CN107677661A - 一种基于适配体测定银离子的化学发光传感器的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法,属于生物检测领域。本发明包括:贵金属纳米粒子修饰Ag+适配体的一条链,两条适配体捕获Ag+形成纳米粒子‑适配体‑Ag+‑G‑四联体DNA的复合结构,G‑四联体‑氯化血红素复合物的形成以及化学发光信号的测定。本发明应用胞嘧啶‑胞嘧啶(C‑C)错配碱基组成的双链DNA对Ag+的高选择性和高捕获能力,近一步形成类似于辣根过氧化物酶活性的G‑四联体‑氯化血红素复合物,此复合物可以催化鲁米诺试剂产生化学发光,通过化学发光信号对Ag+含量进行检测。本方法检测限低、亲和性高、分析速度快、特异性好,可以应用于实际样本中Ag+的检测。
Description
技术领域
一种基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法,属于生物检测领域。
背景技术
在我们的日常生活中,银是一种不可或缺的重金属,银及其化合物被广泛用于摄影、电池和半导体行业,由于银的抗菌特性,银复合物在很多医疗行业中也具有广泛的应用,如制药抗菌、抗艾滋病病毒制剂、植入假体和水消毒等,然而银的广泛应用导致环境中银的含量逐年增加。虽然只有一小部分是生物可利用的,然而研究发现银在皮肤、肝脏、肾脏中的积累可能导致银中毒。世界卫生组织(WHO)规定,人体中Ag+的标准安全浓度低于0.05ppm,美国环境保护署(EPA)批准认证银作为杀虫剂和限制排放可溶性银的浓度为5ppm,因此开发在环境和生物样品中Ag+有效的检测方法非常重要。
检测Ag+的传统方法包括电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和火焰原子吸收光谱法(FAAS),虽然这些方法检测效率较高,但是需要复杂的样品前处理流程,并且所用仪器比较昂贵,不适于普遍应用。近年来,报道了一种对Ag+具有高亲和性的DNA片段,Ag+能够特异性的结合两段DNA序列中的胞嘧啶碱基,从而形成C-Ag+-C碱基错配结构。
G-四联体(G-quadruplex)是由具有连续G序列的DNA或RNA形成的一种特殊的核酸二级结构。研究发现:对于一些G-四联体而言,当与氯化血红素(hemin)作用时,可极大地增强hemin的酶活性,因此可被开发成为一类有效的DNA酶。利用该DNA酶,可设计开发高灵敏度、高选择性的生物检测方法。
本发明是借助于C-Ag+-C碱基错配作用将与一条适配体链结合的 G-四联体DNA引入错配结构中,通过添加hemin形成类似于辣根过氧化物酶(HRP)活性的G-四联体-hemin复合物,这种复合物可以催化鲁米诺试剂产生化学发光,Ag+浓度越高形成的G-四联体-hemin复合物越多,化学发光信号强度越强,通过建立Ag+浓度和化学发光信号强度之间的标准曲线,从而实现对Ag+的检测。
发明内容
要解决的技术问题:由于传统仪器检测方法设备昂贵,样品前处理复杂并且耗时长,不适于大量样品的检测,限制此类方法的普遍应用。
技术方案:本发明公开了一种基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法,包括如下具体步骤:
(1)贵金属纳米粒子修饰Ag+适配体的一条链
将新合成的贵金属纳米粒子在10000r/min的转速下离心浓缩10倍,然后用pH7.40.01M的磷酸盐缓冲液将其重悬,取200μL浓缩好的贵金属纳米粒子,加入20μL浓度为10μM的适配体DNA1,使DNA1的终浓度为1μM,在室温条件下孵育过夜,然后将孵育好的纳米粒子在10000r/min的转速下离心去除游离的DNA1,再用1mL pH7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液将纳米粒子进行重悬使其稀释5倍,从而得到修饰Ag+适配体一条链的纳米粒子探针。
适配体DNA1:5’-SH-AAAAACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’。
(2)两条适配体捕获Ag+形成纳米粒子-适配体-Ag+-G-四联体DNA的复合结构
将步骤(1)中制备好的纳米粒子探针分装到PCR管中,每管100μL,首先向每管中加入浓度为1ng mL-1、5ng mL-1、10ng mL-1、20ng mL-1、50ng mL-1、100ng mL-1、200ng mL-1的Ag+,然后再分别加入5μL浓度为10μM的适配体DNA3,使其终浓度为500nM,于室温条件下反应3h后,在10000r/min的转速下对其进行离心以除去未反应的适配体DNA3,DNA3由适配体DNA2和G-四联体DNA通过5个腺嘌呤核苷酸组成的序列连接而成。
适配体DNA2:5’-CACACACACACACACACACAC-3’,
G四联体DNA:5’-ATACCAGCTTATTCAATTAAAAATAAAGGGTAGGGCGGG
TTGGGTAAAT-3’,
DNA3:5’-CACACACACACACACACACAC-AAAAA-ATACCAGCTTATTCAAT
TAAAAATAAAGGGTAGGGCGGGTTGGGTAAAT-3’。
