CN105132540B - 白木香的双重pcr鉴定方法、引物和探针 - Google Patents

白木香的双重pcr鉴定方法、引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于白木香鉴定的双重qPCR引物、探针和方法，所述引物和探针具有白木香的专属特异性，所述方法为荧光定量PCR。本发明一方面检测样本量少，不会破坏木材及其木材成品本身的结构形态。另一发面以木材特有的DNA信息为依据，能快速、准确、客观地获得白木香的种属鉴定结果，避免了传统鉴定方法必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构基础上的缺陷，因此具有极高的应用前景。

Description

白木香的双重PCR鉴定方法、引物和探针
技术领域
本发明涉及木材材种鉴定的生物学检测领域，具体地说涉及对白木香的DNA鉴定方法及其专用的引物和探针。
背景技术
白木香（Aquilaria sinensis (Lour.) Spreng.），又称土沉香，是瑞香科沉香属双子叶常绿乔木，国家二级重点野生保护植物。白木香不仅是珍贵的药用植物而且还有极高的经济价值。随着人们对沉香需求量的正价，沉香价格不断攀升，市场上出现了大量的伪品，严重扰乱了市场秩序。但迄今为止，对白木香的鉴定依然采用传统的木材鉴定手段，即解剖切片观察木材的构造以及形态特征从而得出判定结果。
所谓传统的木材鉴定识别方法是利用人工经验进行识别，主要通过对木材截面进行人工观察的方式完成。对白木香的鉴定目前采用的也是传统的鉴定方法。所谓的传统鉴定方法主要依赖宏观识别，而微观识别则需要使用光学显微镜观察其内部的解剖结构特征，也就是观察构成木材的各类细胞与组织的形态及排列特征，该方法涉及的识别特征较多，鉴定相对准确，但对于鉴定工作者的要求很高，要对此做出准确的鉴定，必须具有丰富的实践经验。近年来研究工作者开发了基于数字图像处理的木材图像识别技术，大大提高了木材识别的准确性,推动了木材识别技术的发展。但是，无论是基于识别者经验的传统识别技术还是基于计算机图像检索的识别技术，都没有脱离木材本身的形态结构及特征，鉴定识别工作都必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构的基础上，这就为木材识别工作带来了一定的局限性，同时，相近种属木材易出现材质结构的相似，为木材识别的准确性带来困难。
若能建立起以木材基因多样性的分子鉴定技术，一方面可以杜绝木材制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范木材市场；另一方面，为检验检疫、农林、工商的快速筛查和鉴定提供技术方法，促进物种资源的保护和利用，提高进出口的检验检疫的准确性。
因此建立起白木香的DNA鉴定方法，实现白木香的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明提供一种白木香鉴定的双重PCR引物和探针，所述引物和探针序列包括：
第一轮PCR扩增的引物和探针分别为：
HH Primer-F：5'- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3'
HH Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
HH Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3'。
第二轮PCR扩增的引物和探针分别为：
BMX Primer-F：5'- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3'
BMX Primer-R：5'- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3'
BMX Primer Probe ：5'-FAM- AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3'。
进一步地，所述引物和探针的PCR反应条件为95℃，10min；95℃ 15s，60℃1min，共40个循环。
进一步地，所述引物和探针的使用浓度比为：JZHT Primer-F:JZHT Primer-R:JZHT Primer Probe= 900nM:900nM:250nM。
本发明还提供了白木香鉴定的双重PCR，包括如下步骤：
（1）木材样本的预处理；
（2）提取经（1）处理后的木材样本中的 DNA；
（3）利用引物HH Primer-F和HH Primer-R，以及探针HH Primer Probe对（2）中提取的DNA进行第一轮的PCR扩增；
（4）根据（3）的第一轮PCR扩增结果，利用BMX Primer-F和BMX Primer-R，以及探针BMX Primer Probe对（3）有扩增曲线的样本进行第二轮PCR扩增；
（5）根据（4）的结果确定木材种类；
其特征在于，所述引物和探针序列包括：
HH Primer-F：5'- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3'
HH Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
HH Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3'
BMX Primer-F：5'- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3'
BMX Primer-R：5'- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3'
BMX Primer Probe ：5'-FAM- AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3'。
进一步地，所述的荧光PCR扩增条件为：95℃，10min；95℃ 15s，60℃1mins，共40个循环。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：本发明在对白木香大量基因信息进行分析比较的基础上，根据序列位点多态性，设计出白木香种属一对特异性扩增引物及MGB探针建立了白木香特异性的荧光定量PCR鉴定检测方法。该方法对目的基因进行扩增，条件依赖少，不用比对复杂的测序图谱，直接根据扩增曲线即可做出分析该位点基因型，对结果的分析非常直观。本发明所采用的荧光定量PCR法(MGB探针)检测周期短，在三个小时内即可得出结果，而且相对于DNA测序法来说检测灵敏度大大提高，使用MGB探针还能极大地降低本底信号的干扰。
本发明并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过木材特有的DNA信息做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在木材有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本发明很好地满足各相关部门对白木香快速筛查和鉴定的要求，能有效杜绝白木香制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范市场，促进物种资源的保护和利用具有重要的意义。
附图说明
图1是白木香和对照组树种DNA提取效果实验。
图2A和图2B是特异性实验结果。
图3是本发明方法灵敏度实验结果。
图4是取自针对经不同处理方式得到的木材样本的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。
实施例1 检测白木香的引物、探针和检测试剂盒
利用NCBI等资源信息，筛选出一对特异性扩增引物对（HH Primer-F和HH Primer-R），并在该引物对的扩增区域设定了一条特异性的探针（HH Primer Probe）。利用HHPrimer-F、HH Primer-R 和HH Primer Probe将白木香（A.sinensis）和云南沉香（A.yunnanensis）与其他物种区分开来。所述扩增引物对和探针序列分别是：
HH Primer-F：5'- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3'
HH Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
HH Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3'。
设计一对特异性扩增引物对（BMX Primer-F和BMX Primer-R）和一条特异性的探针（BMX Primer Probe）。利用BMX Primer-F、BMX Primer-R 和BMX Primer Probe鉴定出白木香（A.sinensis）。
BMX Primer-F：5'- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3'
BMX Primer-R：5'- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3'
BMX Primer Probe ：5'-FAM- AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3'。
