CN105296477B - 水貂源性成分鉴定及动物制品中水貂、兔、狗成分的多重pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水貂源性成分鉴定及动物制品中水貂、兔、狗成分的多重PCR检测试剂盒，属于动物源性成分分子检测技术领域。本发明试剂盒包括水貂、兔、狗各物种特异性引物、反应试剂以及阳性和空白对照。水貂特异性引物是能特异性扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的引物对。采用本发明的引物扩增样品DNA，对PCR扩增产物进行分析，可判定样品是否含有水貂种源性成分；同时，能鉴别是否掺有兔源或狗源成分，为毛皮制品的分子鉴定提供手段；另外，通过多重PCR检测，可一次性鉴别水貂源、兔源和狗源成分，建立肉类、毛皮掺假和饲料成分鉴别的有效方法。该方法和试剂盒具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

Description

水貂源性成分鉴定及动物制品中水貂、兔、狗成分的多重PCR 检测试剂盒

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及水貂源性成分鉴定及动物制品中水貂、兔、狗成分的多重PCR检测试剂盒。

背景技术

皮草，亦称裘皮，是指利用动物的皮毛所制成的服装，它可能是人类最早的衣料之一。随着时代的发展，皮草已逐渐成为奢侈和财富的象征。常用来制作皮草的动物包括貂、狐，兔、貉、海狸等，价格昂贵，是冬季女士高档服饰之一。人们常说的裘皮，一般指的是貂皮。

水貂在动物分类学上属于哺乳纲、食肉目、鼬科、鼬属，是小型珍贵毛皮动物之一。貂皮是东北三宝之一，素有“裘中之王”之称，在国外被称为“软黄金”。貂皮属于细皮毛裘皮，皮板优良，轻柔结实，毛绒丰厚，色泽光润。用它制成的皮草服装雍容华贵，是理想的裘皮制品，因此它又成为了富贵的象征。貂皮分紫貂皮、白貂皮、黑貂皮、水貂皮等，以紫貂皮更为名贵。其针毛粗、长、亮，毛被绵软，绒毛绸密，质软坚韧，为高级毛皮，多用于服装的外套、长袍、披肩等。貂皮具有“风吹皮毛毛更暖，雪落皮毛雪自消，雨落皮毛毛不湿”的特点。

近些年，随着生活水平的提高，名贵的貂皮服装受到越来越多消费者的青睐。由于貂皮价格昂贵，一些不法经营者为牟取暴利，买由黄鼠狼、狐狸或獭兔皮甚至狗皮制成的服装，然后染色翻新成貂皮制品。市场上买到的貂皮的衣领也许就是普通的兔毛或者狗皮经过深加工制成的，普通消费者根本无法分辨。此外，也有许多不法商贩将水貂胴体肉、内脏或骨等经过加工制作或掺入到食用肉制品和饲料中，欺诈消费者，破坏市场秩序。采用传统的形态学方法鉴别毛皮、肉类或饲料成分来源，人为误差较大，容易误判，准确率较低。目前，我国已发表的专利中有可以鉴别紫貂皮和松貂皮(李波，徐艳春.扩增貂属物种细胞色素b基因的引物及鉴别紫貂、松貂的方法[P],中国专利：CN 101792816 A,2010-8-4.)，也有检测貂源性成分的方法，但涉及到的动物物种较少(李明成，张丽华，王冰梅，孙红霞.貂心DNA检测试剂盒及鉴定方法[P],中国专利：CN 101434990 A,2009-5-20.)或方法繁杂、用时较长(李光玉，孙伟丽，赵家平等.一组检测水貂源性成分的扩增引物[P],中国专利：CN102643912 B,2014-1-8)，不能简便快捷地鉴定貂皮与其他动物毛皮。水貂肉制品和饲料中水貂源性成分的鉴别研究也鲜有报道。因此，如何有效、准确地判别出动物性制品是否属于水貂制品，并建立一种简单易行的检测方法具有紧迫性。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于水貂源性成分特异性检测的引物；

