CN109402128A

CN109402128A - 黄曲霉毒素b1的核酸适配体、含有该核酸适配体的黄曲霉毒素b1检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN109402128A
Application number: CN201811571669.0A
Authority: CN
Inventors: 吴薇; 杨庆利; 周勐; 刘洋
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Guangzhou laidemang Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: CN109402128B

Abstract

本发明公开了一种黄曲霉毒素B₁的核酸适配体、含有该核酸适配体的黄曲霉毒素B₁检测试剂盒及检测方法，本发明的黄曲霉毒素B₁的核酸适配体为Aptamer A和Aptamer C；所述Aptamer A和Aptamer C的序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。其中AptamerC用于纯化，Aptamer A作为等温扩增的模板，最后扩增得到的单链核酸用核酸试纸条进行快速检测。本发明方法具有操作简便，无需对待测样品进行复杂的前处理，检测成本低，检测结果肉眼可见，无需借助仪器，结果准确可靠，免去了靶标富集，但同时实现等温核酸扩增，有利于实现黄曲霉毒素的定性和定量分析。

Description

黄曲霉毒素B1的核酸适配体、含有该核酸适配体的黄曲霉毒素 B1检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于有害物质检测技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B₁的核酸适配体、含有该核酸适配体的黄曲霉毒素B₁检测试剂盒及检测方法。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是黄曲霉和寄生曲霉在生长过程中产生的次级代谢产物，是一类毒性极强的物质，具有强致癌性和强免疫抑制性，广泛分布在发霉粮食及制品中，特别是花生、花生油及其制品。AFT侵染花生而引起的花生霉变在世界各地均存在，是困扰花生及花生制品整体质量的世界性顽疾，给不少花生加工出口企业造成重大经济损失。如何有效控制、去除黄曲霉毒素是所有花生加工出口企业面临的难题。为保证粮油食品的安全，在预防为主的基础上，应加强食品卫生监测，限制黄曲霉毒素在食品中的含量。GB2761-2005 《食品中真菌毒素限量》规定了花生及其制品中黄曲霉毒素B1≤20μg/kg。黄曲霉毒素B₁含量超过国家标准规定的粮油食品，必须进行去毒处理。

食品中黄曲霉毒素的量在1mg/kg上就有剧毒，其毒性是氰化钾的10倍，为砒霜的68 倍。黄曲霉毒素是公认的致癌性最强的物质之一。它广泛存在于食品中，对其进行有效的分离，控制含量在允许范围内至关重要。现在已有法规严格规定食品中黄曲霉毒素的限量。目前，测定黄曲霉毒素的方法有荧光法、色谱法、酶联免疫吸附法、免疫亲和柱法等。荧光分析方法灵敏快速，但是不稳定且很难区分出黄曲霉毒素和其他衍生物。色谱法目前应用最广，但耗时较长且需要进行样品前处理，其步骤繁琐，难以大规模使用及满足现场检测要求。免疫学检测方法简单、快速、成本低且可进行大规模筛选，然而该类方法均建立在抗原和抗体特异性结合的基础之上，黄曲霉毒素全抗原及抗体均为蛋白质分子，在高温、强酸、强碱等极端检测环境下极易失活变性。因此，迫切需要在此领域开展深入的研究工作，建立快速、有效的方法分离和检测食品中的黄曲霉素。

核酸适配体(aptamer)是一类新型的识别分子，其分子量较低(15-50碱基)，没有免疫原性和毒性，它是指经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或者其他小分子物质的寡核苷酸片段。它与抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。由于它的易合成、易储存和易修饰等优点，在诊断治疗、药物分子设计及分析检测中具有广泛的应用前景。如果将核酸适配体与磁珠相连，则可以简单快速地将配体分离出来进行检测，无需复杂的离心或者纯化过程，操作快速。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的第一个目的在于提供黄曲霉毒素B₁的核酸适配体；本发明的第二个目的在于提供黄曲霉毒素B₁核酸适配体的应用；本发明的第三个目的在于提供含有上述黄曲霉毒素B₁核酸适配体的用于检测黄曲霉毒素B₁的试剂盒；本发明第四个目的在于提供快速检测黄曲霉毒素B₁的方法；以解决现有检测黄曲霉毒素B₁技术中存在的灵敏度低、检测方法繁琐、仪器设备要求高等问题。

为了达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：

黄曲霉毒素B₁的核酸适配体，所述核酸适配体为Aptamer A和Aptamer C；所述Aptamer A和Aptamer C的序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

