CN102453748A - 用于荧光定量pcr定量检测的质粒标准品 - Google Patents

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陈钊
莫敏俐
李隽�
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Abstract

本发明涉及用于荧光定量PCR定量检测的质粒标准品。具体地说，本发明涉及与基因突变、表达量及扩增检测相关的荧光定量PCR检测方法中定量检测需要的质粒标准品。

Description

用于荧光定量PCR定量检测的质粒标准品
技术领域
本发明涉及质粒。具体地说，本发明涉及用于荧光定量PCR定量检测的质粒标准品。
发明背景
荧光定量PCR最早是在1992年由日本科学家Higuchi报告提出的。是指在PCR反应体系中加入荧光基团，它在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物的变化，荧光信号变量和扩增产物变量成正比，并用足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析，最后通过标准曲线对未知模板进行分析，以达到对原始模板量定量的目的。
在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：绝对定量和相对定量两大种类[Walker NJ，J Biochem Mol Toxicol，2001，15(3)：121-127]。绝对定量是对未知样品的绝对量(拷贝数)进行测定的方法；而相对定量，并不是测定基因的绝对量，而是分别测定目的基因和内参基因的量，再根据内参的量对目的基因量进行归一化处理，最后再进行样品间相对量的比较。
绝对定量解析方法是使用已知浓度的标准品制作标准曲线，对未知浓度的样品进行绝对量(拷贝数)测定的方法。所以，绝对量(拷贝数)已知并含有未知样品序列的标准品是必要的。为了保持与实际检测样品间的扩增效率的一致性，标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品。经验证质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限稳定量的标准物质，并且纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效。甚至有学者将质粒标准分子称为“金标准物质”。
制作标准曲线首先必须准备4-6个梯度稀释的标准品，然后将这些标准品作为模板进行Real Time PCR反应，得到各自的Ct值，通过Ct值与起始模板浓度的对数值之间存在的线性关系，就能够制作出标准曲线。
尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因，这一点已得到普遍承认。癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就可出现。荧光定量PCR不但能有效地检测基因的突变，而且能准确测定表达量，据此进行肿瘤早期诊断，治疗和预后判断。对某些癌基因的遗传学变化的检测几乎达到了确诊肿瘤的程度。
本试验所用荧光定量PCR质粒载体具有以下优点：
1.制作处理过程简便，实验周期短，实验操作易于标准化。
2.价格适中，易于推广。
3.定量准确，这是本试剂方法最独特的优点。通过实时荧光PCR扩增曲线参数，定量测定样本中基因拷贝数。
4.减少人为实验误差。
发明内容
本发明要解决的问题是提供可供基因突变检测、表达量检测及基因扩增检测的阳性标准品。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
(1)构建一种质粒载体，其特征在于包括被检测的基因序列。
(2)上述(1)所述的质粒载体，其选自TA克隆载体，优选为pMD18-T。
(3)上述(1)所述的质粒载体，被检测的目的基因被整合到载体中。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例2所用质粒对照品构建方法示意图。
图2是本发明实施例2质粒图谱，箭头所指即为载体中插入基因PCR产物序列的位置。
图3是本发明实施例2的野生型质粒标准品测序结果图，其中图A是EGFR 18外显子2155G野生型质粒测序图，图B是EGFR19外显子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型质粒测序图，图C是EGFR 21外显子2573位T野生型质粒测序图。
图4是本发明实施例2的突变型质粒标准品测序结果图，箭头所指为碱基突变位点。其中图A是EGFR 18外显子2155G→A突变质粒测序图，图B是EGFR 19外显子2235-2249位缺失突变质粒测序图，图C是EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变质粒测序图，图D是EGFR 19外显子2254-2277位缺失突变质粒测序图，图E是EGFR 21外显子第21外显子2573位T→G突变质粒测序图。
图5是本发明实施例3KRAS野生型质粒测序图。
图6是本发明实施例3突变型质粒标准品测序结果图，箭头所指为碱基突变位点。其中图A是KRAS 12密码子GGT→GTT突变质粒测序图，图B是KRAS 12密码子GGT→AGT突变质粒测序图，图C是KRAS12密码子GGT→GAT突变质粒测序图，图D是KRAS 12密码子GGT→TGT突变质粒测序图，图E是KRAS 13密码子GGC→GAC突变质粒测序图。
图7是本发明实施例4BCRP野生型质粒测序图。
图8是本发明实施例4突变型质粒标准品测序结果图，箭头所指为碱基突变位点。其中图A是BCRP 482密码子AGG→GGG突变质粒测序图，图B是BCRP 482密码子AGG→ACG突变质粒测序图。
图9是本发明实施例5BRAF野生型质粒测序图。
图10是本发明实施例5突变型质粒标准品测序结果图，箭头所指为碱基突变位点。
图11是本发明实施例6ERCC1表达量检测质粒测序图。
图12是本发明实施例7RRM1表达量检测质粒测序图。
图13是本发明实施例8BRCA1表达量检测质粒测序图。
图14是本发明实施例9TUBB3表达量检测质粒测序图。
图15是本发明实施例10ERBB3表达量检测质粒测序图。
图16是本发明实施例11TOP2A表达量检测质粒测序图。
图17是本发明实施例12TYMS表达量检测质粒测序图。
图18是本发明实施例13RAP-80表达量检测质粒测序图。
图19是本发明实施例14VEGFR1表达量检测质粒测序图。
图20是本发明实施例15VEGFR2表达量检测质粒测序图。
图21是本发明实施例16HER2表达量检测质粒测序图。
图22是本发明实施例17EGFR表达量检测质粒测序图。
图23是本发明实施例18VEGF表达量检测质粒测序图。
图24是本发明实施例19PPN表达量检测质粒测序图。
图25是本发明实施例20CCNB2表达量检测质粒测序图。
图26是本发明实施例21ACTB表达量检测质粒测序图。
图27是本发明实施例2218S rRNA表达量检测质粒测序图。
图28是本发明实施例23HER2基因扩增检测质粒测序图。
