CN102796826A - 快速检测皮革真实属性的试剂盒及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测皮革真实属性的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括DNA提取缓冲液、Taq DNA聚合酶、PCR反应液、上样缓冲液。本发明从遗传学角度对皮革样品基因成分进行分析鉴别，克服了传统的感官鉴别方法所面临的难题，具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点，弥补了当前皮革基因检测方法的空白，为皮革种类的鉴定提供了一种精确且易于标准化的分析方法，为质量监督等提供了技术支持，可广泛应用于皮革包括毛皮等样品基因的提取、皮革品种鉴定等方面，具有良好的经济社会效益与重大的推广应用价值，对于有效监管皮革产品质量，保护广大消费者利益具有重大意义。

Description

快速检测皮革真实属性的试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测皮革真实属性的试剂盒及其方法。

背景技术

PCR是聚合酶链式反应的简称，是分子生物学中广泛运用的一项技术，主要原理是通过热循环，达到目的基因片段的大量扩增。目前这项技术越来越广泛地运用于产品检测之中。例如，运用PCR技术检测牛奶或腊肠中的植物成分等，运用PCR技术检测肉骨粉等产品中的动物源性成分等，运用PCR技术检测食品中的转基因成分等。

皮革主要是由哺乳类动物毛皮加工而成，是我国重要的出口创汇产品。天然皮革按其动物来源种类分，主要有牛皮革、羊皮革、猪皮革、马皮革、兔皮革等。由于天然皮革种类繁多，价格昂贵，一些不法商贩为了寻求利益的最大化，以人造革冒充天然皮革，或以低档皮革冒充高档皮革，损害了广大消费者的健康和利益，对社会经济以及皮革产业发展产生了不利的影响。

目前，国内外皮革材质的鉴别主要仍以手摸眼看的感官鉴定方法为主，随着皮革加工技术的提高，在某些方面，感官鉴别方法已很难鉴别出皮革种类，急需开发更为科学有效的方法。

发明内容

基于此，本发明提供了一种快速检测皮革真实属性的试剂盒及其检测方法。该试剂盒主要是依据不同种类皮革所承载的遗传信息存在差异，通过基因检测技术特异性地分析皮革样品中的DNA信息来区分皮革种类。

一种快速检测皮革真实属性的试剂盒，包括：

(1)DNA提取缓冲液

所述DNA提取缓冲液的组成为：15～25mg/L十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、90～110nmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、15～25mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA₂Na)、1.3～1.5mol/L氯化钠(NaCl)、0.09～0.12g/L蛋白酶K，0.9～1.1mol/L二硫苏糖醇(DTT)；

(2)Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的浓度为125IU；

(3)PCR反应液

所述PCR反应液的组成为：2.7～3.3mmol/L氯化镁，0.3～0.5μmol/L引物，0.3～0.5mmol/L的三磷酸脱氧核苷酸；

所述引物为针对动物源性基因序列的通用引物SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2；

(4)上样缓冲液

所述上样缓冲液的组成为：2.0～3.0g/L溴酚蓝、350～450g/L蔗糖。

在其中一些实施例中，所述引物还包括针对牛、羊、猪、马或兔的线粒体基因序列的引物。

在其中一个实施例中，所述针对牛线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

在其中一个实施例中，所述针对羊线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

在其中一个实施例中，所述针对猪线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

在其中一个实施例中，所述针对马线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。

在其中一个实施例中，所述针对兔线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

一种快速检测皮革真实属性的方法，采用上述试剂盒，包括以下步骤：

(1)制备样品DNA

剪取50cm²左右的经酒精浸泡消毒后的皮革样品，放入碎皮机中破碎，使用磷酸盐缓冲溶液在不断振荡的条件下浸泡皮革样品12～16小时，期间每隔2～3小时换一次溶液，以降低皮革试样中的盐离子如铬离子等的含量；浸泡后将皮革样品再次破碎，取3mL破碎的样品，加入2mL DNA提取缓冲液，混匀。将离心管置于65℃放置45～60min，不时摇动，使样品充分裂解；取出，加入1mL饱和氯化钠溶液，剧烈振荡3～5min，置于0℃下放置5～10min，离心；取上清，用体积比为25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液进行提取，离心；取上清，用体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合液进行提取，离心；取上清，加入异丙醇沉淀核酸，-20℃放置2～4小时，使得异丙醇与核酸充分反应，高速离心，获得DNA沉淀；再用70％的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA；