(3)G-四联体-氯化血红素复合物的形成以及化学发光信号的测定
向步骤(2)中制备好的每管复合物中加入氯化血红素10μL,终浓度为500nM,在室温条件下孵育20min后,加入100μL鲁米诺试剂,在避光条件下反应10-30min后,测定每管中化学发光强度,从而建立Ag+浓度与化学发光强度之间的对应关系,并建立在一定Ag+浓度范围内Ag+浓度和化学发光强度的标准曲线。
本发明所述的基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法中所用的贵金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子。
本发明所述的基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法中贵金属纳米粒子的粒径为20nm。
本发明所述的基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法中鲁米诺试剂由鲁米诺储备液和H2O2溶液组成,鲁米诺储备液:称取80mg鲁米诺加入到5mL 10mol/L的NaOH溶液中,然后加入超纯水将其定容到50mL,H2O2溶液的浓度为1mM,使用前将两者按照1:1的体积比混合。
本发明所述的基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法步骤(3)中加入鲁米诺试剂后在避光条件下反应时间为25min。
本发明所述的20nm的金纳米粒子通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法进行合成,合成步骤:将三口瓶用王水浸泡过夜,然后用超纯水清洗干净,在洁净的三口瓶中加入191mL的超纯水,再加入5mL质量浓度为0.4%的氯金酸,磁力搅拌并加热沸腾,7-8min后加入4 mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠,溶液从无色变为红色后停止加热,继续搅拌15min,即得到20nm金纳米粒子。
本发明所述的20nm的银纳米粒子通过抗坏血酸还原硝酸银的方法进行合成,合成步骤:取 20 mL 超纯水与 10 mL 质量分数 1% 的聚乙烯吡咯烷酮混合,再加入 0.5 mL0.01mol/L 的硼氢化钠水溶液,并进行冰浴保护。然后,将6 mL 质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液和6mL质量分数为0.15%的硝酸银水溶液同时以30mL/h的速度用注射泵加入到上述溶液中,边搅拌边加入,待加入结束后,继续搅拌10 min,即得到20 nm银纳米粒子。
有益效果:本发明提供了一种基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法,借助于C-Ag+-C碱基错配作用将与一条适配体链结合的 G-四联体DNA引入错配结构中,通过添加hemin形成类似于辣根过氧化物酶活性的G-四联体-hemin复合物,这种复合物可以催化鲁米诺试剂产生化学发光,并且化学发光强度随着Ag+浓度的增加而增强,根据Ag+浓度和化学发光信号强度之间的对应关系,从而间接检测目标Ag+的含量。
附图说明
图1 Ag+检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
一种基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法,包括如下具体步骤:
(1)金纳米粒子修饰Ag+适配体的一条链
将新合成的20nm金纳米粒子在10000r/min的转速下离心浓缩10倍,然后用pH7.40.01M的磷酸盐缓冲液将其重悬,取200μL浓缩好的贵金属纳米粒子,加入20μL浓度为10μM的适配体DNA1,使DNA1的终浓度为1μM,在室温条件下孵育过夜,然后将孵育好的纳米粒子在10000r/min的转速下离心去除游离的DNA1,再用1mL pH7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液将纳米粒子进行重悬使其稀释5倍,从而得到修饰Ag+适配体一条链的纳米粒子探针。
适配体DNA1:5’-SH-AAAAACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’。
(2)两条适配体捕获Ag+形成纳米粒子-适配体-Ag+-G-四联体DNA的复合结构
将步骤(1)中制备好的纳米粒子探针分装到PCR管中,每管100μL,首先向每管中加入浓度为1ng mL-1、5ng mL-1、10ng mL-1、20ng mL-1、50ng mL-1、100ng mL-1、200ng mL-1的Ag+,然后再分别加入5μL浓度为10μM的适配体DNA3,使其终浓度为500nM,于室温条件下反应3h后,在10000r/min的转速下对其进行离心以除去未反应的适配体DNA3,DNA3由适配体DNA2和G-四联体DNA通过5个腺嘌呤核苷酸组成的序列连接而成。
适配体DNA2:5’-CACACACACACACACACACAC-3’,