上述述黄曲霉毒素B₁的核酸适配体在黄曲霉毒素B₁检测中的应用。

上述黄曲霉毒素B₁的核酸适配体在制备黄曲霉毒素B₁检测试剂中的应用。

一种快速检测黄曲霉毒素B₁的试剂盒，包含上述黄曲霉毒素B₁的核酸适配体Aptamer A 和Aptamer C。

在上述方案的基础上，所述Aptamer A的3’端连接有等温扩增引物序列及切刻酶识别位点，Aptamer C的一端修饰有分离标记物。

在上述方案的基础上，所述切刻酶识别位点设计在Aptamer A的3’端和等温扩增引物序列之间；所述等温扩增引物序列为5’-ATGAAGAACAACGGCT-3’。

在上述方案的基础上，所述检测黄曲霉毒素B₁的试剂盒，还包含等温扩增反应体系和用于检测扩增产物单链核酸的核酸试纸条。

在上述方案的基础上，所述等温扩增反应体系包含：切刻酶、等温聚合酶、扩增缓冲液、 dNTPs、扩增引物；

所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

一种检测在上述方案的基础上，的方法，步骤为：

1)核酸适配体杂交：向样品溶液中加入Aptamer A和Aptamer C，室温孵育20min；

其中，所述Aptamer A的3’端连接有等温扩增引物序列及切刻酶识别位点，Aptamer C 的一端修饰有分离标记物；所述切刻酶识别位点设计在Aptamer A的3’端和等温扩增引物序列之间；所述等温扩增引物序列为5’-ATGAAGAACAACGGCT-3’；当有黄曲霉毒素B₁存在时，Aptamer A和Aptamer C与黄曲霉毒素B₁结合，形成黄曲霉毒素B₁-Aptamer AC复合物；

所述核酸适配体A和核酸适配体C的序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2 所示；

2)分离纯化：向1)中的混合液中加入带有特异性标记的磁珠，该特异性标记能够与 Aptamer C分离标记物特异性的作用；将混合液中的黄曲霉毒素B₁-Aptamer AC复合物通过沉淀方式分离出来；

3)等温扩增：用去离子水重悬上述沉淀，其后加入扩增缓冲液、切刻酶、等温聚合酶、 dNTPs和扩增引物，进行等温扩增；所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.3所示；

4)检测：检测步骤3)扩增得到的单链核酸的量，确定待检测黄曲霉毒素的浓度。

在上述方案的基础上，所述检测黄曲霉毒素B₁的方法，所述步骤4)中，单链核酸的量的检测方法采用胶体金核酸试纸条。

在上述方案的基础上，所述胶体金核酸试纸条上标金核酸序列如SEQ ID NO.4所示，C 线核酸序列如SEQ ID NO.5所示，T线核酸如SEQ ID NO.6所示。

作为本发明的进一步改进，等温扩增反应体系中的等温扩增酶为无外切核酸酶活性的等温DNA聚合酶。

切刻酶可特异性识别并切割其识别位点，可以使用的切刻酶包括但不限于Nt.BstNBI、 Nb.BtsI、Nb.BsmI、Nb.BbvCI、Nt.BsmAI。

所述分离标记选自特异性小分子标记、固相载体，特异性小分子包括但不限于生物素 (Biotin)、地高辛(Digoxin)、荧光分子等，固相载体可以是磁珠、微球、微孔板、量子点等。

为保证检测效果，适配体上连接的等温扩增引物序列的互补引物序列与核酸适配体无互补片段。

等温扩增为一种类似于PCR的扩增技术，但其引物的引入采用酶切及链置换实现，而不需要进行温度的梯度循环变化。其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA等温聚合酶、一对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。普通的等温扩增均采用内外两条引物的方式，产生的是双链DNA。本发明采用的是单向等温扩增，用的是单引物法，最终形成的是单链DNA产物，该产物能配合胶体金层析试纸进行快速检测。

因为5’→3’外切核酸酶活性能使引物-靶核酸杂交链的5’端降解，而3’→5’外切核酸酶活性则能降解单链引物和最终的扩增产物。因此，为了取得更好的检测效果，本发明所使用的扩增酶为无外切核酸酶活性均缺乏的等温DNA聚合酶。具有这种特性的扩增酶有Klenow片段(3’→5’exo-)，T7DNA聚合酶和phi29DNA聚合酶等。

本发明的有益效果是：

本发明的黄曲霉毒素B₁核酸适配体中，Aptamer C用于纯化，Aptamer A作为等温扩增的模板，最后扩增得到的单链核酸用核酸试纸条进行快速检测。

本发明方法具有操作简便，无需对待测样本进行复杂的前处理；检测成本低，对检测仪器的要求低，结果可肉眼观察，特别适用于基层及偏远地区使用。

特别的，当本发明用于食品中黄曲霉毒素B₁检测时，免去了食品的前处理及靶标提纯，但同时实现核酸扩增，有利于实现对黄曲霉毒素B₁的定性和定量分析。

本发明黄曲霉毒素B₁的检测方法适用于水溶性强的食品中黄曲霉毒素B₁的检测，比如花生、花生粉、玉米粉；不适用于花生油、玉米油等油性强的物质中黄曲霉毒素B₁的检测。

附图说明

图1是本发明方法的检测原理示意图；

图2是不同浓度黄曲霉毒素B₁的检测结果；

图3是不同真菌毒素的检测结果图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例

本发明利用两种核酸适配体，两种适配体都作用于黄曲霉毒素B1，一种用于纯化分离黄曲霉毒素B1，另一种作为等温扩增的模板以便进行扩增，最后对扩增得到的单链核酸进行快速检测。