(2)PCR扩增反应

取PCR反应液、Taq DNA聚合酶置于反应管中，混匀，加入样品DNA，离心后置于扩增仪上进行扩增，反应参数：95℃预变性5min后，按94℃30sec，55℃45sec，72℃60sec程序进行40个循环，最后72℃延伸10min，于4℃结束反应。

(3)产物检测

反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化己锭染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳，结束后，置紫外灯下观察，出现目标特异性条带的为含有某物种基因成分，否则为不含该物种基因成分。

皮革制品一般经过浸灰、软化、浸酸、鞣制等过程，这些过程直接影响到DNA的完整性，特别是在皮革鞣制过程中，皮革样品中的DNA损失严重。此外，皮革样品基质复杂，含有多种PCR抑制因素，如盐离子、色素等。考虑到皮革样品的特殊性，本发明中的皮革DNA提取方法采用磷酸盐缓冲液与皮革材料充分混合的方式降低盐离子及色素对DNA提取的干扰，利用DNA提取缓冲液裂解皮革组织，释放核酸。用苯酚、氯仿、异戊醇混合溶液除去溶液中的蛋白，最后用异丙醇在低温条件下使DNA沉淀，获得纯化的皮革样品DNA。在获得较高质量的皮革样品DNA后，筛选特异性引物对所提取皮革中的基因组分进行分析检测。首先采用本发明开发的试剂盒检测皮革中的动物内源基因成分，检测到动物内源基因后，再根据设计好的特异性的物种专一性基因扩增引物，具体鉴别是牛、羊、猪、马还是兔等物种的基因序列，并进行测序验证实验结果。

本发明针对皮革样品基质复杂，干扰因素多，且皮革样品中基因降解较为严重等问题，开发建立了高效的皮革DNA的提取方法，成功地从上百份不同类型的皮革样品中提取获得了较高质量的DNA。在改进并优化了从皮革样品DNA的提取到PCR检测一整个过程中的提取试剂与反应条件等关键控制性因素，开发建立了稳定性高、快速简便的一整套皮革真实属性的基因检测试剂盒。

本发明从遗传学角度对皮革样品基因成分进行分析鉴别，克服了传统的感官鉴别方法所面临的难题，具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点，弥补了当前皮革基因检测方法的空白，为皮革种类的鉴定提供了一种精确且易于标准化的分析方法，为质量监督等提供了技术支持，可广泛应用于皮革包括毛皮等样品基因的提取、皮革品种鉴定等方面，具有良好的经济社会效益与重大的推广应用价值，对于有效监管皮革产品质量，保护广大消费者利益具有重大意义。

附图说明

图1为实施例2的检测方法中所提取的部分皮革样品的DNA电泳图谱；其中，M：DNA Marker；泳道1～3：提取的牛皮革样品DNA；4～6：提取的羊皮革样品DNA；7～9：提取的猪皮革样品DNA；10～12：提取的马皮革样品DNA；13～16：提取的兔皮革样品DNA；

图2为实施例2的皮革样品中动物内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M：DNA Marker；P：阳性对照(牛肉DNA，稀释至50ng/μL)；CK：阴性对照；泳道1～2：提取的牛皮革样品DNA；3：提取的羊皮革样品DNA；4：提取的猪皮革样品DNA；5：提取的马皮革样品DNA；6：提取的兔皮革样品DNA；