本发明的第二个目的在于提供用于水貂源性成分检测的检测试剂盒；

本发明的目的还在于提供水貂源性成分鉴定及动物性制品中兔源、狗源成分的鉴定方法。

为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行水貂基因组特异序列基因的筛选，通过对非水貂物种及不同的水貂品种中的检测筛选，选取水貂中特异性的基因片段作为检测分子并设计特异性引物，利用PCR电泳技术对其种间特异性、种内保守性和灵敏度等结果进行检测。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异DNA分子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

基于此，本发明首先提供一种水貂特异性引物，其特异性扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段。

优选地，引物长度为18～27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。

优选地，该引物序列如下：

MUSTLA-F：5′-TTCGGCGCTGCCTTAATTGTC-3′

MUSTLA-R：5′-AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3′；

或该引物向5’、3’端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQ ID No.1所示序列(长度220bp)的引物。

进一步本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括下述兔和/或狗特异性引物：

(1)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段(长度317bp)的引物对Ⅰ：

CANIS-F：5’-GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3’

CANIS-R：5’-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3’；

(2)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段(长度209bp)的引物对Ⅱ：

OCU-F：5′-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3’

OCU-R：5′-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3’。

优选地，所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：Taq DNAMasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。

所述阳性对照DNA模板为水貂DNA模板。

优选地，所述阳性对照DNA模板还包括兔、狗DNA模板中的一种或多种。

进一步，本发明提供上述的水貂特异性引物或检测试剂盒在水貂源性成分鉴定或在肉类、饲料或皮毛制品分子鉴定中的应用。可对动物制品中水貂、兔、狗成分多重PCR检测。

本发明还提供水貂源性成分鉴定及其制品中掺入兔、狗成分的检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)PCR扩增：

A)用所述的水貂特异性引物进行PCR扩增，并以水貂DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

B)用所述的试剂盒，用所述的水貂特异性引物、兔和/或狗特异性引物分别进行PCR扩增，以水貂DNA模板为阳性对照，同时兔、狗DNA模板中的一种或多种为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

C)用所述的试剂盒，进行多重PCR扩增，以水貂、兔、狗等比例混合的DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。

具体地，一种水貂源性成分及动物制品中水貂、兔、狗成分的普通PCR检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)用上述的水貂特异性引物SEQ ID No.2&3进行PCR扩增，并以水貂DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行电泳检测和结果判定。

优选地，其中步骤2)PCR扩增的反应试剂如如表1：

表1 本发明普通PCR扩增的反应体系

步骤2)所述的PCR反应程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，30次

循环；4℃降温2min；

结果判定方法是：当PCR反应产物与阳性对照扩增产物相符，且空白样品无扩增产物时，判定样品中检测出水貂源性成分；当PCR反应无扩增产物或产物与阳性对照扩增产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出水貂源性成分；如果阳性样品未检测预期片段，说明试剂失效或操作失误；若空白对照与阳性样品均检出，说明试剂污染或操作失误。

此外，以兔、狗基因组DNA为阳性对照，利用上述引物或试剂盒还可以进一步判断其是否含有兔或狗源性成分。

此外，本发明还提供动物制品中水貂、狗、兔成分的多重PCR检测方法，将上述的引物SEQ ID No.2&3和Ⅰ～Ⅱ按6:5:2的比例混合，可进行多重PCR扩增，以水貂、狗、兔等比例混合DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；利用上述引物或试剂盒还可以进一步进行水貂、狗、兔的快速检测，方便混合样品的检测。

优选地，其中多重PCR扩增的反应试剂如表2：

表2 本发明多重PCR扩增的反应体系

本发明中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现，也可用测序或其他有效方法检测；提取样品DNA的方法可用苯酚-氯仿提取法，也可使用公认的、具有相同效力的其他提取方法。

