CN1710102A - 一种肿瘤相关基因突变的pcr检测方法及试剂系统 - Google Patents
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Abstract
本发明属药物疗效检测技术领域，具体涉及一种肿瘤相关基因突变的PCR检测方法及试剂系统。更进一步，涉及一种与分子靶向抗癌药物疗效相关的EGFR和ras基因突变的TaqMan－MGB实时荧光定量PCR方法及其试剂系统。主要内容包括分子靶向抗癌药物疗效相关的特定突变位点，专门设计的特异性寡核苷酸引物序列和探针序列，测定流程方法，试剂系统和用途。试剂系统是指包含有发明所涉及的任何特异性寡核苷酸引物序列和探针的实时荧光定量PCR试剂系统。本发明可对肿瘤相关基因的特定位点的突变及其突变类型进行检测，用于分子靶向抗肿瘤新药的疗效预测和肿瘤患者的临床个体化用药方案的指导。
Description
技术领域
本发明属药物疗效检测技术领域，具体涉及一种肿瘤相关基因突变的PCR检测方法及试剂系统。更进一步，涉及一种与分子靶向抗癌药物疗效相关的EGFR和ras基因突变的TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法及其试剂系统。本发明可对肿瘤相关基因的特定位点的突变及其突变类型进行检测，用于分子靶向抗肿瘤新药的疗效预测和肿瘤患者的临床个体化用药方案的指导。
背景技术
现代生物医学研究表明，肿瘤的发病机制和治疗效果与肿瘤相关基因，即癌基因和抑癌基因的体细胞突变具有密切关系。肿瘤相关基因包括：EGFR(表皮生长因子受体)；VEGFR(血管内皮细胞生长因子受体)；ras基因家族；myc基因家族等。分子靶向药物是根据肿瘤细胞与正常细胞分子生物学特征差异而研发的，阻断肿瘤细胞信号转导途径的新型抗癌药物，如易瑞沙(Iressa)，阿瓦斯汀(Avastin)，格列卫(Glivec)，埃比特斯(Erbitux)，Tarceva等。靶向治疗药物有其特殊性，它并非对所有的患者均有效，它仅对部分有特殊基因突变或肿瘤标志物表达的患者有较好的疗效。如易瑞沙(Iressa)对EGFR突变的非小细胞肺癌患者有接近80％的有效率，对于没有EGFR突变的，则有效率很低。格列卫(Glivec)仅对有CD117的胃肠间质瘤有效，和赫塞汀亦主要对表达HER-2的患者有效。因而，在分子靶向治疗药物的临床用药之前，对适用的肿瘤个体患者给予药物疗效预测是非常重要的。本发明以分子靶向抗癌药物疗效相关的肿瘤相关基因如EGFR，ras的突变位点为检测靶点，使用高灵敏度的TaqMan-MGB(Taqman-大沟结合蛋白)反应系统，通过实时荧光定量PCR方法对个体肿瘤相关基因突变类型进行检测，并用于分子靶向抗癌药物对个体治疗疗效的预测。
EGFR基因定位于第7号染色体上，编码产物为P170的糖蛋白，属于受体型酪氨酸蛋白激酶。相当多的肿瘤细胞发生了EGFR基因突变，部分EGFR突变已经证实与肿瘤分子靶向抗癌药物的疗效有相关性。其中EGFR外显子18，外显子19，外显子21等的缺失突变和错配突变与抗癌新药Iressa的疗效关系密切。本发明针对上述突变位点，设计了成套特异性的扩增引物和TaqMan探针，建立了反应试剂系统和试剂盒，可以采用实时荧光定量PCR仪对不同肿瘤个体进行突变类型检测，从而预测肿瘤患者对易瑞沙(Iressa)的药物敏感性和治疗效果。
实时荧光定量PCR技术与常规PCR相比，特异性好，具有引物和探针的双重特异性，敏感度高，通常达102拷贝/ml，且线性范围很宽，为0-1011拷贝/ml，重复性好，以CT值为阈，更稳定精确地反映起始模板的拷贝数。可有效解决产物污染的风险。TaqMan-MGB荧光探针原理为PCR扩增时在加入一对引物的同时加入荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。其中的MGB探针技术则具有提高探针Tm(15mer提高18℃)和提高配对探针与非配对探针Tm差异的双重功能，使探针设计更短，具有更好的淬灭效果，明显降低背景荧光，提高信噪比。本发明基于以上技术原理，以EGFR等药物靶点基因为目的基因，自主设计建立了成套特异性寡核苷酸引物序列和探针系统和采用实时荧光定量PCR仪的肿瘤相关基因突变检测方法，应用于分子靶向抗癌药物的疗效预测。
发明内容
本发明的目的在于提出一种应用于医学诊断和分子靶向新药疗效筛选的肿瘤相关基因突变的PCR检测方法和试剂系统，尤其是基于TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR检测试剂和检测方法。
本发明提出的肿瘤相关突变基因的PCR检测方法，是以肿瘤相关基因为检测目的基因，使用专门设计的特异性寡核苷酸引物序列和探针，采用TaqMan-MGB检测试剂系统，通过实时荧光定量PCR方法，对肿瘤相关基因的特定位点突变进行检测。