图3为实施例2的牛皮革DNA样本中牛内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M：DNA Marker；P：阳性对照(牛肉DNA，稀释至50ng/μL)；CK：阴性对照；1～6：1～6号牛皮革DNA样本；

图4为实施例2的羊皮革DNA样本羊内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M：DNA Marker；P：阳性对照(羊肉DNA，稀释至50ng/μL)；CK：阴性对照；1～5：1～5号羊皮革DNA样本；

图5为实施例2的猪皮革DNA样本中猪内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M：DNA Marker；P：阳性对照(猪肉DNA，稀释至50ng/μL)；CK：阴性对照；1～5：1～5号猪皮革DNA样本；

图6为实施例2的不同种类皮革DNA样本中牛内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M：DNA Marker；P：阳性对照(牛肉DNA，稀释至50ng/μL)；CK：阴性对照；1～15：1～15号皮革DNA样本；

图7为实施例2的不同种类皮革DNA样本羊内源基因检测的PCR产物电泳图谱；其中，M：DNA Marker；P：阳性对照(羊肉DNA，稀释至50ng/μL)；CK：阴性对照；1～9：1～9号皮革DNA样本。

具体实施方式

以下结合具体实施例来详细说明本发明。

为防止提取过程中外源DNA的污染，我们采用无菌滤纸代替皮革样品作阴性对照，提取方法与皮革样品完全一致。

实施例1  快速检测皮革真实属性的试剂盒

包括以下成分(可供进行50份PCR反应)：

(1)DNA提取缓冲液(100mL)

分别称取2.00mg CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、1.21mg Tris.HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、0.58g EDTA₂Na(乙二胺四乙酸二钠)和8.18g NaCl于容量瓶中，用水定容至100mL，混匀。经过120℃、30min，高温消毒灭菌后，再加入10.00mg购置的蛋白酶K(购自大连宝生物公司)，15.43g二硫苏糖醇(DTT)。

(2)Taq DNA聚合酶(25μl)

购置Taq DNA聚合酶25μl共125IU(购自大连宝生物公司)。

(3)PCR反应液(1000μl)

首先制备引物，制备的引物浓度为100nmol/L。

按照本领域常规方法制备引物。在DNA自动合成仪(采用美国ABI公司的ABI3949型全自动DNA合成仪)上按照制造商的说明书进行合成。分别合成如下引物：

动物基因成分通用引物，正向：5’-cctgagaaacggctaccat-3’(SEQ ID NO.1)；

动物基因成分通用引物，反向：5’-cgtgtcaggattgggtaat-3’(SEQ ID NO.2)；

牛线粒体基因的正向引物：5’-gccatatactctccttggtgaca-3’(SEQ ID NO.3)；

牛线粒体基因的反向引物：5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’(SEQ ID NO.4)；

羊线粒体基因的正向引物：5’-tattaggcctcccccttgtt-3’(SEQ ID NO.5)；

羊线粒体基因的反向引物：5’-ccctgctcataagggaatagcc-3’(SEQ ID NO.6)；

猪线粒体基因的正向引物：5’-atgaaacattggagtagtcctactatttacc-3’(SEQ IDNO.7)；

猪线粒体基因的反向引物：5’-ctacgaggtctgttccgatataagg-3’(SEQ ID NO.8)；

马线粒体基因的正向引物：5’-ccctcaaacatttcatcatgatgaaa-3’(SEQ ID NO.9)；

马线粒体基因的反向引物：5’-gctcctcaaaaggatatttggcctca-3’(SEQ ID NO.10)；

兔内源基因的正向引物：5’-taatcgtcaccgcacatgcc-3’(SEQ ID NO.11)；

兔内源基因的反向引物：5’-ctatgtcaggagccccaattatca-3’(SEQ ID NO.12)；

称取0.285mg MgCl₂，用500μL水溶解，经过120℃、30min，高温消毒灭菌后，分别加入0.5μmol的一对引物和0.5mmol的三磷酸脱氧核苷酸，用水定容至1000μL。

