CN108676854A - 一种用于兔源性检测的实时荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、兔源性NADH6基因标准品、阴性对照品和阳性对照品。本发明通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测肉制品中兔源性含量的目的，具有快速、灵敏、特异性好的特点，对判断肉制品中兔源性含量具有重要意义。

Description

一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

近些年，出现很多关于肉制品造假的新闻，肉制品的肉源已经引起大众的关注。比如给猪肉涂上牛肉膏冒充牛肉，劣质鸭肉冒充肥羊肉，甚至有些不法商贩用劣质猫狗肉冒充羊肉制成羊肉串等等。生活中关于肉制品的质量问题已经成为人们的心头大患。肉制品的肉质来源成分的检测涉及到很多行业，比如肉制品的进出口贸易，国内肉制品加工工业、餐饮业等等，范围非常广泛。目前，对肉制品动物源中兔源成分的检验亟需非常关键的检测技术。

过去用于肉制食品中物种的鉴别主要依赖于电泳法、免疫法、ELISA等蛋白质分析法。这些技术对于加工混合肉制品却无法分析出，而PCR技术基于其反应时间短，具有较高灵敏性、特异性成为鉴别加工食品中物种的优先选择。但传统的PCR技术在定量和大批量检测中局限性较大。因此，急于发现一种新的技术可以精确地辨别物种并实现快速、大容量的实时定量检测。实时荧光定量PCR凭借其高灵敏度和特异性，可检测熟肉以及混合样本等特点，已逐步成为肉类成分鉴别的主流技术。近年来，国内外已有利用TaqMan探针法对不同肉类种属进行鉴别的报告。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、特异性好的用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒。

为解决上述问题，本发明所述的一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括

—PCR反应液，由12mM Tris-HCl（pH8.9）、100mM KCl、0.12%Triton X-100、0.12% 胆酸钠、0.6 mg/mL BSA、1.8mM MgCl₂、50nM dNTP、500nM 上游引物、500nM 下游引物、300nMTaqman探针组成；

其中上游引物序列为5'- CGAGTAATCTCAATAACAA-3'；下游引物序列为5'-TTGTTGGGTTTTCTTCTAA-3'；探针序列为5’-CCCCTAAAACGAATATACC-3’；

—酶混合液，由5U/µL Taq DNA聚合酶，50%甘油，20mM Tris-HCl (pH8.0, 25℃)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5% Tween^®20和0.5% NP-40组成；

—兔源性NADH6基因标准品，由1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml的重组质粒组成；

其中NADH6基因标准品序列为5’-CCAAACCTACCTCTATTAACACCCCTAAAACGAATATACCCAAAATCATAACATTCGATCCTCAAGTCTCAGGATACTCCTCAGTTGCCATCGCAG-3’；

—阴性对照品，由水组成；

—阳性对照品，由1.00×10⁷copies/ml的重组质粒组成。

所述探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明采用基因克隆技术，将兔源性DNA的NADH6基因种内保守片段插入到载体pMD18-T中，获得含有NADH6基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据兔源性NADH6的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。

2、本发明通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测肉制品中兔源性含量的目的，对判断肉制品中兔源性含量具有重要意义，必将在食品微生物检测领域发挥重要作用。

3、本发明快速、灵敏、特异性好。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明引物和探针体系优化实验结果。a代表引物为1.6ul，探针为1.6 ul；b代表引物为1.0ul，探针为1.6 ul；c代表引物为1.0ul，探针为0.8 ul；d代表引物为2.0ul，探针为0.8 ul；e代表引物为1.6ul，探针为0.8 ul；f代表引物为2.0ul，探针为1.0 ul；g代表引物为1.0ul，探针为0.8 ul；h代表引物为1.0ul，探针为1.0 ul；i代表引物为2.0ul，探针为1.6 ul。

图2为本发明灵敏度实验结果。a代表质粒浓度分别为1.00×10⁷copies/ml、b代表质粒浓度为1.00×10⁶copies/ml、c代表质粒浓度为1.00×10⁵copies/ml、d代表质粒浓度为1.00×10⁴copies/ml、e代表质粒浓度为1.00×10³copies/ml、f代表质粒浓度为1.00×10²copies/ml和阴性对照。