图29是本发明实施例24ACTB基因扩增检测质粒测序图。
图30是本发明实施例25的质粒标准品扩增曲线图：其中图A1是EGFR 18外显子2155G野生型质粒标准品扩增曲线，图A2是EGFR 19外显子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型质粒标准品扩增曲线，图A3是EGFR 21外显子2573位T野生型质粒标准品扩增曲线，图A4是EGFR 18外显子2155G→A突变质粒标准品扩增曲线，图A5是EGFR 19外显子2235-2249位缺失突变质粒标准品扩增曲线，图A6是EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变质粒标准品扩增曲线，图A7是EGFR 19外显子2254-2277位缺失突变质粒标准品扩增曲线，图A8是EGFR 21外显子2573位T→G突变质粒标准品扩增曲线；图B1是KRAS野生型质粒标准品扩增曲线，图B2是KRAS 12密码子GGT→GTT突变质粒标准品扩增曲线，图B3是KRAS 12密码子GGT→AGT突变质粒标准品扩增曲线，图B4是KRAS 12密码子GGT→GAT突变质粒标准品扩增曲线，图B5是KRAS 12密码子GGT→TGT突变质粒标准品扩增曲线，图B6是KRAS 13密码子GGC→GAC突变质粒标准品扩增曲线；图C1是BCRP野生型质粒标准品扩增曲线，图C2是BCRP482密码子AGG→GGG突变质粒标准品扩增曲线，图C3是BCRP 482密码子AGG→ACG突变质粒标准品扩增曲线；图D1是BRAF野生型质粒标准品扩增曲线，图D2是BRAF 600密码子GTG→GAG突变质粒标准品扩增曲线。
图31是根据图30绘制的标准曲线图：其中图A1是EGFR 18外显子2155G野生型质粒标准品标准曲线，图A2是EGFR 19外显子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型质粒标准品标准曲线，图A3是EGFR 21外显子2573位T野生型质粒标准品标准曲线，图A4是EGFR 18外显子2155G→A突变质粒标准品标准曲线，图A5是EGFR19外显子2235-2249位缺失突变质粒标准品标准曲线，图A6是EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变质粒标准品标准曲线，图A7是EGFR 19外显子2254-2277位缺失突变质粒标准品标准曲线，图A8是EGFR 21外显子2573位T→G突变质粒标准品标准曲线；图B1是KRAS野生型质粒标准品标准曲线，图B2是KRAS 12密码子GGT→GTT突变质粒标准品标准曲线，图B3是KRAS 12密码子GGT→AGT突变质粒标准品标准曲线，图B4是KRAS 12密码子GGT→GAT突变质粒标准品标准曲线，图B5是KRAS 12密码子GGT→TGT突变质粒标准品标准曲线，图B6是KRAS 13密码子GGC→GAC突变质粒标准品标准曲线；图C1是BCRP野生型质粒标准品标准曲线，图C2是BCRP 482密码子AGG→GGG突变质粒标准品标准曲线，图C3是BCRP 482密码子AGG→ACG突变质粒标准品标准曲线；图D1是BRAF野生型质粒标准品标准曲线，图D2是BRAF 600密码子GTG→GAG突变质粒标准品标准曲线。
图32是本发明实施例25检测的组织样本EGFR 21外显子2573位野生型(图A1)与T→G置换突变型(图A2)荧光定量PCR扩增曲线图，组织样本EGFR 19外显子野生型(图A3)与2235-2249位缺失突变型(图A4)荧光定量PCR扩增曲线图，全血样本EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变型(图A5)荧光定量PCR扩增曲线图，全血样本EGFR 2254-2277位缺失突变型(图A6)荧光定量PCR扩增曲线图，细胞系样本EGFR 18外显子2155位野生型(图A7)与G→A置换突变型(图A8)荧光定量PCR扩增曲线图；石蜡包埋组织样本KRAS 12密码子野生型(图B1)与GGT→TGT突变型(图B2)荧光定量PCR扩增曲线图，新鲜组织样本KRAS 12密码子野生型(图B3)与GGT→GTT突变型(图B4)荧光定量PCR扩增曲线图，全血样本13密码子野生型(图B5)与GGC→GAC突变型(图B6)荧光定量PCR扩增曲线图，细胞系样本KRAS 12密码子野生型(图B7)与GGT→AGT突变型(图B8)荧光定量PCR扩增曲线图；石蜡包埋组织样本BCRP 482密码子野生型(图C1)与AGG→GGG突变型(图C2)荧光定量PCR扩增曲线图，新鲜组织样本BCRP 482密码子野生型(图C3)与AGG→ACG突变型(图C4)荧光定量PCR扩增曲线图，全血样本BCRP 482密码子野生型(图C5)与AGG→ACG突变型(图C6)荧光定量PCR扩增曲线图，细胞系样本BCRP 482密码子野生型(图C7)与AGG→GGG突变型(图C8)荧光定量PCR扩增曲线图；石蜡包埋组织样本BRAF 600密码子野生型(图D1)与GTG→GAG突变型(图D2)荧光定量PCR扩增曲线图，新鲜组织样本BRAF 600密码子野生型(图D3)与GTG→GAG突变型(图D4)荧光定量PCR扩增曲线图，全血样本BRAF 600密码子野生型(图D5)与GTG→GAG突变型(图D6)荧光定量PCR扩增曲线图，细胞系样本BRAF 600密码子野生型(图D7)与GTG→GAG突变型(图D8)荧光定量PCR扩增曲线图。
图33是本发明实施例26的质粒标准品扩增曲线图：其中图A1是ERCC1质粒标准品扩增曲线，图A2是RRM1质粒标准品扩增曲线，图A3是BRCA1质粒标准品扩增曲线，图A4是TUBB3质粒标准品扩增曲线，图A5是ERBB3质粒标准品扩增曲线，图A6是TOP2A质粒标准品扩增曲线，图A7是TYMS质粒标准品扩增曲线，图A1是ERCC1质粒标准品扩增曲线，图A8是RAP-80质粒标准品扩增曲线，图A9是VEGFR1质粒标准品扩增曲线，图A10是VEGFR2质粒标准品扩增曲线，图A11是HER2质粒标准品扩增曲线，图A12是EGFR质粒标准品扩增曲线，图A13是VEGF质粒标准品扩增曲线，图A14是PPN质粒标准品扩增曲线，图A15是CCNB2质粒标准品扩增曲线，图A16是ACTB质粒标准品扩增曲线，图A17是18S rRNA质粒标准品扩增曲线。
图34是根据图33绘制的标准曲线图：其中图A1是ERCC1质粒标准品标准曲线，图A2是RRM1质粒标准品标准曲线，图A3是BRCA1质粒标准品标准曲线，图A4是TUBB3质粒标准品标准曲线，图A5是ERBB3质粒标准品标准曲线，图A6是TOP2A质粒标准品标准曲线，图A7是TYMS质粒标准品标准曲线，图A1是ERCC1质粒标准品标准曲线，图A8是RAP-80质粒标准品标准曲线，图A9是VEGFR1质粒标准品标准曲线，图A10是VEGFR2质粒标准品标准曲线，图A11是HER2质粒标准品标准曲线，图A12是EGFR质粒标准品标准曲线，图A13是VEGF质粒标准品标准曲线，图A14是PPN质粒标准品标准曲线，图A15是CCNB2质粒标准品标准曲线，图A16是ACTB质粒标准品标准曲线，图A17是18S rRNA质粒标准品标准曲线。