(4)上样缓冲液(100μl)

分别称取2.5g溴酚蓝、400g蔗糖于容量瓶中，用水定容、混匀。

实施例2  利用实施例1的试剂盒检测皮革样品中的基因成分

检测方法包括以下步骤：

(1)样品DNA的制备

a皮革样品

剪取50cm²左右的经酒精浸泡消毒后的皮革样品，放入碎皮机中破碎。使用磷酸盐缓冲溶液在不断振荡的条件下浸泡碎皮革样品12小时，期间每隔2小时换一次缓冲溶液，以降低皮革试样中的色素及盐离子如铬离子等的含量。浸泡后将皮革样品再次破碎，取3mL破碎的样品，加入2mL DNA提取缓冲液，混匀。将离心管置于65℃放置45～60min，不时摇动，使样品充分裂解。取出，加入1mL饱和氯化钠溶液，剧烈振荡3～5min，置于0℃下放置5～10min，离心。取上清，用体积比为25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液进行提取，离心。取上清，用体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合液进行提取，离心。取上清，加入异丙醇沉淀核酸，-20℃放置2小时，使得异丙醇与核酸充分反应，高速离心，获得DNA沉淀。再用70％的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA。

为防止提取过程中外源DNA的污染，采用无菌滤纸代替皮革样品作阴性对照，提取方法与皮革样品完全一致。

b动物肉类(牛肉、羊肉、猪肉、马肉、兔肉)样品：分别将牛肉、羊肉、猪肉、马肉、兔肉等试验材料，使用经过120℃、30min高压消毒过的固体粉碎机或研钵粉碎制成粉样。

分别称取100mg研磨粉碎后的样品于离心管中，加入1mL试剂盒中的DNA提取缓冲液，混匀。将离心管置于65℃放置60min，不时摇动，使样品充分裂解。用体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合液进行提取，小心的混合两相，12000r/min离心5min。将上清液移至1.5mL离心管中，加入2倍体积预冷的异丙醇，充分混匀，12000r/min离心5min，获得DNA沉淀。再用70％的乙醇溶液洗沉淀物2次，室温离心12000r/min，5min收集DNA，尽可能除去乙醇。用100μl双蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，即得样品DNA，置于-20℃保存。

(2)检查DNA的纯度和含量

在石英比色皿中加入50μl按10倍稀释的DNA样品(5μl DNA样品加水45μl混匀)，分别测定DNA样品在260nm和280nm处的紫外光吸收值，并计算A₂₆₀/A₂₈₀值。A₂₆₀/A₂₈₀应介于1.7～1.9之间，低于1.7则表明制备物中存留显著蛋白质，应重新提取DNA；大于1.9则表明DNA样品中含有RNA，此时应加入RNA酶进行消化。

计算DNA浓度：10×A₂₆₀(μg/μl)。皮革样品DNA提取结果见表1。

表1.皮革样品DNA提取结果

由表1结果可知，所提取的23份有代表性的皮革样品中，皮革DNA的浓度范围大致在50～120ng/μL之间，A₂₆₀/A₂₈₀的比值范围在1.7～1.9之间，皮革DNA的质量满足PCR检测的要求。

图1为上述提取的23份皮革样品中的第1～16号皮革样品DNA的琼脂糖凝胶电泳图，由电泳图可知，所提取的皮革样品均可见总DNA条带。由于皮革的鞣制处理以及样品的长时间保存均会严重影响DNA的质量和产量，提取的皮革DNA存在一定程度的降解，在电泳图谱上出现弥散现象。由表1以及图1结果可知，所获得的皮革DNA质量较好，可满足PCR反应的要求。

(3)PCR扩增反应(根据检测基因类型选择扩增引物)