图3为本发明特异性实验结果。其中出现标准扩增曲线的为兔，未出现标准扩增曲线的为牛、羊、猪、鱼、鸡、鸭、鹅、鼠、驴、蛙、狗、阴性对照。

图4为本发明兔源性标准曲线。

具体实施方式

一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括

—PCR反应液，由12mM Tris-HCl（pH8.9）、100mM KCl、0.12%Triton X-100、0.12% 胆酸钠、0.6 mg/mL BSA、1.8mM MgCl₂、50nM dNTP、500nM 上游引物、500nM 下游引物、300nMTaqman探针组成；

其中上游引物序列为5'- CGAGTAATCTCAATAACAA-3'；下游引物序列为5'-TTGTTGGGTTTTCTTCTAA-3'；探针序列为5’-CCCCTAAAACGAATATACC-3’；

—酶混合液，由5U/µL Taq DNA聚合酶，50%甘油，20mM Tris-HCl (pH8.0, 25℃)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5% Tween^®20和0.5% NP-40组成；

—兔源性NADH6基因标准品，由1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml的重组质粒组成；

其中NADH6基因标准品序列为5’-CCAAACCTACCTCTATTAACACCCCTAAAACGAATATACCCAAAATCATAACATTCGATCCTCAAGTCTCAGGATACTCCTCAGTTGCCATCGCAG-3’（SEQ ID NO.2）；

—阴性对照品，由水组成；

—阳性对照品，由1.00×10⁷copies/ml的重组质粒组成。

其中：探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

下述实验例中所用方法如无特殊说明均为常规方法，所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。

实例1 NADH6基因标准品的制备

要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。动物线粒体DNA具有分子量小、结构保守、热稳定性好、不易降解的结构特点和母系遗传、拷贝数多、进化速度快、不发生重组的遗传特点，其中线粒体NADH6基因序列最为保守型。NADH6基因检测兔源性，有较高的敏感性和特异性。本部分主要采用PCR技术扩增兔源性NADH6基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-rabbit-NADH6，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。

一、模板DNA的制备

提取兔肝脏组织基因组DNA，用作NADH6基因PCR扩增的模板。

①取1.5g新鲜兔肝脏组织用液氮研磨成粉末，加到5ml离心管中，加入4ml SE缓冲液，混匀，4500 r/mim离心15min；

②吸取上清，4°C 12000 r/min离心20min，弃上清，收集沉淀；

③加入400μl Buffer Digestion ，震荡混匀。65℃水浴1-3h至细胞完全裂解（注意：1、水浴过程中，每10分钟颠倒混匀一次，可促进样品裂解。混合液变澄清透明为裂解完全。如溶液未变澄清，说明细胞裂解不彻底，应当延长水浴时间，否则将可能降低DNA的得率或导致提取的DNA不纯。2、如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20μl的Rnase A，室温放置2-5分钟）加入200ul Buffer PA，充分颠倒混匀，置于-20℃冰箱放置5min；

④4℃10000rpm离心5分钟，将上清转移至新管中；

⑤加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀-20℃，放置20min；

⑥4℃10000rpm离心10分钟，弃上清；

⑦加入1ml预冷的75%的乙醇，漂洗1-3min，4℃10000rpm离心2分钟，弃上清；

⑧开盖室温倒置10-20min，至残留的乙醇完全挥发。得到的DNA用30-50ul纯净水溶解；

⑨提取的DNA可进行下一步实验或－20℃保存。

二、NADH6基因片段的PCR扩增

1、引物的设计与合成

本发明通过对NCBI数据库中兔NADH6全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围引物。

所选取的扩增序列具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到469位所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.1