图35是本发明实施例26检测的样本基因扩增曲线图，从左到右依次是18S rRNA、ACTB、ERCC1、TYMS、RRM1、BRCA1、TUBB3、TOP2A、PPN、VEGF、EGFR、CCNB2、VEGFR1、RAP-80、HER2、ERBB3、VEGFR2基因的扩增曲线。
图36是本发明实施例27的标准品扩增曲线图，其中图A是HER2质粒标准品扩增曲线，图B是ACTB质粒标准品扩增曲线。
图37是根据图36绘制的标准曲线图，其中图A是HER2质粒标准曲线，图B是ACTB质粒标准曲线，
图38是本发明实施例27的样本基因扩增曲线图，其中图A是石蜡包埋组织HER2扩增曲线图，图B是新鲜组织HER2扩增曲线图；图C是石蜡包埋组织ACTB扩增曲线图，图D是新鲜组织ACTB扩增曲线图。
实施例
以下的实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对发明人所认为的发明范围进行限制，亦非意指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第三版(SambrookJ.)，或按照厂商所建议的条件。
实施例1：人类细胞系、人类新鲜肿瘤组织、外周血、石蜡包埋组 织核酸提取与准备
1DNA或RNA提取
可以使用Qiagen公司、Promega公司、Roche公司的核酸提取试剂盒提取样本核酸，使用Gene公司Nanodrop ND1000型核酸微量测量仪检测所提核酸浓度与纯度：
DNA：OD260/OD280＝1.8±0.1，OD260/OD230＝2.0±0.1；
RNA：OD260/OD280＝2.0±0.1，OD260/OD230＝2.0±0.1。
2cDNA合成
逆转录采用M-MLV逆转录酶进行，步骤和反应体系如表1：
表1：逆转录体系(10μl)与步骤
Figure BSA00000306443400081
70℃变性5min，冰浴2-5min，加入以下成分
Figure BSA00000306443400082
37-42℃60-90min，70℃5min。
实施例2：EGFR突变检测阳性标准品的制备
1.野生型质粒构建(图1，图2)
1.1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
1.2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表4)：
表2：PCR反应体系(50μl)
Figure BSA00000306443400083
表3：PCR扩增条件
Figure BSA00000306443400091
引物名称引物序列
Figure BSA00000306443400092
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含野生型序列的标准品(图3)。
2.突变型质粒构建：设计突变点处的突变引物，利用DPN1法得到含突变型序列的标准品。
2.1根据希望得到的突变序列，设计突变点处的突变引物(表5)。
表5：突变引物
Figure BSA00000306443400101
2.2以5ng野生型质粒为模板，利用突变引物以及Pfu酶，突变目标位点。扩增体系与条件如表2、表3、表5。
在制备含EGFR基因第18外显子2155位G→A突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入E18-M-F(SEQ ID NO：14)与E18-M-R(SEQID NO：15)引物；在制备含EGFR基因第19外显子2235-2249位缺失突变型序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入E19-1-F(SEQ ID NO：16)与E19-1-R(SEQ ID NO：17)引物；在制备含EGFR基因第19外显子2236-2250位缺失突变型序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入E19-2-F(SEQ ID NO：18)与E19-2-R(SEQ ID NO：19)引物；在制备含EGFR基因第19外显子2254-2277位缺失突变型序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入E19-3-F(SEQ ID NO：20)与E19-3-R(SEQ IDNO：21)引物；在制备含EGFR基因第21外显子2573位T→G突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入E21-M-F(SEQ ID NO：22)与E21-M-R引物(SEQ ID NO：23)。
2.3利用DPN1酶对步骤2.2.得到的产物进行处理，37℃温育1小时后产物回收，在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得。
2.4利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
2.5将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含突变型序列的标准品(图4)。
实施例3：KRAS突变检测阳性标准品的制备
1.野生型质粒构建(图1，图2)
1.1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
1.2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表6)：
表6：PCR引物
Figure BSA00000306443400111
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含野生型序列的标准品(图5)。
2.突变型质粒构建：设计突变点处的突变引物，利用DPN1法得到含突变型序列的标准品。
2.1根据希望得到的突变序列，设计突变点处的突变引物(表7)。
表7：突变引物
Figure BSA00000306443400112
2.2以5ng野生型质粒为模板，利用突变引物以及Pfu酶，突变目标位点。扩增体系与条件如表2、表3、表7。
在制备含KRAS基因12密码子GGT→GTT突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入KRAS-1-F(SEQ ID NO：29)与KRAS-1-R(SEQ IDNO：30)引物；在制备含KRAS基因12密码子GGT→AGT突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入KRAS-2-F(SEQ ID NO：31)与KRAS-2-R(SEQ ID NO：32)引物；在制备含KRAS基因12密码子GGT→GAT突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入KRAS-3-F(SEQ IDNO：33)与KRAS-3-R(SEQ ID NO：34)引物；在制备含KRAS基因12密码子GGT→TGT突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入KRAS-4-F(SEQ ID NO：35)与KRAS-4-R(SEQ ID NO：36)引物；在制备含KRAS基因13密码子GGC→GAC突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入KRAS-5-F(SEQ ID NO：37)与KRAS-5-R(SEQ IDNO：38)引物。