本发明中所述的肿瘤相关基因是指：EGFR基因及其突变基因和ras基因及其突变基因。
所述的特异性寡核苷酸引物序列和探针如下：
引物序列至少包括下述之一种，以及由该引物序列采用任意标记方法或修饰方法而生成的寡核苷酸衍生物：
| 名称 | 寡核苷酸序列 |
| EGFR18S-FAM： | ACCGGAGCCCAGCAC |
| EGFR18S-TET： | CCGGAGCTCAGCACT |
| EGFR19S-FAM | AGGAATTAAGAGAAGCAAC |
| EGFR19S-TET | CTATCAAGAACATCTCCG |
| EGFR19S-1a-HEX | TCGCTATCAAAACATCT |
| EGFR19S-1b-HEX | CTATCAAGACATCTCCG |
| EGFR19S-2-FAM | CATCTCCGAAAGCCAA |
| EGFR19S-2-HEX | AAGCAACACTCGATGTGA |
| EGFR21S-FAM | TTTGGCCAGCCCAAA |
| EGFR21S-TET | TTTGGCCCGCCCAA |
| EGFR18-FP | TGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATT |
| EGFR18-RP | TGTGCCAGGGACCTTACCTTAT |
| EGFR19-FP | TTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAG |
| EGFR19-RP | AACTCACATCGAGGATTTCCTTGT |
| EGFR19-2-FP | AGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA |
| EGFR19-2-RP | GGGTGGGCCTGAGGTTCA |
| EGFR21-FP | TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT |
| EGFR21-RP | CCGCAGCATGTCAAGATCAC |
| ras-FP | CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT |
| ras-RP | AGCTGTATCGTCAAGGCACTCTT |
| ras-N1 | TGGAGCTGGTGGCGTA |
| ras-M1 | TGGAGCTTGTGGCGTAG |
| ras-M2 | TGGAGCTGTTGGCGTAG |
| ras-M3 | TTGGAGCTAGTGGCGTAG |
| Ras-M4 | ATCAAGGAATCGAAAGC |
探针至少包括下述之一种，以及由该探针采用任意标记方法或修饰修饰方法而生成的寡核苷酸衍生物：
| 名称 | 寡核苷酸序列及标记基团 |
| EGFR18-FAM： | FACCGGAGCCCAGCACP |
| EGFR18-TET： | 7CCGGAGCTCAGCACTP |
| EGFR19-FAM | FAGGAATTAAGAGAAGCAACP |
| EGFR19-TET | 7CTATCAAGAACATCTCCGP |
| EGFR19-1a-HEX | 6TCGCTATCAAAACATCTP |
| EGFR19-1b-HEX | 6CTATCAAGACATCTCCGP |
| EGFR19-2-FAM | FCATCTCCGAAAGCCAAP |
| EGFR19-2-HEX | 6AAGCAACACTCGATGTGAP |
| EGFR21-FAM | FTTTGGCCAGCCCAAAP |
| EGFR21-TET | 7TTTGGCCCGCCCAAP |
| ras-N1-FAM | FTGGAGCTGGTGGCGTAP |
| ras-M1-FAM | FTGGAGCTTGTGGCGTAGP |
| ras-M2-FAM | FTGGAGCTGTTGGCGTAGP |
| ras-M3-FAM | FTTGGAGCTAGTGGCGTAGP |
| Ras-M4-FAM | FATCAAGGAATCGAAAGCP |
其中，F代表FAM基团，P代表MGB基团，7代表TET基团，6代表HEX基团。
所述的突变位点包括：
(1)在EGFR基因(含基因组DNA和mRNA)的片段SEQ.ID.NO1中的突变位点：(＞表示错配突变，del表示缺失突变)
EGFR exon 18：2155G＞A
EGFR exon 19：2235_2249del GGAATTAAGAGAAGC
