此，提供一种能够避免因细菌本身固有元素容易被环境基质干扰的风险、并且能够利用其特异性进行定量分析的方法，对于细菌快速检测领域具有重要意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，实现对细菌的快速特异性定量分析，本发明提供了一种使用细菌本身不含有的元素对其进行标记后，再采用激光诱导击穿光谱进行检测的细菌快速检测方法。本方法首先设计了一段同时含有适配体和聚胸腺嘧啶序列(聚T序列)的寡聚核苷酸单链，其中聚胸腺嘧啶可以组装形成铜纳米粒子，适配体序列可以特异性地和待检测的细菌结合从而实现元素标记；然后使用修饰了银包金核壳结构纳米粒子的硅纳米线阵列SiNWs-Au@Ag对被元素标记的细菌进行富集，最后使用LIBS方法对细菌进行定量分析。
为达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，包括以下步骤：
步骤1：使用金属辅助化学刻蚀法制备硅纳米线SiNWs，并将银包金核壳结构纳米粒子Au@AgNPs修饰到SiNWs，制备得到捕获细菌用的基底SiNWs- Au@Ag；
步骤2：用包含适配体和聚T序列的DNA Apt-T40组装铜纳米粒子，然后通过适配体与细菌之间的特异性识别作用将铜纳米粒子连接到细菌上，制备经元素标记的细菌；
步骤3：用步骤1得到的捕获细菌用的基底SiNWs-Au@Ag来富集步骤2得到的元素标记的细菌；采用LIBS方法对富集后的细菌进行检测分析。
进一步地，所述的步骤(1)中硅纳米线SiNWs使用金属辅助化学刻蚀法制备，制备步骤如下：将硅片进行清洗，然后浸泡在浓H2SO4和H2O2的混合溶液，加热后保温一段时间，取出洗净后浸泡在HF溶液中使其表面生成Si-H 键，取出吹干后与HF和硝酸银的混合液反应，取出后浸泡在HF与H2O2的混合液中避光刻蚀，最后浸泡在稀硝酸中溶解AgNPs，清洗后在空气中干燥。
进一步地，所述的步骤(1)中基底SiNWs-Au@Ag的制备方法如下：将制备得到的硅纳米线SiNWs放入浓H2SO4和H2O2的混合溶液中90℃加热30min，使表面羟基化成为SiNWs-OH；然后将SiNWs-OH放入APTMS溶液中1小时，使表面氨基化；最后将氨基化的硅片放入Au@Ag胶体中浸泡12小时，得到所述的基底SiNWs-Au@Ag。
进一步地，所述的将硅纳米线SiNWs放入浓H2SO4和H2O2的混合溶液中加热的温度为90℃，加热时间为30min；所述的将SiNWs-OH放置在APTMS溶液中的时间为1小时，所述的APTMS溶液为1％的溶液，由乙醇和乙酸以5:2的比例稀释而成；所述的将氨基化的硅片放入Au@Ag胶体中浸泡的时间为12个小时。
进一步地，所述的清洗硅片的方式为将硅片先后在乙醇，丙酮和超纯水中进行超声清洗；所述的浸泡在浓H2SO4和H2O2的混合溶液中加热的温度为加热至90℃；所述的保温时间为加热至90℃后保持30分钟；所述的浸泡在HF溶液中使其表面生成Si-H键的时间为3分钟，所述的HF溶液浓度为5％；所述的与 HF和硝酸银的混合液反应的时间为1分钟；所述的浸泡在HF与H2O2的混合液中避光刻蚀的时间为1小时。
进一步地，所述的在丙酮和水中超声清洗的时间为10min，超声频率为 40KHz；所述浓H2SO4和H2O2混合溶液的比例为3:1，浓H2SO4的浓度为98％，H2O2的浓度为30％；所述的APTMS浓度为1％；所述的稀硝酸为30％稀硝酸；所述的硝酸银浓度为0.1M,体积为8μL。
进一步地，所述的步骤(1)中制备银包金核壳结构纳米粒子Au@AgNPs的步骤如下：将48.5mL含有0.5mL HAuCl4·3H2O(0.01g/mL)的超纯水在搅拌回流下加热到沸腾。然后将1.5mL 1％Na3C6H5O7·3H2O(v/v)快速加入到沸腾溶液中。当溶液的颜色变成稳定的酒红色时，继续保持沸腾30分钟，然后在搅拌状态下冷却至室温，由此得到金纳米粒子(AuNPs)。然后取1mL金纳米胶体，向该溶液中加入8μL的0.1M AgNO3并混合好，然后向溶液中加入8μL的0.1M抗坏血酸和2μL的氨水(25％)，并将该混合物涡旋均匀。溶液的颜色从红色变为棕色，表明Au@AgNPs成功制备。
进一步地，所述的步骤(2)中用包含适配体和聚T序列的DNA Apt-T40组装铜纳米粒子的方法如下：将DNA Apt-T40、抗坏血酸和硫酸铜加入缓冲液中，在室温下避光反应，制备得到元素标签Apt-CuNPs；所述的缓冲液由MOPS、 NaCl组成。