取PCR反应液954.0μl、Taq DNA聚合酶6.0μl于离心管中，混匀，按48.0μl每管分装到20支编好号的反应管(其中阳性对照、阴性对照均一个重复)中，向阳性对照管中加入2.0μl含有目的基因片段的DNA样品，向阴性对照管中加入2.0μl不含目的基因的对照样品DNA，向空白对照管中加入双蒸水，再向其余各反应管中加入2.0μl待分析的样品DNA(反应体系为50μl)，离心后置于PCR扩增仪上进行扩增。反应参数为：94℃预变性5min后，按94℃30sec，55℃45sec，72℃60sec程序进行40个循环，最后72℃延伸10min，于4℃结束反应。

(4)产物检测

取10.0μlPCR反应产物，加2.0μl上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNAMarker作为分子量标准，用含溴化己锭染色的1.5％琼脂糖凝胶(准确称取0.15g琼脂糖溶入100mL的1×TAE (0.04mol/L Tris-HCl，0.02mol/L NaAC，2mmol/LEDTA pH 8.0)中，置微波炉上加热并不时摇动至完全熔化，室温冷至50～60℃，加入1μL的10mg/mL EB立即摇匀，迅速倒入已用灭过菌的防水胶带封好口的电泳槽中，室温下放置30min以上，拔出梳子)3V/cm，电泳1h，结束电泳，置于紫外灯下观察，出现目标特异性条带的为含有某种类型基因成分，否则为不含某种类型基因成分。

(5)不同种类的皮革样品中动物内源基因检测

本实施例对所提取的不同种类的皮革样本DNA进行了动物内源基因检测，以牛肉DNA作为阳性对照，以不含动物基因成分的玉米DNA作为阴性对照。检测结果见附图2，由图2可知，阳性、阴性对照正常，说明检测结果的可靠性。在6份不同种类的皮革样品DNA可检测出特异性的137bp的动物内源基因成分。DNA片段经测序，测序结果与预期一致，为动物18S rRNA内源基因片段。结果说明实施例1的试剂盒的引物准确灵敏，可以特异性地检测目标核酸中的动物内源基因成分。

(6)牛皮革DNA样本中牛内源基因检测

本实施例对6份牛皮革DNA样本进行了牛内源基因检测，以牛肉DNA作为阳性对照，以玉米DNA作为阴性对照。检测结果见附图3，由图3可知，阳性、阴性对照正常，说明检测结果的可靠性。6份牛皮革样本DNA均可扩增出特异性的271bp牛内源基因片段。DNA片段经测序，测序结果与预期一致，为牛内源基因片段。上述结果说明，本实施例方法可以特异性的在牛皮革DNA样本中检测到牛内源基因成分，方法灵敏准确。

(7)羊皮革DNA样本羊内源基因检测

本实施例对5份羊皮革DNA样本进行了羊内源基因检测，以羊肉DNA作为阳性对照，以玉米DNA作为阴性对照。检测结果见附图4，由图4可知，阳性、阴性对照正常，说明检测结果的可靠性。5份羊皮革样本DNA均可扩增出特异性的294bp羊内源基因片段。DNA片段经测序，测序结果与预期一致，为羊内源基因片段。上述结果说明，本实施例方法可以特异性的在羊皮革DNA样本中检测到羊内源基因成分，方法灵敏准确。

(8)猪皮革DNA样本中猪内源基因检测

本实施例对5份猪皮革DNA样本进行了猪内源基因检测，以猪肉DNA作为阳性对照，以玉米DNA作为阴性对照。检测结果见附图5，由图5可知，阳性、阴性对照正常，说明检测结果的可靠性。5份猪皮革样本DNA均可扩增出特异性的149bp猪内源基因片段。DNA片段经测序，测序结果与预期一致，为猪内源基因片段。上述结果说明，本实施例方法可以特异性的在猪皮革DNA样本中检测到猪内源基因成分，方法灵敏准确。