2236_2250del GAATTAAGAGAAGCA
2238_2255del ATTAAGAGAAGCAACATC
2239_2247del TTAAGAGAA
2240_2257del TAAGAGAAGCAACATCTC
2254_2277del TCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATC
2248 G＞C
2237 A＞T
EGFR exon 21：2573 T＞G
(2)ras基因片段(含基因组DNA和mRNA)的片段SEQ.ID.NO2中加下划线的三个核苷酸即GGT的任一核苷酸的任何缺失和错配突变。尤其特指：GGT＞TGT；GGT＞GTT；GGT＞AGT等突变。
本发明的所述的Taqman-MGB检测试剂系统是指包含有本方法所涉及的任何特异性寡核苷酸引物序列和探针的实时荧光定量PCR试剂系统，由下述组成一和组成二--四中任意一项或多项而构成。组成一--四具体如下：
组成一：Taqman-MGB实时荧光定量PCR试剂系统
(1)5XPCR反应缓冲液 含50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，100-500mmol/L KCl，0.5-25mmol/L MgCl2，25mmol/L的二硫苏糖醇，0.25-2.5％Triton X-100：
(2)dNTP 含0.6-15mmol/L各种dNTP；
(3)前向引物和后向引物 指按照本发明所涉及的引物序列所合成的引物，各种引物浓度范围：10-200μmol/L。
(4)探针 指按照本发明所涉及的探针序列所合成的探针，探针浓度范围10-200μmol/L；
(5)热启动DNA多聚酶 0.5-5U；
组成二：DNA提取试剂系统
可用于标本DNA抽提的酚/氯仿法，微量离心柱法或简化方法的试剂系统；
组成三：RNA提取试剂系统
可用于标本RNA抽提的异硫氰酸胍/酚/氯仿法，微量离心柱法或简化方法的试剂系统；
组成四：反转录反应试剂系统
采用M-MLV；AMV或其它具有反转录活性的酶类催化的反转录反应的试剂系统。
上述试剂系统可制成相应试剂盒。
本发明所涉及的EGFR和ras基因突变及其突变类型的检测方法的具体操作介绍如下：
本方法的检测标本种类
包括：手术标本，活检标本，外周血，胸腹水，石蜡包埋组织等
本方法的检测目标基因
包括：与分子靶向抗癌药物的疗效相关的肿瘤相关基因。具体则指：EGFR基因及其突变基因；ras基因及其突变基因。
本方法所涉及的设备
包括：台式高速离心机，超净工作台，荧光定量PCR仪等。
本发明方法的基本步骤：
1、标本的前处理及其DNA抽提
手术标本和活检标本
标本量：活检肿瘤标本或手术肿瘤标本5-50mg。研磨棒研磨组织后，采用下述方法之一抽提DNA：(1)酚/氯仿DNA纯化法，(2)微量离心柱法，(3)其它简化抽提法。或采用下述方法之一抽提RNA：(1)异硫氰酸胍/酚/氯仿总RNA纯化法，(2)微量离心柱法，(3)其它简化抽提法。
外周血和胸腹水
标本量：外周血0.5-3ml，胸腹水2-5ml。均使用柠檬酸钠抗凝。
外周血标本加入2-5倍体积的红细胞裂解液，混匀后冰浴10-20分钟。1000rpm离心5-15分钟。去上清。采用下述方法之一抽提DNA：(1)酚/氯仿DNA纯化法，(2)微量离心柱法，(3)其它简化抽提法。或采用下述方法之一抽提RNA：(1)异硫氰酸胍/酚/氯仿总RNA纯化法，(2)微量离心柱法，(3)其它简化抽提法。
胸腹水标本1000rpm离心5-10分钟后，去上清，保留约1ml残液。加入2-5倍体积的红细胞裂解液，混匀后冰浴10-20分钟。1000rpm离心5-15分钟。去上清。采用下述方法之一抽提DNA：(1)酚/氯仿DNA纯化法，(2)微量离心柱法，(3)其它简化抽提法。或采用下述方法之一抽提RNA：(1)异硫氰酸胍/酚/氯仿总RNA纯化法，(2)微量离心柱法，(3)其它简化抽提法。
石蜡包埋组织
标本量：3～10片5-10μm厚的石蜡包埋组织块切片。采用下述方法之一抽提DNA：
(1)改良酚/氯仿DNA纯化法。(2)Gpelz氏石蜡包埋组织DNA提取法。
2、标本RNA的逆转录反应
采用下述方法之一：(1)反转录酶M-MLV催化的任何cDNA合成方法。(2)反转录酶AMV催化的任何cDNA合成方法。(3)其它具有反转录活性的酶类催化的任何cDNA合成方法
3、Taqman-MGB实时荧光定量PCR方法
反应系统组分包含本发明所涉及的任何特异性寡核苷酸引物序列和探针的任何Taqman-MGB实时荧光定量PCR方法。
本发明使用的反应体系如下：