一种检测白木香的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
其中所述用于将白木香（A.sinensis）和云南沉香（A.yunnanensis）与其他物种区分开的第一轮qPCR扩增反应体系为：20µl的体系包括：
Taqman getyping master mix（2×） 10µl
HH Primer Probe 终浓度（250nM）
HH Primer-F（20µM） 终浓度（900nM）
HH Primer-R（20µM） 终浓度（900nM）
DNA样品模板 1~20ng
其中所述引物和探针序列分别为：
HH Primer-F：5'- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3'
HH Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
HH Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3'。
其中所述用于鉴定出白木香（A.sinensis）的第二轮qPCR扩增反应体系为：20µl的体系包括：
Taqman getyping master mix（2×） 10µl
BMX Primer Probe 终浓度（250nM）
BMX Primer-F（20µM） 终浓度（900nM）
BMX Primer-R（20µM） 终浓度（900nM）
其中所述引物和探针序列分别为：
BMX Primer-F：5'- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3'
BMX Primer-R：5'- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3'
BMX Primer Probe ：5'-FAM- AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3'。
阳性对照品：含有本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。
阴性对照品：不含本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质的ddH2O。
实施例2：双重qPCR的鉴定方法
（1）木材样本的预处理：
用75%的乙醇对木材表面进行彻底的消毒，经无菌水冲洗并用擦干木材。切除待测木材表面部分以避免其他职务组织的污染。取一定量的木材样本，在预冷的研钵中加入液氮和石英砂研磨成粉末备用。当不立即使用时，样品DNA溶液在-20℃下保存待用。
（2）木材样本 DNA提取：
采用植物基因组提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit， TIANGEN）提取步骤（1）中预处理的木材总DNA，置于-40℃冰箱中备用。
（3）第一轮qPCR扩增：
将步骤（2）中提取的DNA进行第一轮qPCR检测。其中扩增条件为：95℃ 10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。本实施例所述qPCR扩增是在ABI公司的ABI 7500 Real TimePCR System完成。也可以在其他的扩增仪器上完成。
第一轮qPCR扩增的引物和探针分别为：
HH Primer-F：5'- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3'
HH Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
HH Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3'。
（4）第二轮qPCR扩增：
根据步骤（3）的扩增结果，确定样本为白木香（A.sinensis）和云南沉香（A.yunnanensis）后，进行第二轮PCR扩增。其中扩增条件为：95℃，2min；95℃ 15s，55℃34s，共40个循环。本实施例所述qPCR扩增是在ABI公司的ABI 7500 Real Time PCR System完成。也可以在其他的扩增仪器上完成。
第二轮qPCR扩增的引物和探针分别为：
BMX Primer-F：5'- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3'
BMX Primer-R：5'- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3'
BMX Primer Probe ：5'- FAM - AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3'。
（5）确定木材种类
根据第二轮qPCR扩增结果确定木材样品的种类。
实施例3：DNA提取与检测
分别提取白木香（实验组1）、对照组为A. malaccensis（马来沉香）； A.beccariana（北氏白木香）；A. crassna；A. urdanetensis；A. yunnanensis（云南沉香）；A.khasiana；A. parvifolia；A. citrinacarpa，总共8个对照的基因组DNA作为模板，利用植物內源基因tRNALeu及实施例1的反应体系和实施例2所述的检测方法，对提取的DNA进行检测。
tRNALeu的引物和探针序列分别为（标准）
tRNALeu-F：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
tRNALeu-R：5'-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'
tRNALeu Probe ：5'-FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRA-3'
如图1表明实施例3中实验组和对照组样本的DNA均已经被成功提取。
实施例4：荧光PCR扩增的特异性
以实施例3提取DNA作为模版，实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法，进行白木香荧光PCR检测的特异性实验。
如图2A所示的第一轮扩增，可以特异性扩增出白木香和云南沉香。如图2B所示的第二轮扩增实验结果表明，本发明所述的引物、探针和方法能扩增出白木香。而同属的A.malaccensis（马来沉香）； A. beccariana（北氏白木香）；A. crassna；A. urdanetensis；A. yunnanensis（云南沉香）；A. khasiana；A. parvifolia；A. citrinacarpa均为阴性，均不能被扩增。因此本发明所述引物、探针和方法能够检测出白木香，检测特异性好。
另外，将本实施例实验组和对照组的完整木材用传统的鉴定方法作进一步确认实验。结果表明，利用本发明所述分子鉴定方法确认的结果准确。由此可见，本发明具有很好的特异性。
实施例5：荧光PCR扩增的灵敏度
以同一根干燥的白木香木材为材料，烘干至恒重，然后分别以0.1g、0.5g、1.0g和2.0g取样，利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。
图3所示，随着样品量的增加，对应qPCR的Ct值成比例下降，样品取样量与结果对应性强。实验结果表明，利用本发明所述的引物和探针，可以检测出样品量仅为0.1g的DNA信息。
由于本发明所述分子鉴定方法只需要极少量的木材样本就可完成检测，它并不依赖于木材的形态结构是否完整。因此本发明不仅可以对形态完整的白木香进行鉴定，还可以对看不出原始形态的白木香加工成品或半成品等进行鉴定。
实施例6：检测经不同处理方式得到的木材样本
选用的木材样本分别来自：利用25℃和65℃三种温度干燥的木材；潮湿木材，即受潮的木材；分别采用挤压、熏蒸或气干处理的木材。利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。如图4所示的实验结果表明本发明所述的引物和探针，可以准确地分析出利用不同方法处理后的白木香的DNA情况。其中图中的A、B、C、D分别表示A：干燥木材；B：潮湿木材；C：挤压木材；D：熏蒸木材；E：气干木材。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 白木香的双重PCR鉴定方法、引物和探针
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccgttcgct actttgactt tg 22
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cattaccaag acatcatcct catttt 26
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgacatagac acaagtc 17
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagtaaggaa tacccatttg aatgatt 27
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcgaacggga attgacagaa 20
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaagtcgtcc cttcga 16