(9)不同种类皮革DNA样本中牛内源基因检测

本实施例对15份随机抽取的不同种类的皮革DNA样本进行了牛内源基因检测，以检测本实施例方法在实际皮革样品种类鉴别中的应用效果。以牛肉DNA作为阳性对照，以玉米DNA作为阴性对照。检测结果见附图6，由图6可知，阳性、阴性对照正常，说明检测结果的可靠性。15份不同种类的皮革样本DNA有8份可检测出牛内源基因成分。DNA片段经测序，测序结果与预期一致，为牛内源基因片段。

检测结果说明，所分析的15份不同种类的皮革样品中有8份为牛皮革样品。

(9)不同种类皮革DNA样本羊内源基因检测

本实施例对随机抽取的9份不同种类的皮革DNA样本进行了羊内源基因检测，以检测本发明方法在实际皮革样品种类鉴别中的应用效果。以羊肉DNA作为阳性对照，以玉米DNA作为阴性对照。检测结果见附图7，由图7可知，阳性、阴性对照正常，说明检测结果的可靠性。9份不同种类的皮革样本DNA有5份可检测出羊内源基因成分。DNA片段经测序，测序结果与预期一致，为羊内源基因片段。

检测结果说明，所分析的9份不同种类的皮革样品中有5份为羊皮革样品。

实施例3  可靠性实验

针对皮革样品主要品种牛皮革、羊皮革、猪皮革检测，本实施例采用实时荧光PCR检测来验证实施例2方法的可靠性。

提取皮革样品DNA后，对皮革DNA样本开展实时荧光PCR检测实验。取PCR反应液948.0μl、Taq DNA聚合酶6.0μl、探针6.0μl于离心管中，混匀，按48.0μl每管分装到八联管中，向阳性对照管中加入2.0μl含有目的基因片段的DNA样品，向阴性对照管中加入2.0μl不含目的基因的对照样品DNA，向空白对照管中加入双蒸水，再向其余各反应管中加入2.0μl待分析的皮革样品DNA(反应体系为50μl)，离心后置于实时荧光定量PCR扩增仪上进行扩增。反应参数为：95℃预变性10min后，按95℃15sec，55℃30sec，72℃30sec程序进行45个循环。

所采用的荧光PCR引物与探针序列如下：(其中，FAM-羧基荧光素；TAMRA-淬灭基团羧基四甲基罗丹明；NFQ-非荧光淬灭基团)

动物内源基因成分荧光PCR引物，正向：5’-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3’(SEQ ID NO.13)；

动物内源基因成分荧光PCR引物，反向：5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’(SEQ ID NO.14)；

动物内源基因成分荧光PCR探针：5′-(FAM)TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)-3′(SEQ ID NO.15)；

牛内源基因成分荧光PCR引物，正向：5’-CCGATGGATGTTCAGAGCT-3’(SEQ ID NO.16)；

牛内源基因成分荧光PCR引物，反向：5’-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3’(SEQ ID NO.17)；

牛内源基因成分荧光PCR探针：5′-(FAM)TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-3′(SEQ ID NO.18)；

羊内源基因成分荧光PCR引物，正向：5’-ACACAACTTCTACCACAACCC-3’(SEQ ID NO.19)；

羊内源基因成分荧光PCR引物，反向：5’-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3’(SEQ ID NO.20)；

羊内源基因成分荧光PCR探针：5′-(FAM)ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA)-3′(SEQ IDNO.21)；

猪内源基因成分荧光PCR引物，正向：5’-TTTGTGCATGACTGCGTCAAC-3’(SEQ ID NO.22)；

猪内源基因成分荧光PCR引物，反向：5’-CTTGGTGGTCGTGGTCACTGT-3’(SEQ ID NO.23)；

猪内源基因成分荧光PCR探针：5′-(FAM)CACCGTCAAGCAGC-(NFQ)(MGB)-3′(SEQ ID NO.24)；

结果表明，实时荧光PCR检测结果与实施例2中PCR结果一致。

实施例4  灵敏度实验

本实施例将牛皮革DNA样本与羊皮革DNA样本按50∶50、30∶70、10∶90、5∶95、3∶97、1∶99体积比进行调配并充分混匀，按照实施例2方法进行PCR扩增。