2.3利用DPN1酶对步骤2.2.得到的产物进行处理，37℃温育1小时后产物回收，在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得。
2.4利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
2.5将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含突变型序列的标准品(图6)。
实施例4：BCRP突变检测阳性标准品的制备
1.野生型质粒构建(图1，图2)
1.1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
1.2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表8)：
表8：PCR引物
Figure BSA00000306443400131
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含野生型序列的标准品(图7)。
2.突变型质粒构建：设计突变点处的突变引物，利用DPN1法得到含突变型序列的标准品。
2.1根据希望得到的突变序列，设计突变点处的突变引物(表9)。
表9：突变引物
Figure BSA00000306443400132
Figure BSA00000306443400141
2.2以5ng野生型质粒为模板，利用突变引物以及Pfu酶，突变目标位点。扩增体系与条件如表2、表3、表9。
在制备含BCRP基因482密码子AGG→GGG突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入BCRP-1-F(SEQ ID NO：46)与BCRP-1-R(SEQID NO：47)引物；在制备含BCRP基因482密码子AGG→ACG突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入BCRP-2-F(SEQ ID NO：48)与BCRP-2-R(SEQ ID NO：49)引物。
2.3利用DPN1酶对步骤2.2.得到的产物进行处理，37℃温育1小时后产物回收，在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得。
2.4利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
2.5将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含突变型序列的标准品(图8)。
实施例5：BRAF突变检测阳性标准品的制备
1.野生型质粒构建(图1，图2)
1.1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
1.2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表10)：
表10：PCR引物
Figure BSA00000306443400151
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含野生型序列的标准品(图9)。
2.突变型质粒构建：设计突变点处的突变引物，利用DPN1法得到含突变型序列的标准品。
2.1根据希望得到的突变序列，设计突变点处的突变引物(表11)。
表11：突变引物
Figure BSA00000306443400152
2.2以5ng野生型质粒为模板，利用突变引物以及Pfu酶，突变目标位点。扩增体系与条件如表2、表3、表11。
在制备含BRAF基因600密码子GTG→GAG突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入BRAF-1-F(SEQ ID NO：55)与BRAF-1-R(SEQID NO：56)引物。
2.3利用DPN1酶对步骤2.2得到的产物进行处理，37℃温育1小时后产物回收，在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并抽提纯化。
2.4利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
2.5将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含突变型序列的标准品(图10)。
实施例6：ERCC1阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表12)：
表12：PCR引物
Figure BSA00000306443400161
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图11)。
实施例7：RRM1阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表13)：
表13：PCR引物
Figure BSA00000306443400171
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图12)。
实施例8：BRCA1阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表14)：
表14：PCR引物
Figure BSA00000306443400172
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图13)。
实施例9：TUBB3阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表15)：
表15：PCR引物
Figure BSA00000306443400181
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图14)。
实施例10：ERBB3阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表16)：
表16：PCR引物
Figure BSA00000306443400191
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图15)。
实施例11：TOP2A阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表17)：
表17：PCR引物
Figure BSA00000306443400192