Claims (6)

1.白木香鉴定的双重PCR引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列包括：
第一轮PCR扩增的引物和探针分别为：
HH Primer-F：5'-CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG-3'
HH Primer-R：5'-CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT-3'
HH Primer Probe：5'-VIC-TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'；
第二轮PCR扩增的引物和探针分别为：
BMX Primer-F：5'-GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT-3'
BMX Primer-R：5'-GCGAACGGGAATTGACAGAA-3'
BMX Primer Probe：5'-FAM-AAAGTCGTCCCTTCGA-MGB-3'。
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，还包括检测植物內源基因tRNALeu的引物和探针，序列分别为：
tRNALeu-F：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
tRNALeu-R：5'-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'
tRNALeu Probe：5'-FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRA-3'。
3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的使用浓度比为：JZHT Primer-F:JZHT Primer-R:JZHT Primer Probe＝900nM:900nM:250nM。
4.白木香鉴定的双重PCR方法，包括如下步骤：
(1)木材样本的预处理；
(2)提取经(1)处理后的木材样本中的DNA；
(3)利用引物HH Primer-F和HH Primer-R，以及探针HH Primer Probe对(2)中提取的DNA进行第一轮的PCR扩增；
(4)根据(3)的第一轮PCR扩增结果，利用BMX Primer-F和BMX Primer-R，以及探针BMXPrimer Probe对(3)有扩增曲线的样本进行第二轮PCR扩增；
(5)根据(4)的结果确定木材种类；
其特征在于，所述引物和探针序列包括：
HH Primer-F：5'-CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG-3'
HH Primer-R：5'-CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT-3'
HH Primer Probe：5'-VIC-TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'
BMX Primer-F：5'-GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT-3'
BMX Primer-R：5'-GCGAACGGGAATTGACAGAA-3'
BMX Primer Probe：5'-FAM-AAAGTCGTCCCTTCGA-MGB-3'。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：95℃，10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括检测植物內源基因tRNALeu的引物和探针，序列分别为：
tRNALeu-F：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
tRNALeu-R：5'-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'
tRNALeu Probe：5'-FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRA-3'。
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