检测结果表明，实施例1的试剂盒可检测到牛皮革DNA样本与羊皮革DNA样本掺比为50∶50、30∶70、10∶90、5∶95、3∶97的混合DNA样本中的牛内源基因，但不能检测到掺杂比率为1∶99的混合DNA样本，说明实施例1的试剂盒的检测低限为3％。

对羊皮革DNA样本、猪皮革DNA样本、马皮革DNA样本、兔皮革DNA样本也进行了灵敏度实验，方法同上，结果较为一致，检测底限为3％。

实施例5  重复性实验

本实施例对25份经国家皮革中心(广州)检测鉴定后的皮革样品开展了方法重复性实验。实验结果见表2。

表2.重复性实验中25份皮革样品的基因检测结果

结果表明，应用实施例1的试剂盒可以在25份不同种类的皮革样品中检测到动物内源基因，在不同种类的皮革样品中可检测到与各物种相对应的基因类型。以上结果重复3次实验，实验结果一致，说明实施例2方法重复性好。通过实验证明，实施例2方法可以在牛皮革样品中检测到牛内源基因成分，而不能检测到其他物种基因成分。在羊皮革样品中可检测到羊内源基因成分，而不能检测到其他物种基因成分。在猪皮革、马皮革、兔皮革样品中也得到了预期的实验结果。结果充分说明实施例2方法特异性好，适用于皮革真实属性的检测鉴别，方法具有良好的推广应用价值。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，包括：

(1)DNA提取缓冲液

所述DNA提取缓冲液的组成为：15～25mg/L CTAB、90～110nmol/L Tris-HCl、15～25mmol/L EDTA₂Na、1.3～1.5mol/L NaCl、0.09～0.12g/L蛋白酶K、0.9～1.1mol/L DTT；

(2)Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的浓度为125IU；

(3)PCR反应液

所述PCR反应液的组成为：2.7～3.3mmol/L MgCl₂，0.3～0.5μmol/L引物，0.3～0.5mmol/L dNTPs；

所述引物为针对动物源性基因序列的通用引物SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2；

(4)上样缓冲液

所述上样缓冲液的组成为：2.0～3.0g/L溴酚蓝、350～450g/L蔗糖。

2.根据权利要求1所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述引物还包括针对牛、羊、猪、马或兔的线粒体基因序列的引物。

3.根据权利要求2所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述针对牛线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

4.根据权利要求2所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述针对羊线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

5.根据权利要求2所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述针对猪线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

6.根据权利要求2所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述针对马线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。

7.根据权利要求2所述的快速检测皮革真实属性的试剂盒，其特征在于，所述针对兔线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

8.一种快速检测皮革真实属性的方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：

(1)制备样品DNA

剪取经酒精浸泡消毒的皮革样品，破碎，用磷酸盐缓冲溶液浸泡12～16小时，期间每隔2～3小时换一次溶液，浸泡后再次破碎；取样品，加入DNA提取缓冲液，混匀，65℃放置45～60min，不时摇动，加入饱和氯化钠溶液，剧烈振荡3～5min，0℃下放置5～10min；离心取上清，用体积比为25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液进行提取；离心取上清，用体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合液进行提取；离心取上清，加入异丙醇，-20℃放置2～4小时，高速离心，获得DNA沉淀，再用70％的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA；

(2)PCR扩增反应

取PCR反应液、Taq DNA聚合酶置于反应管中，混匀，加入样品DNA，离心后置于扩增仪上进行扩增，反应参数：95℃预变性5min后，按94℃30sec，55℃45sec，72℃60sec程序进行40个循环，最后72℃延伸10min，于4℃结束反应；

(3)产物检测

反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化己锭染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳，结束后，置于紫外灯下观察，出现目标特异性条带的为含有某物种基因成分，否则为不含该物种基因成分。

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