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《(分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图16)。
实施例12：TYMS阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表18)：
表18：PCR引物
Figure BSA00000306443400201
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图17)。
实施例13：RAP-80阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表19)：
表19：PCR引物
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图18)。
实施例14：VEGFR1阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表20)：
表20：PCR引物
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图19)。
实施例15：VEGFR2阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表21)：
表21：PCR引物
Figure BSA00000306443400221
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图20)。
实施例16：HER2阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表22)：
表22：PCR引物
Figure BSA00000306443400231
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图21)。
实施例17：EGFR阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表23)：
表23：PCR引物
Figure BSA00000306443400232
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图22)。
实施例18：VEGF阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表24)：
表24：PCR引物
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图23)。
实施例19：PPN阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表25)：
表25：PCR引物
Figure BSA00000306443400251
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图24)。
实施例20：CCNB2阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表26)：
表26：PCR引物
Figure BSA00000306443400252
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图25)。
实施例21：ACTB表达量检测阳性标准品的准备(图1，图2)
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表27)：
表27：PCR引物
Figure BSA00000306443400261
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图26)。
实施例22：18S rRNA表达量检测阳性标准品的准备
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1制备的cDNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表28)：
表28：PCR引物
Figure BSA00000306443400262
Figure BSA00000306443400271
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图27)。
实施例23：HER2基因扩增检测阳性标准品的准备
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表29)：
表29：PCR引物
Figure BSA00000306443400272
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图28)。
实施例24：ACTB基因扩增检测阳性标准品的准备
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件见表(表2、表3、表30)：
表30：PCR引物
Figure BSA00000306443400281
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为阳性标准品(图29)。
实施例25：阳性质粒标准品在突变检测中的应用
1.制备不同浓度梯度的质粒标准品
将质粒标准品依次2倍稀释为5E-1ng/μl、2.5E-1ng/μl、1.25E-1ng/μl、6.25E-2ng/μl、3.125E-2ng/μl，作为荧光定量PCR反应的模板。
2.按照实施例1所述方法制备样品DNA
3.荧光定量PCR反应体系及反应条件(表31、表32)
检测不同的基因，反应体系中需加入相对应的引物(表4、表6、表8、表10)与探针(表33-表36)，其中标记探针荧光发射基团选自：FAM、TET、HEX、ROX；荧光淬灭基团选自：BHQ、TAMARA。
表31：荧光定量PCR反应体系(20μl/管)
Figure BSA00000306443400291
表32：扩增条件
Figure BSA00000306443400292
表33：EGFR突变荧光定量PCR检测探针
Figure BSA00000306443400293
Figure BSA00000306443400301
表34：KRAS突变荧光定量PCR检测探针
Figure BSA00000306443400302
表35：BCRP突变荧光定量PCR检测探针
Figure BSA00000306443400303
Figure BSA00000306443400311
表36：BRAF突变荧光定量PCR检测探针
突变检测根据突变类型的不同需要配制多种反应体系：例如检测BRAF基因600密码子突变情况，需要配置2个体系，除探针不同外，体系中所用的其他试剂是相同的，引物均为BRAF-F1(SEQ ID NO：51)或BRAF-F2(SEQ ID NO：52)与BRAF-R1(SEQ ID NO：53)或BRAF-R2(SEQ ID NO：54)。检测BRAF基因600密码子野生型基因，体系中需要加入BRAF-W-1(SEQ ID NO：167)或BRAF-W-2(SEQ ID NO：168)探针；检测BRAF基因600密码子GTG→GAG突变型基因，体系中需要加入BRAF-M-1(SEQ ID NO：169)或BRAF-M-2(SEQ ID NO：170)探针。