下面结合附图，进一步说明本发明的检测原理。

参照图1，扩增核酸适配体Aptamer A的序列从5’-3’依次为特异性aptamer识别序列、切刻酶识别位点和引物结合位点；捕获核酸适配体Aptamer C上修饰有特异性分离基团Biotin 生物素；Aptamer A和Aptamer C与样品混合后，特异性结合在待检物黄曲霉毒素B1上；将混合后的样品与修饰后的SA磁珠混合，借助Aptamer C上分离基团与磁珠上基团之间的特异亲和作用，将待检黄曲霉毒素B₁富集在磁珠上；分离磁珠洗脱核酸适配体，加入等温扩增反应体系，在引物的作用下，对Aptamer A进行等温扩增；切刻酶识别切割位点，将扩增的新DNA链切割，切割得到的单链DNA核酸缺乏引物序列，无法被进一步扩增，在反应体系中累积，得到大量的单链DNA核酸。这些单链DNA核酸可进一步通过成熟的核酸试纸条进行检测。

本实施例中所使用的序列如下：

表1本实施例所用序列

注：其中下划线标出的为切刻酶识别位点。

上述序列均由上海生工直接合成。

1、核酸试纸条的制备

1)胶体金的制备

a)在500mL洁净的圆底烧瓶中加入300mL的超纯水，再加入1％的氯金酸溶液3 mL，使氯金酸的终浓度为0.01％，边搅拌边加热至沸腾。

b)新鲜配制1％的柠檬酸三钠溶液，取12mL加入到上述沸腾的氯金酸溶液中。

c)继续加热溶液沸腾，溶液的颜色会从淡黄色转变为黑色再转变成酒红色，这个时间大约为 20秒到40秒，继续加热搅拌约10分钟，此时溶液变成均匀透亮的酒红色。

d)停止加热，但要继续搅拌，使金纳米颗粒逐渐冷却至室温，然后4℃保存备用。

制备好的金纳米颗粒用紫外可见分光光度计进行扫描，其吸收光谱在520nm有一个最大吸收峰，其对应的金颗粒的直径大约在15nm左右。整个吸收光谱没有杂峰，半峰宽窄，说明制备的金纳米颗粒粒径均匀，适合后续标记使用。

2)金标核酸的制备

a)取10倍浓缩的金纳米颗粒900μL，加入100μL超纯水溶解的巯基修饰的DNA(标金核酸)，充分混匀，4℃反应24小时。

b)用10％的BSA进行封闭，逐滴加入10％的BSA约100μL，边加边震荡，使BSA的终浓度为1％，充分混匀，4℃封闭4小时。

c)加入1.5M的NaCl溶液和1％的SDS溶液，缓慢滴加，边加边震荡，使NaCl的终浓度为150nmol/L,SDS的终浓度为0.01％，充分混匀，4℃老化24小时。

d)4℃离心，12000rpm，20分钟，弃上清。沉淀用金重悬液重悬，重复离心2-3次，弃上清，留沉淀。用1mL金重悬液重悬核酸-金标记物沉淀，4℃保存备用。

3)样品垫的处理

玻璃纤维浸泡含有pH9.0，4％Triton X-100,100mM硼酸、3％PEG4000、1％BSA、2％蔗糖、0.1％SDS，50nM竞争DNA探针，0.5μg/mL鲑鱼精DNA的溶液后，37℃烘干备用。

4)金标垫处理

将本发明制备的金标核酸序列涂于玻璃纤维上，37℃干燥2小时，制成金标垫备用。

5)硝酸纤维素膜上质控线和检测线的处理

用32μL去离子水溶解1OD的核酸序列5，使其终浓度为100μM；取15μL 100μM的核算序列5，加入15μL(1mg/mL)链霉亲和素，室温下反应2小时候，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜质控线上，37℃干燥两小时。

6)胶体金试纸条的组装

将固定有寡核苷酸探针的硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探针的玻璃纤维、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后即得到本发明所述的核酸试纸条传感器。