进一步地，所述的DNA Apt-T40浓度为10μM、体积为30μL；所述的抗坏血酸浓度为10mM、体积为90μL；所述的硫酸铜浓度为1mM、体积为 30μL；所述的缓冲液体积为120μL，由10mm MOPS、150mm NaCl组成，pH 值为7.8；所述的避光反应时间为5分钟。
进一步地，所述DNA序列为 TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT
本发明能够实现以下有益的技术效果：本发明通过采用细菌本身非固有的元素对其进行标记的方法，克服了现有技术中的通过对细菌本身固有元素进行对应检测的LIBS分析方法存在被环境基质干扰的风险，且不具备特异性的缺点，实现了对细菌的快速高效特异性定量分析，选择性和稳定性都很好，应用前景优良。
附图说明
图1：采用本发明方法分析的SiNWs-Au@Ag/S.ty/CuNPs复合物全谱；
图2：a为不同浓度鼠伤寒沙门氏菌被检测的光谱强度：(1)SiNWs- Au@Ag,(2)0CFU/mL,(3)101CFU/mL,(4)102CFU/mL,(5)103CFU/mL,(6)104 CFU/mL,(7)105CFU/mL,(8)106CFU/mL；b为拟合峰面积与菌液浓度经过对数变换换后的线性关系。
具体实施方式
在本部分中，将结合具体实施例，对本发明技术方案进行进一步详细的解释与说明。
实施例1
本实施例提供一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，包括以下步骤：
步骤1：使用金属辅助化学刻蚀法制备硅纳米线SiNWs，并将银包金核壳结构纳米粒子Au@AgNPs修饰到SiNWs，制备得到捕获细菌用的基底SiNWs- Au@Ag；
步骤2：用包含适配体和聚T序列的DNA Apt-T40组装铜纳米粒子，然后通过适配体与细菌之间的特异性识别作用将铜纳米粒子连接到细菌上，制备经元素标记的细菌。其中，不同的细菌拥有不同的适配体序列，需要根据待检测细菌选择不同的适配体序列，聚T序列不变。本检测方法是一种通用检测方法，不同的细菌只需要换用不同的适配体序列即可，而适配体序列的筛选可以采用现有技术中任何可以实现的方法。例如，现有技术中可以通过SELEX工作筛选适配体序列。在通过筛选得到可用的适配体序列后，在适配体序列后面连上T40即可。
步骤3：用步骤1得到的捕获细菌用的基底SiNWs-Au@Ag来富集步骤2得到的元素标记的细菌；采用LIBS方法对富集后的细菌进行检测分析。
实施例2
本实施例提供一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，包括以下步骤：
步骤1：使用金属辅助化学刻蚀法制备硅纳米线SiNWs，并将银包金核壳结构纳米粒子Au@AgNPs修饰到SiNWs，制备得到捕获细菌用的基底SiNWs- Au@Ag。
其中硅纳米线SiNWs的制备方法如下：将硅片进行清洗，然后浸泡在浓 H2SO4和H2O2的混合溶液中，加热后保温一段时间，取出洗净后浸泡在HF溶液中使其表面生成Si-H键，取出吹干后与HF和硝酸银的混合液反应，取出后浸泡在HF与H2O2的混合液中避光刻蚀，然后浸泡在稀硝酸中溶解AgNPs，清洗后在空气中干燥。
其中银包金核壳结构纳米粒子Au@AgNPs可以采用现有技术中任何可以实现的方法进行制备。
在制备得到上述的硅纳米线SiNWs及银包金核壳结构纳米粒子Au@AgNPs 后，将制备得到的硅纳米线SiNWs放入浓H2SO4和H2O2的混合溶液中90℃加热 30min，使表面羟基化成为SiNWs-OH；然后将SiNWs-OH放入APTMS溶液中1小时，使表面氨基化；最后将氨基化的硅片放入Au@Ag胶体中浸泡12小时，得到所述的基底SiNWs-Au@Ag。
步骤2：用包含适配体和聚T序列的DNA Apt-T40组装铜纳米粒子，然后通过适配体与细菌之间的特异性识别作用将铜纳米粒子连接到细菌上，制备经元素标记的细菌。其中，不同的细菌拥有不同的适配体序列，需要根据待检测细菌选择不同的适配体序列，聚T序列不变。本检测方法是一种通用检测方法，不同的细菌只需要换用不同的适配体序列即可，而适配体序列的筛选可以采用现有技术中任何可以实现的方法。例如，现有技术中可以通过SELEX工作筛选适配体序列。在通过筛选得到可用的适配体序列后，在适配体序列后面连上T40即可。
其中用包含适配体和聚T序列的DNA Apt-T40组装铜纳米粒子的方法如下：将DNAApt-T40、抗坏血酸和硫酸铜加入缓冲液中，在室温下避光反应，制备得到元素标签Apt-CuNPs；所述的缓冲液由MOPS、NaCl组成。
进一步地，对细菌进行标记的方法系成熟技术，可以采用现有技术中任何可行的方式实现。