4.绘制标准曲线
根据步骤3中标准品所得CT值结果绘制标准曲线。图30为质粒标准品扩增曲线，在图中，上升的5条曲线自左到右依次分别代表依次十倍稀释的质粒标准品扩增曲线。横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。由此可进一步绘制用于计算的标准曲线(图31)。在图30中，横轴为模板拷贝数的对数值，纵轴为CT值。其中模板拷贝数＝质量/分子量×6.02×1023，本实验中质粒由pMD18-T载体与插入片段共同组成，由于插入片段碱基长度均为100bp左右，相对于pMD18-T载体很小，可以忽略，0.5ng/μl的质粒拷贝数为1010。
5.利用标准曲线计算样品基因突变比例
根据标准曲线，由样本的CT值求出反应的野生型与突变型基因组DNA的拷贝数，从而求得突变型DNA与DNA总量(该位点野生型加所有突变型)的比值。如图32所示测得某组织样本EGFR 21外显子野生型CT值为19.15，2573位T→G突变型为20.74，则由分别对应的标准曲线公式(图31)可以求得各自的拷贝数，由此可知突变型与野生型的含量之比为89∶100，推测组织中有约47％的EGFR基因发生2573位T→G突变。
实施例26：阳性质粒标准品在表达量检测中的应用
1.制备不同浓度梯度的质粒标准品
将质粒标准品依次10倍稀释为5E-1ng/μl、5E-2ng/μl、5E-3ng/μl、5E-4ng/μl，作为荧光定量PCR反应的模板。
2.按照实施例1所述方法制备样品cDNA
3.荧光定量PCR反应体系及反应条件(表31、表32)
检测不同的基因，反应体系中需加入相对应的引物(表12-表28)与探针(表37)，其中标记探针荧光发射基团选自：FAM、TET、HEX、ROX；荧光淬灭基团选自：BHQ、TAMARA。
表37：表达量荧光定量PCR检测探针
Figure BSA00000306443400331
表达量检测需要配制两种反应体系：目的基因反应体系与内参基因(ACTB或18S rRNA)反应体系。例如检测ERCC1基因表达，需要配制ERCC1检测体系与ACTB或18S rRNA检测体系：配制ERCC1检测体系时体系中需要加入ERCC1-F-1(SEQ ID NO：57)或ERCC1-F-2(SEQID NO：58)与ERCC1-R-1(SEQ ID NO：59)或ERCC1-R-2(SEQ IDNO：60)引物及ERCC1-P-1(SEQ ID NO：171)或ERCC1-P-1(SEQ IDNO：172)探针；配制ACTB检测体系时体系中需要加入ACTB-F-1(SEQID NO：117)或ACTB-F-2(SEQ ID NO：118)与ACTB-R-1(SEQ IDNO：119)或ACTB-R-2(SEQ ID NO：120)引物及ACTB-P-1(SEQ IDNO：201)或ACTB-P-1(SEQ ID NO：202)探针；配制18S rRNA检测体系时体系中需要加入18S-F-1(SEQ ID NO：121)或18S-F-2(SEQ IDNO：122)与18S-R-1(SEQ ID NO：123)或18S-R-2(SEQ ID NO：124)引物及18S-P-1(SEQ ID NO：203)或18S-P-1(SEQ ID NO：204)探针。
4.绘制标准曲线
根据步骤3中标准品所得CT值结果绘制标准曲线。图33为质粒标准品扩增曲线，在图中，上升的5条曲线自左到右依次分别代表依次十倍稀释的质粒标准品扩增曲线。横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。由此可进一步绘制用于计算的标准曲线(图34)。在图34中，横轴为模板拷贝数的对数值，纵轴为CT值。其中模板拷贝数＝质量/分子量×6.02×1023，本实验中质粒由pMD18-T载体与插入片段共同组成，由于插入片段碱基长度均为100bp左右，相对于pMD18-T载体很小，可以忽略，0.5ng/μl的质粒拷贝数为1010。
5.利用标准曲线计算样品基因的表达量
根据标准曲线，由样本的CT值求出反应的目的基因与内参基因的拷贝数，拷贝数的比值即目的基因相对于内参基因的表达量。如图35所示测得某组织样本ERCC1基因的CT值为14.98，ACTB基因的CT值为15.88，则由分别对应的标准曲线公式(图34)可以求得各自的拷贝数，由此可知样本中ERCC1的表达量为0.47，同理可以得到其它基因的拷贝数与表达量。
实施例27：阳性质粒标准品在基因组DNA基因扩增检测中的应用
1.制备不同浓度梯度的质粒标准品
将质粒标准品依次10倍稀释为5E-1ng/μl、5E-2ng/μ1、5E-3ng/μl、5E-4ng/μl，作为荧光定量PCR反应的模板。
2.按照实施例1所述方法制备样品DNA
3.荧光定量PCR反应体系及反应条件(表31、表32)
检测不同的基因，反应体系中需加入相对应的引物(表29、表30)与探针(表38)，其中标记探针荧光发射基团选自：FAM、TET、HEX、ROX；荧光淬灭基团选自：BHQ、TAMARA。
表37：基因扩增荧光定量PCR检测探针
Figure BSA00000306443400351
基因扩增检测需要配制两种反应体系：目的基因反应体系与内参基因(ACTB)反应体系：HER2扩增体系中需要加入O-HER2-F-1(SEQ IDNO：125)或O-HER2-F-2(SEQ ID NO：126)与O-HER2-R-1(SEQ IDNO：127)或O-HER2-R-2(SEQ ID NO：128)引物及HER2-P-1(SEQ IDNO：205)或HER2-P-2(SEQ ID NO：206)探针；ACTB扩增体系中需要加入ACTB-F-1(SEQ ID NO：129)或ACTB-F-2(SEQ ID NO：130)与ACTB-R-1(SEQ ID NO：131)或ACTB-R-2(SEQ ID NO：132)及ACTB-P-1(SEQ ID NO：207)或ACTB-P-2(SEQ ID NO：208)探针。
4.绘制标准曲线
根据步骤3中标准品所得CT值结果绘制绘制标准曲线。图36为质粒标准品扩增曲线，在图中，上升的5条曲线自左到右依次分别代表依次10稀释为5E-1ng/μl、5E-2ng/μl、5E-3ng/μl、5E-4ng/μl、5E-5ng/μl的质粒标准品的扩增曲线。横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。由此可进一步绘制用于计算的标准曲线(图37)。在图37中，横轴为模板拷贝数的对数值，纵轴为CT值。其中模板拷贝数＝质量/分子量×6.02×1023，本实验中质粒由pMD18-T载体与插入片段共同组成，由于插入片段碱基长度基本一致，最大的差距仅有二十几个碱基的长度，相对于PMD18-T载体2692bp的长度影响不大，所以HER2与ACTB质粒标准品的拷贝数之比≈质量之比。
5.标本HER2基因扩增计算