上述核酸快速检测试纸条的制备方法仅为示例性说明，本领域的技术人员亦可以采用其他公知方法制备得到。

2、样品检测

1)样品预处理：将食品样本用匀浆器研磨(液体样品无需此步骤)，准确称取1g或者 1mL样本，用8mL磷酸缓冲液PBS稀释，再用滤纸过滤。

2)核酸适配体杂交：将两种核酸适配体分别用PBS溶解成100μM后，稀释到1μM浓度，取20μL加入到1mL上述过滤的溶液中，室温孵育20min。

3)黄曲霉毒素B₁分离纯化：首先用EDC法将链霉亲和素与羧基化的磁珠进行偶联，清洗后用于下一步反应；

4)向2)中的混合液中加入链霉亲和素偶联的磁珠，置于磁架上静置3min，其后吸取并弃上清，再用PBS重悬和清洗3次。

5)Aptamer A的等温扩增：用10μL去离子水重悬上述沉淀，其后加入10x扩增缓冲液，最终体系含有1U Nb.BsmI,5U Klenow exo-聚合酶，50μM dNTPs，1μM引物，并调整到20μL。该体系置于50℃水浴锅反应15min。

6)产物检测：上述扩增产物用40μL的4×SSC缓冲液稀释后加到核酸检测卡样品垫上， 5min后读取检测结果。结果显示该方法能检测到10μg/mL的黄曲霉毒素B₁(图2)，且与其他真菌毒素无交叉，具有很好的特异性和灵敏度(图3)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。本领域的技术人员可以将其应用于其他分子、细胞、微生物的检测。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 黄曲霉毒素B1的核酸适配体、含有该核酸适配体的黄曲霉毒素B1检测试剂盒及检测方法

<130> 2018

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(aptamer of aflatoxin B1)

<400> 1

taacacgaga cactgctaga gattttccac atttctcttg ttcc 44

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(aptamer of aflatoxin B1)

<400> 2

aaaaaaaaaa gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgccctcgct aggcccaca 59

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(aptamer of aflatoxin B1)

<400> 3

agccgttgtt cttcat 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(aptamer of aflatoxin B1)

<400> 4

acatttctct tgttcc 16

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(aptamer of aflatoxin B1)

<400> 5

ggaacaagag aaatgtggaa caagagaaat gt 32

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(aptamer of aflatoxin B1)

<400> 6

taacacgaga cactgtaaca cgagacactg 30

Claims

1.黄曲霉毒素B₁的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体为Aptamer A和AptamerC；所述Aptamer A和Aptamer C的序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述黄曲霉毒素B₁的核酸适配体在黄曲霉毒素B₁检测中的应用。

3.权利要求1所述黄曲霉毒素B₁的核酸适配体在制备黄曲霉毒素B₁检测试剂中的应用。

4.一种快速检测黄曲霉毒素B₁的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述黄曲霉毒素B₁的核酸适配体Aptamer A和Aptamer C。

5.根据权利要求4所述快速检测黄曲霉毒素B₁的试剂盒，其特征在于：所述Aptamer A的3’端连接有等温扩增引物序列及切刻酶识别位点，Aptamer C的一端修饰有分离标记物。

6.根据权利要求5所述快速检测黄曲霉毒素B₁的试剂盒，其特征在于：所述切刻酶识别位点设计在Aptamer A的3’端和等温扩增引物序列之间；所述等温扩增引物序列为5’-ATGAAGAACAACGGCT-3’。

7.根据权利要求4～6任一项所述检测黄曲霉毒素B₁的试剂盒，其特征在于：还包含等温扩增反应体系和用于检测扩增产物单链核酸的核酸试纸条。

8.根据权利要求7所述检测黄曲霉毒素B₁的试剂盒，其特征在于：所述等温扩增反应体系包含：切刻酶、等温聚合酶、扩增缓冲液、dNTPs、扩增引物；

所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

9.一种检测黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于：步骤为：

其中，所述Aptamer A的3’端连接有等温扩增引物序列及切刻酶识别位点，Aptamer C的一端修饰有分离标记物；所述切刻酶识别位点设计在Aptamer A的3’端和等温扩增引物序列之间；所述等温扩增引物序列为5’-ATGAAGAACAACGGCT-3’；当有黄曲霉毒素B₁存在时，Aptamer A和Aptamer C与黄曲霉毒素B₁结合，形成黄曲霉毒素B₁-Aptamer AC复合物；

所述核酸适配体A和核酸适配体C的序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

2)分离纯化：向1)中的混合液中加入带有特异性标记的磁珠，该特异性标记能够与Aptamer C分离标记物特异性的作用；将混合液中的黄曲霉毒素B₁-Aptamer AC复合物通过沉淀方式分离出来；

3)等温扩增：用去离子水重悬上述沉淀，其后加入扩增缓冲液、切刻酶、等温聚合酶、dNTPs和扩增引物，进行等温扩增；所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.3所示；

10.根据权利要求9所述检测黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于：所述步骤4)中，单链核酸的量的检测方法采用胶体金核酸试纸条。