本发明提供了有效的、精准的、可靠的水貂源性成分分子鉴定方法，所组装的试剂盒能快速鉴定样品是否含水貂源性成分；同时，能鉴别是否掺有兔源或狗源成分，为毛皮制品的分子鉴定提供手段；另外，通过多重PCR检测，可一次性鉴别水貂、兔源和狗源成分，建立肉类掺假和饲料成分鉴别的有效方法。基于此，本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

附图说明

图1：是SEQ ID No.1所示的特异序列在水貂中具有物种特异性的检测结果。以鼬科的水貂，非鼬科哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、兔、狐、狗、貉)以及非哺乳动物(鸡、鸭、鹅)的基因组DNA为模板，扩增SEQ ID No.1所示的的特异片段，所有测试样品中仅在水貂中得到扩增产物，非水貂均无扩增产物。结果表明所扩增片段在水貂中具有特异性。泳道中编号说明如下：M：为BM2000 DNA Marker；1-3：空白对照；4-6：水貂；7-9：小鼠；10-12：大鼠；13-15：仓鼠；16-18：豚鼠；19-21：普通牛；22-24：水牛；25-27：绵羊；28-30：山羊；31-33：猪；34-36：马；37-39：驴；40-42：鸡；43-45：鸭；46-48：鹅；49-51：兔；52-54：狐；55-57：狗；58-60：貉子。

图2：是SEQ ID No.1所示的特异序列在水貂不同DNA模板浓度中的灵敏度检测结果。分别以0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的水貂DNA为模板，扩增SEQ ID No.1所示的特异片段，1ng/μL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。泳道中编号说明如下：M：为BM2000 DNA Marker；1-4：空白对照；5-8：0.1ng/μL的模板浓度；9-12：1ng/μL的模板浓度；13-16：10ng/μL的模板浓度；17-20：100ng/μL的模板浓度。

图3：是SEQ ID No.1所示的特异性序列在水貂的30个个体中的保守性检测结果。以水貂DNA为模板，扩增SEQ ID No.1所示的的特异片段，所有测试样品即所有水貂的样品都得到特异性扩增，且一致性良好，表明所扩增片段在水貂中具有保守性。泳道中编号说明如下：M：为BM2000 DNA Marker；E：空白对照；N：多物种混合的阴性对照(无水貂DNA)；1-44：水貂。

图4：是水貂、兔、狗引物组特异性检测结果。分别用水貂、兔、狗的特异性引物在该3个物种中进行扩增，结果各引物只在本物种中有效扩增，表明各特异性引物的特异性良好。M：为BM2000 DNA Marker；E：空白对照；1：水貂的特异性引物在水貂DNA中的扩增结果；2：水貂的特异性引物在狗DNA中的扩增结果；3：水貂的特异性引物在兔DNA中的扩增结果；4：兔的特异性引物在兔DNA中的扩增结果；5：兔的特异性引物在水貂DNA中的扩增结果；6：狗的特异性引物在狗DNA中的扩增结果；7：狗的特异性引物在水貂DNA中的扩增结果。

图5：是水貂、兔、狗引物组多重PCR检测结果。取水貂、兔、狗以及三者等比例混合的基因组DNA，用水貂、狗、兔混合引物(6:5:2)进行检验，结果表明各引物特异性良好，多重PCR检测可有效区分各物种条带。泳道中编号说明如下：M：为BM2000 DNA Marker；E：空白对照；G：狗阳性对照；S：水貂阳性对照；T：兔阳性对照；X：为水貂、兔、狗DNA等比例混合样三重PCR结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修改或润色均属于本发明的范围。

实施例1 样品中水貂源性成分特异性检测

1.试样的制备与保存

1.1 取样

采集水貂样品1g，于-20℃下保存备用。

1.2 DNA模板制备

DNA模板制备采用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁,黎孟枫.北京:科学出版社,1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其他提取方法，这些方法都是报道的常用方法。

