CN104328186A - 一种天然皮革的dna鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于荧光定量PCR检测猪皮革的特异性引物对和特异性探针及其检测方法，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明的方法可简便、快速的检测和鉴定猪皮革样品，设计的特异性引物对和特异性探针的特异性好，灵敏度佳，可检测到含量为1ng的猪皮革DNA。
Description
技术领域
本发明属于生物工程的技术领域，具体的说，是关于一种天然皮革的DNA鉴别方法。
背景技术
皮革制品的材质属性既是产品品质的重要因素，又与市场价格直接挂钩，因而关系到消费者的切身利益。按其来源可分为羊皮革、牛皮革、猪皮革、马皮革等，因其种类不同价格差异悬殊。市场上充斥着人造皮革假冒天然皮革，以次等的动物皮革冒充质优的动物皮革等现象，扰乱了市场的秩序，也损害了消费者的权益。目前天然皮革的主要还要是外观和嗅觉检测为主，有经验的操作人员根据天然皮革特有的气味，皮质的厚度，以前表面毛孔的排布确定皮革的种类。
随着皮革加工技术的不断发展，贴膜革、移膜革、压花革等新产品不断涌现，给不法分子以次充好创造了条件。猪皮革是最为常见、廉价的一种皮革，常被用来制成皮包、皮鞋、皮衣、沙发等家具，具有坚固耐用的特点。猪皮革也常加工修饰，用于冒充牛皮等价格较高的皮革制品，令人防不胜防。因此，有必要提供一种能够快速、准确地鉴别猪皮革的方法。
发明内容
本发明是一种基于DNA检测技术的猪皮革的定性鉴别方法，克服了现有的感官法和显微镜法准确性差的不足。
本发明的目的在于，提供一种用于荧光定量PCR检测猪皮革的特异性引物对和特异性探针。
本发明的另一目的在于，提供一种采用荧光定量PCR检测猪皮革的方法。
本发明的再一目的在于，提供一种猪皮革的检测试剂盒。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
作为本发明的第一方面，一种用于荧光定量PCR检测猪皮革的特异性引物对和特异性探针，其中，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
作为本发明的第二方面，一种采用荧光定量PCR检测猪皮革的方法，包括以下步骤：
步骤一、以猪皮革的DNA为模板，进行PCR扩增；
步骤二、检测扩增产物的荧光信号；
其中，用于PCR扩增的反应体系中含有特异性引物对和特异性探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
其中，所述PCR扩增的条件如下：
反应体系：2×Taqman Universal Master Mix10μl，DNA模板2μl，特异性引物终浓度为600nM，特异性探针终浓度为400nM，用水补足至20μl；
反应条件：95℃，10min；95℃，15s，60℃，45s，40个循环。
作为本发明的第三方面，一种猪皮革的检测试剂盒，含有以下试剂：
(a)特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
(b)特异性探针，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
其中，所述试剂盒还包括：
(c)标准参照物。
其中，所述标准参照物为猪皮革DNA，或含有猪皮革扩增目的片段的质粒DNA，或猪皮革。
作为本发明的第四方面，所述猪皮革的检测试剂盒可用于鉴定猪皮革。
本发明的有益效果：
1、可简便、快速的检测和鉴定猪皮革样品；
2、本发明基于猪线粒体12SrRNA基因的序列，设计的特异性引物和特异性探针的特异性好；
3、检测方法灵敏度高，可检测到模板含量为1ng DNA的样品。
本发明提供的针对猪皮革样品检测的特异性引物对和特异性探针具有高度的特异性和灵敏度，能够适用于不同工艺处理的猪皮革样品的鉴别，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为不同种属的皮革标准样品的荧光定量检测结果。
图2为内参基因的荧光定量检测结果。
图3为不同浓度的猪皮革来源的DNA模板的荧光定量检测结果。
图4为不同种属和不同工艺处理的皮革样品的显微镜观察结果，其中，(a)为鹿皮革；(b)为猪皮革；(c)为绵羊皮革；(d)为山羊皮革；(e)为牛皮革；(f)为猪皮革。
图5为不同种属和不同工艺处理的皮革样品的荧光定量PCR检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。
实施例1、皮革样品的DNA提取方法
1.1、样品前处理
首先用砂皮将皮革的表层或是表面涂层先除去，然后用剪刀剪碎或者冷冻研磨机粉碎后，用0.03mol/L的Na2HPO4溶液浸泡样品，于50℃空气浴不间断震荡6小时，用蒸馏水浸泡皮革样品至无色，每半小时换一次水，烘干待用。