步骤3：用步骤1得到的捕获细菌用的基底SiNWs-Au@Ag来富集步骤2得到的元素标记的细菌；采用LIBS方法对富集后的细菌进行检测分析。其中，用基底捕获、富集目标细菌的方法系成熟技术，可以采用现有技术中任何可行的方式实现。
实施例3
本实施例提供一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，包括以下步骤：
步骤1：使用金属辅助化学刻蚀法制备硅纳米线SiNWs，并将银包金核壳结构纳米粒子Au@AgNPs修饰到硅纳米线SiNWs上，制备得到捕获细菌用的基底SiNWs-Au@Ag。
其中，硅纳米线SiNWs的制备方法如下：将硅片先后在乙醇，丙酮和超纯水中进行超声清洗，超声清洗的时间为10min，超声频率为40KHz；；然后浸泡在浓H2SO4和H2O2的混合溶液中加热至90℃后保持30分钟，所述浓H2SO4和 H2O2混合溶液的比例为3:1，浓H2SO4的浓度为98％，H2O2的浓度为30％；取出洗净后浸泡在5％HF溶液中3分钟使其表面生成Si-H键，取出吹干后与HF和硝酸银的混合液反应1分钟，硝酸银浓度为0.1M,体积为8μL；取出后浸泡在HF 与H2O2的混合液中避光刻蚀1小时，然后浸泡在30％稀硝酸中溶解AgNPs，清洗后在空气中干燥。
其中银包金核壳结构纳米粒子Au@AgNPs可以采用现有技术中任何可以实现的方法进行制备。
将制备得到的硅纳米线SiNWs放入浓H2SO4和H2O2的混合溶液中加热，加热的温度为90℃，加热时间为30min，使表面羟基化成为SiNWs-OH；然后将 SiNWs-OH放入APTMS溶液中1小时，使表面氨基化，所述的APTMS溶液为1％的溶液，由乙醇和乙酸以5:2的比例稀释而成；最后将氨基化的硅片放入 Au@Ag胶体中浸泡12个小时，得到基底SiNWs-Au@Ag。
步骤2：用包含适配体和聚T序列的DNA Apt-T40组装铜纳米粒子，然后通过适配体与细菌之间的特异性识别作用将铜纳米粒子连接到细菌上，制备经元素标记的细菌；
其中，所述DNA序列为 TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT
其中，用包含适配体和聚T序列的DNA Apt-T40组装铜纳米粒子的方法如下：将浓度为10μM、体积为30μL的DNA Apt-T40，浓度为10mM、体积为 90μL的抗坏血酸和浓度为1mM、体积为30μL的硫酸铜加入缓冲液中，在室温下避光反应5分钟，制备得到元素标签Apt-CuNPs，所述的缓冲液体积为 120μL，由10mm MOPS、150mm NaCl组成，pH值为7.8。
用包含适配体和聚T序列的DNA Apt-T40组装铜纳米粒子完成后，对细菌进行标记的方法系成熟技术，可以采用现有技术中任何可行的方式实现。
步骤3：用步骤1得到的捕获细菌用的基底SiNWs-Au@Ag来富集步骤2得到的元素标记的细菌；采用LIBS方法对富集后的细菌进行检测分析。其中，用基底捕获、富集目标细菌的方法系成熟技术，可以采用现有技术中任何可行的方式实现。
实施例4
本实施例提供一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，具体应用为对鼠伤寒沙门氏菌进行快速特异性定量分析。具体实施过程为：
(1)制备银包金核壳结构纳米粒子(Au@AgNPs):将48.5mL含有0.5mL HAuCl4·3H2O(0.01g/mL)的超纯水在搅拌回流下加热到沸腾。然后将1.5mL 1％ Na3C6H5O7·3H2O(v/v)快速加入到沸腾溶液中。当溶液的颜色变成稳定的酒红色时，继续保持沸腾30分钟，然后在搅拌状态下冷却至室温，由此得到金纳米粒子(AuNPs)。然后取1mL金纳米胶体，向该溶液中加入8μL的0.1M AgNO3 并混合好，然后向溶液中加入8μL的0.1M抗坏血酸和2μL的氨水(25％)，并将该混合物涡旋均匀。溶液的颜色从红色变为棕色，表明Au@AgNPs成功制备。
(2)制备SiNWs-Au@Ag：先用金属辅助化学刻蚀(metal assisted chemicaletching，简称MACE)方法制备SiNWs。将单面抛光的p型硅片(电阻率为0.01-0.02ω.cm)切割成8mm×8mm的晶片，在超声波清洁机中，用丙酮、乙醇和超纯水依次清洗10分钟。然后在水虎鱼溶液(98％H2SO4/30％H2O2，3： 1，v/v)中浸泡10分钟，5％氢氟酸中浸泡3分钟。随后，将硅片在含有4.8M 氢氟酸和0.02M硝酸银的水溶液中放置1分钟。当硅片表面覆盖一层AgNPS 后，用超纯水清洗然后浸泡在由4.8M氢氟酸和0.15M双氧水组成的蚀刻剂中。在室温避光条件下刻蚀1小时后，取出硅片并浸泡在稀释的HNO3(1：1， v/v)中，把AgNPS从SiNWs表面去除。然后将SiNWs置于新配制的水虎鱼溶液中，在90℃下加热30分钟，将羟基修饰到SiNWs表面(SiNWs-OH)。然后用超纯水清洗，并与1％APTMS(乙醇/乙酸，5：2，v/v)反应1h，制得 SiNWs(SiNWs-NH2)。用超纯水和乙醇彻底洗净后，将SiNWs-NH2浸泡在 Au@AgNPs胶体中12小时,由此形成的SiNWs-Au@Ag基底用超纯水冲洗，并在氮气流中干燥。