2.引物设计

本实施例的引物序列如表3和序列表SEQ ID NO：2和3所示。

表3 本发明设计的PCR扩增引物

引物名称	引物序列
		MUSTLA-F	5′-TTCGGCGCTGCCTTAATTGTC-3′
MUSTLA-R	5′-AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3′

预期扩增片段大小为220bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

实验表明，该引物特异性强，在水貂中均能有效扩增，而在其他非水貂物种中都无目的片段扩增；且引物的灵敏度较高，在模板DNA浓度为1ng/μL时即可扩增。以上述引物分别向3′、5′延伸一个碱基和两个碱基或修饰形成的引物对进行实验，实验表明仍能进行特异性扩增，从经济型和综合效果来看以表3中的引物最佳。

3.PCR检测

3.1 试样PCR反应

3.1.1 在PCR反应管中依次加入反应试剂(如表1所示)，混匀，再加25μL石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加)。

3.1.2 将PCR管在离心机上500g～3 000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。

3.1.3 进行PCR反应。程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，共进行30次循环；4℃降温2min。

3.1.4 反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。

3.2 对照PCR反应

3.2.1 在试样PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照、空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与3.1相同，且阴性、阳性对照DNA模板浓度也应达到试样DNA模板浓度要求。

3.2.2 以非鼬科哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、兔、狐、狗、貉)以及非哺乳动物(鸡、鸭、鹅)的基因组DNA作为PCR反应体系的阴性对照模板。

3.2.3 以鼬科鼬属的水貂基因组DNA作为PCR反应体系的阳性对照模板。

3.2.4 以双蒸水作为PCR反应体系的空白对照模板。

4.PCR扩增产物的检测及结果判定

按30g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5μL EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，置于1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取5μL PCR产物与1μL加样缓冲液(称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲苯腈蓝FF，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存)混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳15～30min后检测。

电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准判断扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。

5 结果分析与表述

5.1 对照检测结果分析

如图1所示，阳性对照的PCR反应中，水貂SEQ ID No.1所示的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照及空白对照中除引物二聚体外没有任何扩增片段，表明PCR反应体系工作正常。

5.2 样品检测结果分析和表述

5.2.1 若水貂SEQ ID No.1所示的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出水貂所述的特异性序列，表述为“样品中检测出水貂源性成分”。

5.2.2 若水貂SEQ ID No.1所示的特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出水貂所述的特异性序列，表述为“样品中未检测出水貂源性成分”。

实施例2 灵敏度试验

分别以0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的水貂DNA为模板，按照实施例1的条件，扩增SEQ ID NO.1核苷酸特异片段。结果如图2所示，1ng/μL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。

实施例3 检测水貂源性产品中掺入非水貂源性源性产品的引物组

本发明是对于动物制品来源的检测，通过各物种相应引物PCR扩增的情况，判断是否为或含有某物种的DNA，进而判定是否有某物种的动物源性成分掺假。

1 样品中DNA的提取

各物种DNA的提取及保存方法同前实施例1中所述。

2 引物的设计和筛选

为了寻找各物种特异的检测序列，我们从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行特异序列的筛选，通过与非本物种及本物种不同品种的核酸序列比对，筛选种内较保守、物种间特异的核苷酸序列作为检测分子。选取其中结果较好的序列设计各自物种引物序列，并通过实验进一步筛选特异性较好的引物用于后续试验。

一组水貂、兔、狗的PCR鉴定用引物体系，由下列引物对组成：

(1)对水貂基因组DNA序列进行扩增生成水貂特异性扩增片段(220bp)的引物对：

MUSTLA-F：5′-TTCGGCGCTGCCTTAATTGTC-3′

MUSTLA-R：5′-AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3′；

(2)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段(317bp)的引物对：

CANIS-F：5’-GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3’

CANIS-R：5’-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3’；

(3)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段(209bp)的引物对：

OCU-F：5′-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3’