1 CGAGTAATCT CAATAACAAT AAAAATACTA ACAAATAAAG ATCAACCCGC AACAACCATC

61 AATCAACTAC CATAACTATA CAACGCCGCC ACCCCTATAG AATCCTCCCG GATTAATCCT

121 ACCTCGTCCC CTTCAAAAAC CACCCAATCC CCCATATTTT TAAAATCAAC CACAATCTCA

181 ACCCCATCAC TCATCACTAT ATACACAACC AAACCTACCT CTATTAACAC CCCTAAAACG

241 AATATACCCA AAATCATAAC ATTCGATCCT CAAGTCTCAG GATACTCCTC AGTTGCCATC

301 GCAGTAGTAT ACCCAAAAAC TACCAACATC CCCCCTAAAT AAATTAAAAA CATCATTAAA

361 CCTAAAAATG AACCCCCGAA ACTTAAAACA ATACCACACC CGACCCCACC ACTAACAATC

421 AACCCAAGCC CTCCATAAAT TGGTGATGGC TTAGAAGAAA ACCCAACAA

该外围引物序列如下：

上游引物：rabbitNADH 11F：5'-CGAGTAATCTCAATAACAA-3'

下游引物：rabbitNADH 461R：5'- TTGTTGGGTTTTCTTCTAA-3'

扩增片段大小为：469bp。

2、PCR反应体系和反应条件

以DNA为模板，以上述外围引物rabbitNADH 11F / rabbitNADH 461R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。PCR体系如表1。

表1

其中引物采用rabbitNADH 11F / rabbitNADH 461R，Taq酶采用北京百泰克Power TaqPlus DNA Polymerse，PCR扩增仪为北京百泰克iCycling系列96梯度PCR仪。

扩增程序/反应条件：

94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35个循环；72℃ 10min，取5μL扩增产物进行1%琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。

三、重组质粒pMD18-T-rabbit-NADH6的构建和转化

1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与pMD18-T（大连宝生物公司）进行连接，采用表2连接体系进行配制：

表2

配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。

、pMD18-T-rabbitNADH6质粒的转化以及PCR鉴定

从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻。

①取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟。

②42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min。

③向1.5ml EP管中加入预冷的400μl的LB液体培养基（不含氨苄青霉素）混匀后，37℃ 200转轻摇培养1h。

④将上述培养液摇匀后取100ul涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜。

⑤次日观察，从平板上挑取白色单克隆菌落于100μL LB液体培养基（含氨苄青霉素）的PCR管中，37°C振荡培养2-3小时。吸取2μL作为模板进行PCR鉴定，剩余的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇。

⑥用载体通用引物RV-M/M13-47扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。

引物RV-M/M13-47序列如下：

引物 RV-M: 5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

引物 M13-47: 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

体系如表3：

表3

扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。

采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。

实例2 实时荧光定量PCR检测兔源性方法的初步建立

一、特异性引物和探针的设计与合成

以上述选取的兔的NADH6基因的保守片段为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针。

作为本发明的核心，一组用于兔源性实时荧光PCR检测的引物和探针核苷酸序列如下：

上游引物：rabbitNADH 219F：5'- CCAAACCTACCTCTATTAAC-3'

下游引物：rabbitNADH 295R：5'- CTGCGATGGCAACTGAGGAG-3'

探针：rabbitNADH 240P: 5'- CCCCTAAAACGAATATACC-3'

该引物和探针扩增目标核苷酸序列为：

5’-CCAAACCTACCTCTATTAACACCCCTAAAACGAATATACCCAAAATCATAACATTCGATCCTCAAGTCTCAGGATACTCCTCAGTTGCCATCGCAG-3’

二、标准品的获取和定量

1、取将冻存的含有重组质粒pMD18-T- rabbitNADH6的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃ 200rpm过夜摇培。

2、取1ml培养过夜的菌液转种于30ml LB液体培养基，200rpm 增菌培养2-3小时，然后采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒。

3、利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可见分光光度计（ND5000）对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度。

4、质粒pMD18-T-rabbit-NADH6浓度（拷贝数）计算

（1）质粒的分子量=3161bp×660（每对碱基的平均分子量）

（2）测得质粒浓度为105.64ng/μl，质粒纯度A260/A280=1.89，A260/A230=1.95。因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml。

质粒 copies/ml=阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数

其中阿伏伽德罗常数=6.02×10²³copies/mol。

因此提取的质粒浓度copies/ml=105.64×10^-9g/ml×6.02×10²³copies/mol÷（3161bp×660g/bp•mol）=3.0×10¹⁰copies/ mol

10μl质粒+20μl的无菌水就得到浓度为1.00×10¹⁰copies/ml的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。