(3)制备元素标签(Apt-CuNPs)：将30μLDNA(Apt-T40：10μM)，90μL 抗坏血酸(10mM)和30μL硫酸铜(1mM)加入120μL缓冲液中(10mm MOPS，150mm NaCl，pH7.8)。在室温下避光反应5分钟。
(4)标记并富集细菌：先将OD600＝0.1的鼠伤寒沙门氏菌悬液与Apt- CuNPs在37℃条件下孵育30分钟，然后用超纯水梯度稀释该菌液。随后，将细菌溶液与SiNWs-Au@Ag孵育30分钟，形成SiNWs-Au@Ag/S.ty/CuNPs的夹心结构。最后用超纯水彻底冲洗该复合物并在空气中干燥后，将其放置在检测平台上进行分析。进行LIBS实验时，脉冲激光器的脉冲能量为30mJ,脉冲激光器重复频率为10Hz光谱仪为带ICCD的中阶梯光谱仪，延迟时间为1μs，门宽为10μs。
由图2可以看出，不同浓度的细菌，信号强度差异很明显，且线性关系也很好，经计算检测限为61CFU/mL，充分说明本发明提供的一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，是非常灵敏的检测方法。本发明通过采用细菌本身非固有的元素对其进行标记的方法，克服了现有技术中的通过对细菌本身固有元素进行对应检测的LIBS分析方法存在被环境基质干扰的风险，且不具备特异性的缺点，实现了对细菌的快速高效特异性定量分析，选择性和稳定性都很好，应用前景优良。
Claims (9)
1.一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：使用金属辅助化学刻蚀法制备硅纳米线SiNWs，并将银包金核壳结构纳米粒子Au@AgNPs修饰到硅纳米线SiNWs上，制备得到捕获细菌用的基底SiNWs-Au@Ag；
步骤2：用包含适配体和聚T序列的DNA Apt-T40 组装铜纳米粒子，然后通过适配体与细菌之间的特异性识别作用将铜纳米粒子连接到细菌上，制备经元素标记的细菌；
步骤3：用步骤1得到的捕获细菌用的基底SiNWs-Au@Ag来富集步骤2得到的经元素标记的细菌；采用LIBS方法对富集后的细菌进行检测分析。
2.一种如权利要求1所述的基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，其特征在于：所述的步骤（1）中硅纳米线SiNWs的制备方法为：
将硅片进行清洗，然后浸泡在浓H2SO4和H2O2的混合溶液中，加热后保温一段时间，取出洗净后浸泡在HF溶液中使其表面生成Si-H键，取出吹干后与HF和硝酸银的混合液反应，取出后浸泡在HF与H2O2的混合液中避光刻蚀，然后浸泡在稀硝酸中溶解AgNPs，清洗后干燥。
3.一种如权利要求2所述的基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，其特征在于：所述的步骤（1）中基底SiNWs-Au@Ag的制备方法如下：
将制备得到的硅纳米线SiNWs放入浓H2SO4和H2O2的混合溶液中加热，使表面羟基化成为SiNWs-OH；然后将SiNWs-OH放入APTMS溶液中，使表面氨基化；最后放入Au@Ag胶体中浸泡，得到所述的基底SiNWs-Au@Ag。
4.一种如权利要求3所述的基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，其特征在于：所述的将硅纳米线SiNWs放入浓H2SO4和H2O2的混合溶液中加热的温度为90℃，加热时间为30min；所述的将SiNWs-OH放置在APTMS溶液中的时间为1小时，所述的APTMS溶液浓度为1%，由乙醇和乙酸以5:2的比例稀释而成；所述的将氨基化的硅片放入Au@Ag胶体中浸泡的时间为12个小时。
5.一种如权利要求2所述的基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，其特征在于：所述的清洗硅片的方式为将硅片先后在乙醇，丙酮和超纯水中进行超声清洗；所述将清洗后的硅片浸泡在浓H2SO4和H2O2的混合溶液中加热的温度为加热至90℃；所述的保温时间为加热至90℃后保持30分钟；所述的浸泡在HF溶液中使其表面生成Si-H键的时间为3分钟，所述的HF溶液浓度为5%；所述的与HF和硝酸银的混合液反应的时间为1分钟；所述的浸泡在HF与H2O2的混合液中避光刻蚀的时间为1小时。