1.2、裂解
将烘干的样品细细剪碎，取40mg至于2ml EP管内，加入500μL裂解缓冲液，上下颠倒混匀，于60℃水浴20分钟，每过5分钟取出剧烈震荡，冷却至室温，加入20个单位的胶原蛋白酶，于37℃空气浴，以500rmp的速度振荡1小时，加入20个单位的蛋白酶K，于50℃空气浴，以500rmp的速度振荡过夜，加入0.5mL10mol/L NaOH溶液，于50℃空气浴，以150rmp的速度振荡1小时，加入0.2mL2mol/L Tris-HCl(pH8.0)，再加入0.4mL浓HCl中和该溶液。
其中，所述裂解缓冲液组成如下：1mol/L Tris-HCl(pH8.0)5mL，500mmol/LEDTA(pH8.0)2mL，十二烷基硫酸钠0.2g，蔗糖1.2g，NaCl170mg，二硫苏糖醇(DTT)920mg，补水至10mL。
1.3、去除蛋白
将裂解的样品于10000rpm离心3分钟，转移上清液至新的EP管内，加入等体积的苯酚氯仿溶液(1：1)剧烈震荡，4℃，12000rpm离心10分钟，转移水相至新的EP管，加入等体积的氯仿，4℃，12000rpm离心10分钟，去除残留苯酚，转移水相至新的EP管。
1.4、沉淀DNA
将去除蛋白的样品加入0.7V的异丙醇沉淀，4℃，12000rpm离心15分钟，用70％乙醇洗去残留异丙醇，晾干，用适量水溶解DNA。
1.5、纯化DNA
将获得的DNA样品用磁珠(购自Promega公司)纯化，最终溶解体积为40μL。
实施例2、猪皮革荧光定量PCR检测方法
2.1、猪皮革荧光定量PCR扩增的引物和探针设计
比较猪、牛、山羊、绵羊、马、鹿线粒体DNA的序列，在12SrRNA基因中选择种内保守、种间高变的区域设计引物对和探针。特异性引物对扩增产物大小为61bp。
特异性引物对和特异性探针的序列如下：
PigF：5’-GCGCCCCGGTGAGAA-3’(SEQ ID NO：1)
PigR：5’-TGTGCTTGATACCTGCTCCTTTT-3’(SEQ ID NO：2)
Ppig：FAM-CCCTCCAGATCCTAAAG-MGB(SEQ ID NO：3)
同时设计了猪、牛、山羊、绵羊、马、鹿共有的通用引物，通用引物对扩增产物大小为171bp，通用引物对和通用探针的序列如下：
UniF：5’-AAAGGACTTGGCGGTGCTT-3’(SEQ ID NO：4)
UniR：5’-GGGTTTGCTGAAGATGGCG-3’(SEQ ID NO：5)
Puni：FAM-TAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCG-TAMARA(SEQ ID NO：6)
其中，FAM表示荧光报告基团，MGB和TAMARA表示淬灭基团。本发明采用荧光探针法，其检测原理是利用荧光标记特异性探针来识别模板。与现有技术中SYBR染料法相比，本发明荧光标记特异性探针的特异性更强。
2.2、荧光定量PCR的反应条件
反应体系如下：AB公司的2×Taqman Universal Master Mix(Part No.4440040)10μl，DNA模板2μl，引物和探针，用水补足至20μl。其中，特异性引物的终浓度分别为600nM，特异性探针的终浓度为400nM，通用引物和通用探针的终浓度分别为300nM。
反应条件如下：95℃，10min；95℃，15s，60℃，45s，40个循环。
2.3、特异性检测
将猪、马、山羊、绵羊、牛、鹿皮革标准样品提取DNA，以其中浓度最低的DNA为准，将其余样品均稀释至80ng/μL左右，然后使用本发明设计的引物对和探针进行荧光定量PCR检测。结果如表1、图1和图2所示。
表1、不同种属的皮革标准样品的特异性检测结果
| 样品编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 样品种类 | 猪 | 山羊 | 绵羊 | 牛 | 马 | 鹿 |
| 特异性扩增Ct值 | 26.24 | — | 38.75 | — | — | — |
| 内参Ct值 | 26.81 | 26.94 | 25.05 | 26.67 | 26.33 | 25.82 |
由表1、图1和图2的结果可见，使用本发明的特异性引物对和特异性探针扩增的猪皮革DNA样品有很强的荧光信号，Ct值为26；绵羊皮革DNA样品有轻微的交叉反应，但Ct值读数较大，为38，可以忽略；山羊、牛、马、鹿皮革DNA样品检测为阴性。使用通用引物对和通用探针扩增的内参基因检测情况良好。以上结果说明本发明设计的针对猪皮革样品检测的特异性引物对和特异性探针具有高度的特异性。
2.4、灵敏度检测
将猪皮革DNA样品进行稀释，母液浓度为100ng/μL，依次梯度稀释为10ng/μL和1ng/μL，再各取1μl模板，使用本发明设计的引物对和探针进行荧光定量PCR检测。结果如图3所示，当模板含量为1ng DNA时也可以检测得到。以上结果说明本发明设计的针对猪皮革样品检测的特异性引物对和特异性探针具有高度的灵敏度。