三、实时荧光定量PCR条件优化

以浓度为1.00×10⁶copies/ml的阳性质粒为模板，采用百泰克公司生产的2×real-time PCR Premixture（probe）实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，实验采用的实时荧光定量PCR仪为苏州百源基因技术有限公司的ASA-9600实时荧光定量PCR仪。反应体系采用20ul体系，其中引物和探针的量采用表4组合进行反应。

表4

反应条件：94℃预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。结果参照图1，数据显示20ul 体系时，引物（5uM）和探针（5uM）分别加入1.6μl，Ct值最小，荧光信号最强。

【方法评估】

1、灵敏度实验

将上述制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、1.00×10²copies/ml等作为梯度模板。反应体系如表5：

表5

反应条件：94℃预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果参照图2，数据显示当质粒浓度达到1.00×10³copies/ml时依然有荧光信号，但质粒浓度达到1.00×10²copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×10³copies/ml。

2、特异性实验

为了证实本发明对兔源性检测的特异性，我们选取了常见的11种动物做特异性实验，选取的动物包括：牛、羊、猪、鱼、鸡、鸭、鹅、鼠、驴、蛙、狗。

该特异性试验包括用上述样本的基因组DNA为模板进行的试验。反应体系如表6：

表6

反应条件：94℃预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果参考图3，具体结果仅兔组织检测为阳性，其余动物均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果如表7。

表7

3、标准曲线制备

以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标得到兔源性的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准，结果参考图4。标准曲线原始方程为y=a+bx，本次标准曲线的方程为y=42.3-3.35x。

<110>苏州百源基因技术有限公司

<120>一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒

<160>2

<210>1

<211>469

<212>DNA

1 CGAGTAATCT CAATAACAAT AAAAATACTA ACAAATAAAG ATCAACCCGC AACAACCATC

61 AATCAACTAC CATAACTATA CAACGCCGCC ACCCCTATAG AATCCTCCCG GATTAATCCT

121 ACCTCGTCCC CTTCAAAAAC CACCCAATCC CCCATATTTT TAAAATCAAC CACAATCTCA

181 ACCCCATCAC TCATCACTAT ATACACAACC AAACCTACCT CTATTAACAC CCCTAAAACG

241 AATATACCCA AAATCATAAC ATTCGATCCT CAAGTCTCAG GATACTCCTC AGTTGCCATC

301 GCAGTAGTAT ACCCAAAAAC TACCAACATC CCCCCTAAAT AAATTAAAAA CATCATTAAA

361 CCTAAAAATG AACCCCCGAA ACTTAAAACA ATACCACACC CGACCCCACC ACTAACAATC

421 AACCCAAGCC CTCCATAAAT TGGTGATGGC TTAGAAGAAA ACCCAACAA

<210>2

<211>96

<212>DNA

1 CCAAACCTAC CTCTATTAAC ACCCCTAAAA CGAATATACC CAAAATCATA ACATTCGATC

61 CTCAAGTCTC AGGATACTCC TCAGTTGCCA TCGCAG

Claims (2)

1.一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括

—PCR反应液，由12mM Tris-HCl、100mM KCl、0.12%Triton X-100、0.12% 胆酸钠、0.6mg/mL BSA、1.8mM MgCl₂、50nM dNTP、500nM 上游引物、500nM 下游引物、300nM Taqman探针组成；

其中上游引物序列为5'- CGAGTAATCTCAATAACAA-3'；下游引物序列为5'-TTGTTGGGTTTTCTTCTAA-3'；探针序列为5’-CCCCTAAAACGAATATACC-3’；

—酶混合液，由5U/µL Taq DNA聚合酶，50%甘油，20mM Tris-HCl，100mM KCl，0.1mMEDTA，1mM DTT，0.5% Tween^®20和0.5% NP-40组成；

—兔源性NADH6基因标准品，由1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml的重组质粒组成；

其中NADH6基因标准品序列为5’-CCAAACCTACCTCTATTAACACCCCTAAAACGAATATACCCAAAATCATAACATTCGATCCTCAAGTCTCAGGATACTCCTCAGTTGCCATCGCAG-3’；

—阴性对照品，由水组成；

—阳性对照品，由1.00×10⁷copies/ml的重组质粒组成。

2.如权利要求1所述的一种用于兔源性检测的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。