6.一种如权利要求5所述的基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，其特征在于：所述的硅片在丙酮和水中超声清洗的时间为10min，超声频率为40KHz；所述浓H2SO4和H2O2混合溶液的比例为3:1，浓H2SO4的浓度为98%，H2O2的浓度为30%；所述的稀硝酸为30%稀硝酸；所述的硝酸银浓度为0.1M,体积为8μL。
7.一种如权利要求2-6任一所述的基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，其特征在于：所述的步骤（2）中用包含适配体和聚T序列的DNA Apt-T40 组装铜纳米粒子的方法为：
将DNA Apt-T40、抗坏血酸和硫酸铜加入缓冲液中，在室温下避光反应，制备得到元素标签Apt-CuNPs；所述的缓冲液由MOPS、NaCl组成。
8.一种如权利要求7所述的基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，其特征在于：所述的DNA Apt-T40浓度为10μM 、体积为30μL；所述的抗坏血酸浓度为10mM 、体积为90μL；所述的硫酸铜浓度为1mM 、体积为30μL；所述的缓冲液体积为120μL，由10 mm MOPS、150 mm NaCl组成，pH值为7.8；所述的避光反应时间为5分钟。
9.一种如权利要求7所述的基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法，其特征在于：所述DNA序列为TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010191036.8A CN111912830B (zh) | 2020-03-18 | 2020-03-18 | 一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010191036.8A CN111912830B (zh) | 2020-03-18 | 2020-03-18 | 一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111912830A true CN111912830A (zh) | 2020-11-10 |
| CN111912830B CN111912830B (zh) | 2023-10-20 |
Family
ID=73237374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010191036.8A Active CN111912830B (zh) | 2020-03-18 | 2020-03-18 | 一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111912830B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113049671A (zh) * | 2021-03-18 | 2021-06-29 | 宁波江丰电子材料股份有限公司 | 一种检测钴中杂质元素含量的方法 |
| CN113588627A (zh) * | 2021-09-28 | 2021-11-02 | 北京市农林科学院智能装备技术研究中心 | 一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法和应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140368819A1 (en) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | Applied Research Associates, Inc. | Methods for Detecting Parasites, Viruses, Bacteria and Drugs in Human and Animal Blood and Cerebral Spinal Fluid, Using Laser-Induced Breakdown Spectroscopy |