根据标准曲线，由样本的CT值求出反应的HER2与ACTB基因组DNA的拷贝数，HER2 DNA与ACTB DNA的比值即为HER2基因扩增量。如图38所示的石蜡包埋组织与新鲜组织HER2的CT值分别为21.05与23.40，内参基因ACTB的CT值分别为25.88与24.95，由分别对应的标准曲线公式(图37)可以求得各自的拷贝数，则所检测样本基因扩增量分别为281％与161％。
Figure ISA00000306443600011
Figure ISA00000306443600021
Figure ISA00000306443600031
Figure ISA00000306443600041
Figure ISA00000306443600051
Figure ISA00000306443600061
Figure ISA00000306443600071
Figure ISA00000306443600081
Figure ISA00000306443600091
Figure ISA00000306443600101
Figure ISA00000306443600111
Figure ISA00000306443600141
Figure ISA00000306443600151
Figure ISA00000306443600161
Figure ISA00000306443600171
Figure ISA00000306443600191
Figure ISA00000306443600201
Figure ISA00000306443600211
Figure ISA00000306443600221
Figure ISA00000306443600241
Figure ISA00000306443600251
Figure ISA00000306443600261
Figure ISA00000306443600281
Figure ISA00000306443600301
Figure ISA00000306443600331
Figure ISA00000306443600341
Figure ISA00000306443600351
Figure ISA00000306443600361
Figure ISA00000306443600371
Figure ISA00000306443600391
Figure ISA00000306443600401
Figure ISA00000306443600421
Figure ISA00000306443600431
Figure ISA00000306443600441
Figure ISA00000306443600451
Figure ISA00000306443600461
Figure ISA00000306443600481
Figure ISA00000306443600491
Figure ISA00000306443600501
Figure ISA00000306443600521
Figure ISA00000306443600531
Figure ISA00000306443600541
Figure ISA00000306443600571
Figure ISA00000306443600581
Figure ISA00000306443600591
Figure ISA00000306443600601
Figure ISA00000306443600621
Figure ISA00000306443600631
Figure ISA00000306443600641
Figure ISA00000306443600651
Figure ISA00000306443600661
Figure ISA00000306443600671

Claims (12)

1.一种荧光定量PCR检测用的质粒标准品，其特征在于，质粒的载体为pMD18-T，
并且质粒的插入片段，为以下(1)-(4)中任一种待检测的基因序列，分别用来检测对应基因的突变情况：
(1)EGFR 18、19、21外显子；
(2)KRAS 12、13密码子；
(3)BCRP 482位氨基酸；
(4)BRAF 600位氨基酸。
2.如权利要求1所述的质粒标准品，其特征在于，质粒的插入片段为：
(1)SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216；
(2)SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：222；
(3)SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：224、SEQ ID NO：225；
(4)SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：227。
3.如权利要求1所述的质粒标准品，其特征在于，制备与检测质粒的引物为：
(1)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23；
(2)SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38；
(3)SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49；
(4)SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56。
4.如权利要求1所述的质粒标准品，其特征在于，检测质粒的探针为：
(1)SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ IDNO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148；
(2)SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ IDNO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160；
(3)SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166；
(4)SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170。
5.一种荧光定量PCR检测用的质粒标准品，其特征在于，质粒的载体为pMD18-T，
并且质粒的插入片段，为以下(1)-(17)中任一种待检测的基因序列，分别用来检测对应基因的表达量情况：
(1)ERCC1 mRNA；
(2)RRM1 mRNA；
(3)BRCA1 mRNA；
(4)TUBB3 mRNA；
(5)ERBB3 mRNA；
(6)TOP2A mRNA；
(7)TYMS mRNA；
(8)RAP-80 mRNA；
(9)VEGFR1 mRNA；
(10)VEGFR2 mRNA；
(11)HER2 mRNA；
(12)EGFR mRNA；
(13)VEGF mRNA；
(14)PPN mRNA：
(15)CCNB2 mRNA；
(16)ACTB mRNA；