G四联体DNA:5’-ATACCAGCTTATTCAATTAAAAATAAAGGGTAGGGCGGG
TTGGGTAAAT-3’,
DNA3:5’-CACACACACACACACACACAC-AAAAA-ATACCAGCTTATTCAAT
TAAAAATAAAGGGTAGGGCGGGTTGGGTAAAT-3’。
(3)检测灵敏度研究
向步骤(2)中制备好的每管复合物中加入Hemin10μL,终浓度为500nM,在室温条件下孵育20min后,加入100μL鲁米诺试剂,在避光条件下反应15min后,测定每管中化学发光强度,以Ag+浓度为横坐标,化学发光强度为纵坐标,建立标准曲线,并且计算得出检测限为0.5ngmL-1。
(4)特异性研究
用此方法测定其它四种重金属离子(Hg2+、Mg2+、Cu2+、Pb2+)化学发光信号的强度分析此方法的特异性。在5ng mL-1的检测浓度下,四种重金属离子均没有出现化学发光信号,从而说明抗Ag+的适配体没有识别这几种重金属离子,
因此,此方法对Ag+检测的特异性较高。
(5)添加回收实验
在含有1ng mL-1 Ag+的饮用水中,测定了添加不同浓度Ag+后的添加回收结果,在1.5、2.0、2.3、3.2和4.0ng mL-1的添加浓度下,Ag+的回收率在96.8%-99.3%范围内,回收结果表明此方法可以用于实际水样品中的Ag+含量检测。
Claims (5)
1.一种基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法,其特征在于包括如下具体步骤:
(1)贵金属纳米粒子修饰Ag+适配体的一条链
将新合成的贵金属纳米粒子在10000r/min的转速下离心浓缩10倍,然后用pH7.40.01M的磷酸盐缓冲液将其重悬,取200μL浓缩好的贵金属纳米粒子,加入20μL浓度为10μM的适配体DNA1,使DNA1的终浓度为1μM,在室温条件下孵育过夜,然后将孵育好的纳米粒子在10000r/min的转速下离心去除游离的DNA1,再用1mL pH7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液将纳米粒子进行重悬使其稀释5倍,从而得到修饰Ag+适配体一条链的纳米粒子探针;
适配体DNA1:5’-SH-AAAAACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’;
(2)两条适配体捕获Ag+形成纳米粒子-适配体-Ag+-G-四联体DNA的复合结构
将步骤(1)中制备好的纳米粒子探针分装到PCR管中,每管100μL,首先向每管中加入浓度为1ng mL-1、5ng mL-1、10ng mL-1、20ng mL-1、50ng mL-1、100ng mL-1、200ng mL-1的Ag+,然后再分别加入5μL浓度为10μM的适配体DNA3,使其终浓度为500nM,于室温条件下反应3h后,在10000r/min的转速下对其进行离心以除去未反应的适配体DNA3,DNA3由适配体DNA2和G-四联体DNA通过5个腺嘌呤核苷酸组成的序列连接而成;
适配体DNA2:5’-CACACACACACACACACACAC-3’;
G四联体DNA:5’-ATACCAGCTTATTCAATTAAAAATAAAGGGTAGGGCGGG
TTGGGTAAAT-3’;
DNA3:5’-CACACACACACACACACACAC-AAAAA-ATACCAGCTTATTCAAT
TAAAAATAAAGGGTAGGGCGGGTTGGGTAAAT-3’;
(3)G-四联体-氯化血红素复合物的形成以及化学发光信号的测定
向步骤(2)中制备好的每管复合物中加入氯化血红素10μL,终浓度为500nM,在室温条件下孵育20min后,加入100μL鲁米诺试剂,在避光条件下反应10-30min后,测定每管中化学发光强度,从而建立Ag+浓度与化学发光强度之间的对应关系,并建立在一定Ag+浓度范围内Ag+浓度和化学发光强度的标准曲线。
2.根据权利要求1所述的一种基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法,其特征在于所述的贵金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的一种基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法,其特征在于所述的贵金属纳米粒子的粒径为20nm。
4.根据权利要求1所述的一种基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法,其特征在于所述的鲁米诺试剂由鲁米诺储备液和H2O2溶液组成,鲁米诺储备液:称取80mg鲁米诺加入到5mL 10mol/L的NaOH溶液中,然后加入超纯水将其定容到50mL,H2O2溶液的浓度为1mM,使用前将两者按照1:1的体积比混合。
5.根据权利要求1所述的一种基于适配体测定Ag+的化学发光传感器的检测方法,其特征在于所述的步骤(3)中加入鲁米诺试剂后在避光条件下反应时间为25min。
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