| CN104406943A (zh) * | 2014-11-26 | 2015-03-11 | 四川大学 | 激光诱导击穿光谱检测技术中液体样品的前处理方法 |
| US20150284763A1 (en) * | 2012-09-14 | 2015-10-08 | University Of Windsor | Method of Using Laser-Induced Breakdown Spectroscopy for the Identification and Classification of Bacteria |
| CN105319088A (zh) * | 2014-06-25 | 2016-02-10 | 四川大学 | 一种激光诱导击穿光谱检测液体样品的前处理方法 |
| CN107677661A (zh) * | 2017-08-16 | 2018-02-09 | 樊之雄 | 一种基于适配体测定银离子的化学发光传感器的检测方法 |
| CN110161012A (zh) * | 2018-06-14 | 2019-08-23 | 四川大学 | 一种基于表面增强拉曼散射-激光诱导击穿光谱联用的细菌快速检测方法 |
-
2020
- 2020-03-18 CN CN202010191036.8A patent/CN111912830B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150284763A1 (en) * | 2012-09-14 | 2015-10-08 | University Of Windsor | Method of Using Laser-Induced Breakdown Spectroscopy for the Identification and Classification of Bacteria |
| US20140368819A1 (en) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | Applied Research Associates, Inc. | Methods for Detecting Parasites, Viruses, Bacteria and Drugs in Human and Animal Blood and Cerebral Spinal Fluid, Using Laser-Induced Breakdown Spectroscopy |
| CN105319088A (zh) * | 2014-06-25 | 2016-02-10 | 四川大学 | 一种激光诱导击穿光谱检测液体样品的前处理方法 |
| CN104406943A (zh) * | 2014-11-26 | 2015-03-11 | 四川大学 | 激光诱导击穿光谱检测技术中液体样品的前处理方法 |
| CN107677661A (zh) * | 2017-08-16 | 2018-02-09 | 樊之雄 | 一种基于适配体测定银离子的化学发光传感器的检测方法 |
| CN110161012A (zh) * | 2018-06-14 | 2019-08-23 | 四川大学 | 一种基于表面增强拉曼散射-激光诱导击穿光谱联用的细菌快速检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ORTAL SCHWARTZ ET AL.,: "Microfluidic Assay for Continuous Bacteria Detection Using Antimicrobial Peptides and Isotachophoresis" * |
| 刘宪云 等: "激光诱导击穿光谱在生物医学中的应用" * |
| 陈君玺 等: "激光诱导击穿光谱技术用 于生化危险品检测" * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113049671A (zh) * | 2021-03-18 | 2021-06-29 | 宁波江丰电子材料股份有限公司 | 一种检测钴中杂质元素含量的方法 |
| CN113588627A (zh) * | 2021-09-28 | 2021-11-02 | 北京市农林科学院智能装备技术研究中心 | 一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法和应用 |