OCU-R：5′-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3’；

3 PCR检测

3.1 为了确保所选用引物可准确、有效地鉴定出水貂属样品及其中是否掺入狗或兔的样品成分，我们对各引物进行了特异性检测，反应体系如上述表1。

3.2 进行PCR反应的程序为：

95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，30次循环；4℃降温2min；

3.3 在试样PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照、阳性对照。

3.4 反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测：该电泳过程及条件同实施例1中的电泳。

所得凝胶成像结果如图4所示。分别用水貂、兔、狗特异性引物以该3个物种的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，很好的验证了各物种特异性引物的有效性和特异性。由图4可以看出，兔、狗特异性引物均能很好的扩增出各自对应物种的特异性大小的条带，而在水貂中均未扩增出目的条带。

实施例4 多重PCR

为了方便快速地检测，我们在保证各引物有效扩增且特异性良好的情况下，同时考虑各引物的扩增效率，将水貂、狗、兔的引物量按照6:5:2的比例混合后备用：

4.1 反应总体积同表2.

4.2 DNA样品：取浓度为25ng/μL的水貂、兔、狗基因组DNA等比例混合作为反应所需模板。

4.3 反应程序同实施例1。

4.4 电泳检测选用电泳缓冲液为1×TBE，其他同实施例1。

所得凝胶成像结果如图5所示。实验结果表明上述各引物特异性良好，可方便、有效地将水貂与兔、狗区分开。

实施例5 试剂盒的组装

该试剂盒的组成包括：

引物(各物种引物对SEQ ID No.2&3和Ⅰ～II各一份)；

2×Taq DNA MasterMix；

阳性对照DNA模板(水貂、兔、狗DNA模板各一份)；

双蒸水。

本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。

试剂盒的应用方法：

1.依据需要，按照上述各实施例1或实施例3或实施例4的PCR反应体系加样。

其中，2×Taq DNA MasterMix(购自北京艾德莱生物科技有限公司)是将PCR反应所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl₂以及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物。

2.依据实施例1或实施例3或实施例4的PCR扩增条件上样

3.反应结束后取5μL PCR扩增产物，3.0％的琼脂糖凝胶电泳(技术参数：2V/cm～5V/cm，电泳15min～30min)，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测结果。

每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。

Claims (9)

1.水貂特异性引物，其特异性扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述引物序列如下：

MUSTLA-F：5'-TTCGGCGCTGCCTTAATTGTC-3'

MUSTLA-R：5'-AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3'。

2.含有权利要求1所述特异性引物的检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括下述引物中的一种或多种特异性引物：

(1)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对：

OCU-F：5'-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3’

OCU-R：5'-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3’；

(2)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段的引物对：

CANIS-F：5’-GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3’

CANIS-R：5’-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3’。

4.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：Taq DNAMasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照DNA模板为鼬科中的水貂基因组DNA模板，双蒸水为空白对照。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照DNA模板还包括兔、狗DNA模板中的一种或多种。

7.权利要求1所述的水貂特异性引物或权利要求2～6任一项所述的检测试剂盒在水貂源性成分或在肉类、饲料或皮毛制品分子鉴定中的应用。

8.水貂源性成分鉴定方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)PCR扩增：

A)用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，并以水貂DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；或

B)用权利要求3-6任一项所述的试剂盒，用水貂特异性引物进行PCR扩增，以水貂DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。

9.水貂源性成分及其制品中掺入兔、狗成分的检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)PCR扩增：

A)用权利要求3-6任一项所述的试剂盒，用水貂特异性引物、对兔和/或狗基因组DNA进行扩增生成兔和/或狗特异性扩增片段的引物对，分别进行PCR扩增，以水貂DNA模板为阳性对照，同时兔、狗DNA模板中的一种或多种为阳性对照，以双蒸水为空白对照；或

B)用权利要求3-6任一项所述的试剂盒，进行多重PCR扩增，以水貂、兔、狗等比例混合的DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。