综上所述，若使用本发明的特异性引物对和特异性探针对样品进行荧光定量PCR检测的Ct<35，且同时通用引物对和通用探针检测的Ct<35，可直接判定该皮革样品为猪皮革。反之，则需再次检测，或者加大抽提样品量再次确认。
2.5、实物的检测
将不同工艺处理的猪、马、山羊、绵羊、牛、鹿皮革样品进行显微镜观察并提取DNA，然后使用本发明设计的引物对和探针进行荧光定量PCR检测。结果如表2、图4和图5所示。
表2、不同种属、不同工艺处理的皮革样品的特异性检测结果
| 样品编号 | 样品名称 | 样品描述 | 内参Ct值 | 特异性扩增Ct值 | 结果 |
| 1 | 鹿皮革 | 黑色皮革 | 23.22 | — | — |
| 2 | 猪皮革 | 白色皮革 | 22.84 | 23.20 | 猪皮 |
| 3 | 绵羊皮革 | 白色皮革 | 24.57 | 37.95 | — |
| 4 | 山羊皮革 | 桃红色皮革 | 25.20 | — | — |
| 5 | 牛皮革 | 橙色皮革 | 26.42 | — | — |
| 6 | 猪皮革 | 黑色皮革 | 26.15 | 27.84 | 猪皮 |
由表2和图5的结果可见，针对两种不同工艺处理的猪皮革DNA样品，使用本发明的特异性引物对和特异性探针扩增后有很强的荧光信号，Ct值分别为23.20和27.84。绵羊皮革DNA样品有轻微的交叉反应，但Ct值读数较大，为37.95，可以忽略。山羊、牛、鹿皮革DNA样品检测为阴性。使用通用引物对和通用探针扩增的内参基因检测情况良好。以上结果说明本发明设计的特异性引物对和特异性探针能够适用于不同工艺处理的猪皮革样品的检测。
综上所述，本发明设计的针对猪皮革样品检测的特异性引物对和特异性探针具有高度的特异性和灵敏度，能够很好地与山羊、绵羊、牛、鹿、马等其他皮革样品区分，适用于不同工艺处理的猪皮革样品的鉴定，具有广泛的应用前景。
根据本发明的以上启示，本领域的技术人员容易理解，可以利用(a)用于荧光定量PCR检测猪皮革的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；和(b)用于荧光定量PCR检测猪皮革的特异性探针，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，制成猪皮革的检测试剂盒。
进一步，所述试剂盒还可以包括(c)标准参照物；所述标准参照物可以是猪皮革DNA，或含有猪皮革扩增目的片段的质粒DNA，或猪皮革。
在获得了(a)用于荧光定量PCR检测的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；和(b)用于荧光定量PCR检测的特异性探针，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基础上，利用本技术领域中的常规技术手段就可以制成检测试剂盒，此处不再赘述。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (7)
1.一种用于荧光定量PCR检测猪皮革的特异性引物对和特异性探针，其特征在于，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种采用荧光定量PCR检测猪皮革的方法，包括以下步骤：
步骤一、以猪皮革的DNA为模板，进行PCR扩增；
步骤二、检测扩增产物的荧光信号；
其特征在于，用于PCR扩增的反应体系中含有特异性引物对和特异性探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件如下：
反应体系：2×Taqman Universal Master Mix 10μl，DNA模板2μl，特异性引物终浓度为600nM，特异性探针终浓度为400nM，用水补足至20μl；
反应条件：95℃，10min；95℃，15s，60℃，45s，40个循环。
4.一种猪皮革的检测试剂盒，含有以下试剂：
(a)用于荧光定量PCR检测猪皮革的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
(b)用于荧光定量PCR检测猪皮革的特异性探针，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
(c)标准参照物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述标准参照物为猪皮革DNA，或含有猪皮革扩增目的片段的质粒DNA，或猪皮革。
7.如权利要求4～6中任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，用于鉴定猪皮革。
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