| CN113588627B (zh) * | 2021-09-28 | 2022-01-18 | 北京市农林科学院智能装备技术研究中心 | 一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111912830B (zh) | 2023-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wali et al. | Rapid and highly efficient detection of ultra-low concentration of penicillin G by gold nanoparticles/porous silicon SERS active substrate | |
| Neng et al. | Application of surface-enhanced Raman spectroscopy in fast detection of toxic and harmful substances in food | |
| CN111912830B (zh) | 一种基于元素标记激光诱导击穿光谱的细菌快速特异性定量分析方法 | |
| CN104458704B (zh) | 基于dna修饰的sers基底检测低浓度汞离子的方法 | |
| CN109612977B (zh) | 基于表面增强拉曼光谱的无酶信号放大生物标志物检测方法 | |
| CN103712972B (zh) | 一种表面增强拉曼基底的制备方法 | |
| Tang et al. | A novel colorimetric sensor for Hg 2+ based on hybridization chain reaction and silver nanowire amplification | |
| CN103837519A (zh) | 表面增强拉曼光谱测量多种多氯联苯的方法 | |
| Zhao et al. | A SERS-based capillary sensor for the detection of mercury ions in environmental water | |
| CN110161012B (zh) | 一种基于表面增强拉曼散射-激光诱导击穿光谱联用的细菌快速检测方法 | |
| CN103776812A (zh) | 表面增强拉曼基底的制备方法 | |
| CN112014373B (zh) | 一种sers拉曼基底、其制备及农药残留的分析检测方法 | |
| CN113061649B (zh) | 检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法 | |
| Zou et al. | Ag nanorods-based surface-enhanced Raman scattering: Synthesis, quantitative analysis strategies, and applications | |
| CN105445252B (zh) | 一种基于表面增强共振拉曼光谱的多巴胺检测方法 | |
| Zhang et al. | Microchip-based surface enhanced Raman spectroscopy for the determination of sodium thiocyanate in milk | |
| WO2020186834A1 (zh) | 一种用于检测合成色素的sers基底及拉曼检测方法 | |
| CN109781694B (zh) | 一种葡萄酒中金属离子的快速检测方法 | |
| CN108982465B (zh) | 酒中二氧化硫高通量sers在线检测方法 | |
| CN113640274A (zh) | 一种基于适配体门控介孔二氧化硅的金黄色葡萄球菌检测方法 | |
| CN111007053A (zh) | 用于检测银离子浓度的荧光适体传感器及其制备方法和应用 | |
| CN114354572B (zh) | 三维柔性sers基底以及基于该基底的腐胺和尸胺的检测方法 | |
| CN103389296A (zh) | 一种具有三维纳米孔洞结构sers活性基片的快速制备方法 | |
| CN111781188B (zh) | 一种铝基花状复合纳米结构的sers基底的制备方法及sers基底 | |
| CN110736729A (zh) | 一种基于复合纳米材料的动物源性食品中克伦特罗的快速检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |