CN105349653B - 兔特异性引物、试剂盒及其在兔源性成分鉴定中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种兔特异性引物、试剂盒及其在兔源性成分鉴定中的应用，属于动物种源性成分分子检测技术领域。本发明中，兔特异性引物是能特异性扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段的引物对SEQ ID No.2&3。本发明试剂盒包括所述兔特异性引物、反应试剂以及阳性和空白对照。采用本发明的引物扩增样品DNA，对PCR扩增产物进行分析，可判定样品中是否含有兔源性成分。本发明为肉制品和毛皮中兔源性成分的检测提供了有效、精准、可靠的手段，具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

Description

兔特异性引物、试剂盒及其在兔源性成分鉴定中的应用

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及兔特异性引物、试剂盒及其在兔源性成分鉴定中的应用。

背景技术

兔肉性凉味甘，在国际市场上享负盛名，被称之为“保健肉”、“荤中之素”、“美容肉”、“百味肉”等等。兔肉质地细嫩，味道鲜美，营养丰富，与其它肉类相比较，具有很高的消化率(可达85％)，食后极易消化吸收。因此，兔肉极受消费者的喜爱。

随着人民生活水平的提高，兔肉消费量的增加，市场上开始出现各种兔肉制品掺假的现象，因此兔肉制品来源的安全性成为消费者关心的焦点，而对肉制品的来源进行鉴定并建立便捷的检测方法是解决这一问题的关键。科学家针对进化上较不保守的线粒体DNA，利用NCBI核酸序列数据库，通过比对各种动植物的线粒体Cytb基因序列，设计不同物种的特异性引物来进行物种种源鉴定。Cristina G.Santos采用这种方法设计了野兔的线粒体Cytb基因特异性引物并进行了检测，但由于线粒体DNA的高度变异性，该特异性引物只能对少数野兔种进行鉴别，是否可用于家兔的鉴定未见研究报道。因此，如何有效、准确地判别肉制品是否含有兔源性成分，并建立一种简单易行的检测方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种可用于兔源性制品特异性检测的引物；

本发明的第二个目的在于提供用于兔源性制品检测的检测试剂盒；

本发明的目的还在于提供兔源性成分的鉴定方法。

为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行兔基因组特异DNA序列的筛选，经过普通牛、水牛、羊(绵羊、山羊)、猪、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉子的基因组DNA及不同的兔品种DNA中的检测，筛选在兔中特意的、在其他物种中不存在或同源性低的DNA片段作为检测分子。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异DNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.1所示。

基于此，本发明首先提供一种兔特异性引物，其能特异性扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段。

优选地，引物长度为18～27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。

优选地，该引物序列如下：

OCU-F：5′-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3′

OCU-R：5′-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3′；

或该引物向5′、3′端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQ ID No.1所示序列的引物。

进一步本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：Taq DNAMasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。

所述阳性对照DNA模板为兔科兔属的兔基因组DNA模板；

进一步，本发明提供上述的兔特异性引物或检测试剂盒在兔源性成分鉴定中的应用。

本发明还提供兔特异性引物、试剂盒及其在兔源性成分鉴定中的PCR检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)用上述的引物进行PCR扩增，并以兔DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。

优选地，其中步骤2)PCR扩增的反应体系如表1：

表1本发明PCR扩增的反应体系

PCR反应程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸12s，

30次循环；4℃降温2min。

结果判定方法是：当PCR反应产物与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中检测出兔源性成分；当PCR反应产物无扩增产物或与阳性对照扩增产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出兔源性成分；如果阳性样品未检测出预期片段，说明试剂失效或操作失误；若空白对照与阳性样品均检出，说明试剂污染或操作失误。

本发明中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现，也可用测序或其他有效方法检测；提取样品DNA的方法可用苯酚-氯仿提取法，也可使用公认的、具有相同效力的其他提取方法。

本发明提供了有效的、精准的、可靠的兔源性成分检测方法，所组装的试剂盒能快速鉴定样品中是否含有兔源性成分。本发明的方法可以在肉品、饲料和毛皮检测中作为标准检测方法使用。本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

附图说明

图1：是SEQ ID No.1所示的特异序列在兔中具有物种特异性的检测结果。以兔科兔属的家兔、非兔科哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、狐、狗、水貂、貉子)以及非哺乳动物(鸡、鸭、鹅)的基因组DNA为模板，扩增SEQ ID No.1所示的特异片段，所有测试样品中仅在兔中得到扩增产物，非兔物种中均无扩增产物。结果表明所扩增片段在兔中具有特异性。泳道中编号说明如下：M：为BM2000DNA Marker；1-3：空白对照；4-6：兔；7-9：小鼠；10-12：大鼠；13-15：仓鼠；16-18：豚鼠；19-21：普通牛；22-24：水牛；25-27：绵羊；28-30：山羊；31-33：猪；34-36：马；37-39：驴；40-42：鸡；43-45：鸭；46-48：鹅；49-51：狐；52-54：狗；55-57：水貂；58-60：貉子。