(17)18S rRNA。
6.如权利要求3所述的质粒标准品，其特征在于，质粒的插入片段为：
(1)SEQ ID NO：228；
(2)SEQ ID NO：229；
(3)SEQ ID NO：230；
(4)SEQ ID NO：231；
(5)SEQ ID NO：232；
(6)SEQ ID NO：233；
(7)SEQ ID NO：234；
(8)SEQ ID NO：235；
(9)SEQ ID NO：236；
(10)SEQ ID NO：237；
(11)SEQ ID NO：238；
(12)SEQ ID NO：239；
(13)SEQ ID NO：240；
(14)SEQ ID NO：241；
(15)SEQ ID NO：242；
(16)SEQ ID NO：243；
(17)SEQ ID NO：244。
7.如权利要求1所述的质粒标准品，其特征在于，制备与检测质粒的引物为：
(1)SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60；
(2)SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64；
(3)SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68；
(4)SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72；
(5)SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76；
(6)SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80；
(7)SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84；
(8)SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88；
(9)SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92；
(10)SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96；
(11)SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100；
(12)SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104；
(13)SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108；
(14)SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112；
(15)SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116；
(16)SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120；
(17)SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124。
8.如权利要求1所述的质粒标准品，其特征在于，检测质粒的探针为：
(1)SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172；
(2)SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174；
(3)SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176；
(4)SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178；
(5)SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180；
(6)SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182；
(7)SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184；
(8)SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186；
(9)SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188；
(10)SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190；
(11)SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192；
(12)SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194；
(13)SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196；
(14)SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198；
(15)SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200；
(16)SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202；
(17)SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204。
9.一种荧光定量PCR检测用的质粒标准品，其特征在于，质粒的载体为pMD18-T，
并且质粒的插入片段，为以下(1)-(17)中任一种待检测的基因序列，分别用来检测对应基因的表达量情况：
分别用来检测对应基因的基因扩增情况：
(1)HER2基因组DNA：
(2)ACTB基因组DNA。
10.如权利要求5所述的质粒标准品，其特征在于，质粒的插入片段为：
(1)SEQ ID NO：245；
(2)SEQ ID NO：246。
11.如权利要求1所述的质粒标准品，其特征在于，制备与检测质粒的引物为：
(1)SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128；
(2)SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132。
12.如权利要求1所述的质粒标准品，其特征在于，检测质粒的探针为：
(1)SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206；
(2)SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208。
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