图2：是SEQ ID No.1所示的特异序列在兔不同DNA模板浓度中的灵敏度检测结果。分别以0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的兔DNA为模板，扩增SEQ ID No.1所示的特异片段，1ng/μL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。泳道中编号说明如下：M：为BM2000DNA Marker；1-4：空白对照；5-8：0.1ng/μL的模板浓度；9-12：1ng/μL的模板浓度；13-16：10ng/μL的模板浓度；17-20：100ng/μL的模板浓度。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修改或润色均属于本发明的范围。

实施例1样品中兔源性成分特异性检测

1.试样的制备与保存

1.1取样

采集兔肉制品试样1g，于-20℃下保存备用。

1.2DNA模板制备

DNA模板制备采用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁,黎孟枫.北京:科学出版社,1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其他提取方法，这些方法都是报道的常用方法。

2.引物设计

本实施例的引物序列如表2和序列表SEQ ID NO：2和3所示。

表2本发明设计的PCR扩增引物

预期扩增片段大小为209bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

实验表明，该引物特异性强，在兔各品种中均能特异性扩增，而在其他非兔物种中都无目的片段扩增；且引物的灵敏度较高，在模板DNA浓度为1ng/μL时即可扩增。以上述引物分别向3′、5′延伸一个碱基和两个碱基或修饰形成的引物对进行实验，实验表明仍能进行特异性扩增，从经济型和综合效果来看以表2中的引物最佳。

3.PCR检测

3.1试样PCR反应

3.1.1PCR反应体系同表1。

3.1.2混匀，加25μL石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加)，在离心机上500g～3000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。

3.1.3进行PCR反应。程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸12s，共进行30次循环；4℃降温2min。

3.1.4反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。

3.2对照PCR反应

3.2.1在试样PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照和空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与3.1相同，且阴性、阳性对照DNA模板浓度也应达到试样DNA模板浓度要求。

3.2.2以非兔科哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、狐、狗、水貂、貉子)以及非哺乳动物(鸡、鸭、鹅)的基因组DNA作为PCR反应体系的阴性对照模板。

3.2.3以兔科兔属的兔基因组DNA作为PCR反应体系的阳性对照模板。

3.2.4以双蒸水作为PCR反应体系的空白对照。

4.PCR扩增产物的检测及结果判定

按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5μL EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，置于1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取5μL PCR产物与1μL加样缓冲液(称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲苯腈蓝FF，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存)混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳15～30min检测。

电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准判断扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。

5结果分析与表述

5.1对照检测结果分析

如图1所示，阳性对照的PCR反应中，兔SEQ ID No.1所示的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照及空白对照中除引物二聚体外没有任何扩增片段，表明PCR反应体系工作正常。

5.2样品检测结果分析和表述

5.2.1若兔SEQ ID No.1所示的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出兔所述特异性序列，表述为“样品中检测出兔源性成分”。

5.2.2若兔SEQ ID No.1所示的特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出兔所述的特异性序列，表述为“样品中未检测出兔源性成分”。

实施例2灵敏度试验

分别以0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的兔DNA为模板，按照实施例1的条件，扩增SEQ ID NO.1核苷酸特异片段。结果如图2所示，1ng/μL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。

实施例3试剂盒的组装

该试剂盒的组成包括：

上游引物(SEQ ID No.2)；

下游引物(SEQ ID No.3)；

2×Taq DNA MasterMix；

阳性对照DNA模板(兔DNA模板)；

双蒸水。

本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。

试剂盒的应用方法：

依据以下的PCR反应体系加样，于200μL的EP管：

1.

2×Taq DNA MasterMix(购自北京艾德莱生物科技有限公司)是将PCR反应所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl₂以及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物。

2.依据实施例1的PCR扩增条件上样

3.反应结束后取5μL PCR扩增产物，2.0％的琼脂糖凝胶电泳(技术参数：2V/cm～5V/cm，电泳15min～30min)，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测结果。

每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。序列表说明：

SEQ ID NO.1是目标核苷酸片段的核苷酸序列，序列长度为209bp；

SEQ ID NO.2是扩增上述核苷酸片段的正向引物序列；

SEQ ID NO.3是扩增上述核苷酸片段的反向引物序列。

Claims (7)

1.兔特异性引物，其特征在于，该引物序列如下：

OCU-F：5′-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3′

OCU-R：5′-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3′。

2.含有权利要求1所述特异性引物的检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：Taq DNA MasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照DNA模板为兔科兔属的兔基因组DNA模板，所述双蒸水为空白对照。

5.权利要求1所述的兔特异性引物或权利要求2～4任一项所述的检测试剂盒在兔源性成分鉴定中的应用。

6.兔源性成分鉴定的PCR检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，并以兔DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。

7.根据权利要求6所述的PCR检测方法，其中步骤2)PCR扩增的反应体系如下：

PCR反应程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸13s，30次循环；4℃降温2min。