(1)PCR反应缓冲液 终浓度含10-50mmol/L Tris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，20-100mmol/L KCl，0.1-5mmol/L MgCl2，5mmol/L的二硫苏糖醇，0.05-0.5％TritonX-100。
(2)dNTP终浓度含0.02-0.5mmol/L各种dNTP
(3)前向引物和后向引物 终浓度含0.2-2μmol/L各种引物
(4)模板DNA 0.1-5μg模板DNA
(5)探针终浓度含0.2-2μmol/L探针
(6)热启动DNA多聚酶0.5-5U
扩增条件：实时荧光定量PCR仪，采用如下参数：
94℃，1-5分钟；94℃，1-5秒；60℃，5-30秒。35-50个循环。
本发明涉及的用途包括：
用途一 用于肿瘤相关基因的突变检测。肿瘤相关基因具体则指EGFR；VEGFR；ras；myc等。突变具体则指肿瘤相关基因的错配突变；缺失突变和插入突变。
用途二 用于分子靶向抗肿瘤物药的疗效预测。分子靶向抗肿瘤药物具体则指易瑞沙(Iressa)，阿瓦斯汀(Arastin)，格列卫(Glivec)，埃比特斯(Erbitux)，Tarceva等。
用途三 用于肿瘤患者的临床个体化用药方案的指导.具体来说，本发明用于判断肿瘤患者是否适宜于采用易瑞沙(Iressa)，阿瓦斯汀(Arastin)，格列卫(Glivec)，埃比特斯(Erbitux)，Tarceva等分子靶向抗肿瘤药物进行治疗。
具体实施方式
实施例1：纤维支气管镜标本和手术标本的基因组EGFR突变检测及其Iressa药物敏感性预测
(1)标本DNA抽提：酚/氯仿DNA纯化法。取纤维支气管镜肿瘤标本或手术肿瘤标本2-10mg，倒入液氮，磨成粉末，加1ml分离缓冲液(10mmol/L Tris·ClpH7.4，10mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA)；加0.1ml 10％SDS，混匀，此时样品变得很粘稠；加5ul或0.1mg蛋白酶K，37℃保温1-2小时，直到组织完全解体。加0.1ml 5mol/L NaCl，混匀，5000rpm离心数秒钟。取上清液于新离心管，用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提。待分层后，3000rpm离心5分钟。取上层水相至干净离心管，加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。移去上层乙醚，保留下层水相。加1/10体积3mol/L NaAc，及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。-20℃下静止10-20分钟，待DNA沉淀。5000rpm离心数秒钟，倒去上清。70％乙醇中漂洗后，吹干，溶解于0.1ml TE中，-20℃保存。
(2)常规PCR反应系统：
依次混匀下列试剂：
35μl H2O
5μl 10×PCR反应缓冲液
4μl 25mmol/L MgCl2
4μl 4种dNTP
0.5μl EGFR19 FP引物
0.5μl EGFR19 RP引物
0.5μl 模板DNA(约1ng)
混匀后离心5秒。
若扩增EGFR exon 21基因片段，则加EGFR21FP引物和EGFR21RP引物。
若扩增EGFR exon 18基因片段，则加EGFR18FP引物和EGFR18RP引物。
若扩增ras基因片段，则加rasFP引物和rasRP引物。
将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U)，混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
用94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
(3)Taqman-MGB实时荧光定量PCR检测突变：
使用下述反应体系：
5×PCR Buffer 5μl
dNTP Mixture 0.75μl
Mg Solution 0.5μl
EGFR19 FP引物 0.5μl
EGFR19 RP引物 0.5μl
探针EGFR19FAM(另一管为EGFR19TET) 0.6μl
Ex Taq HS 0.25μl
标本基因组DNA 1μl
dH2O 补充至25μl
若检测EGFR exon 21基因突变，则加EGFR21-FP引物，EGFR21-RP引物及探针EGFR-21FAM，EGFR21-TET。
若检测EGFR exon 18基因突变，则加EGFR18-FP引物，EGFR18-RP引物及探针EGFR18-FAM，EGFR18-TET。
若检测ras基因突变GGT＞TGT，则加ras-FP引物，ras-RP引物及探针ras-N1-FAM，ras-M1-TET。
若检测ras基因突变GGT＞GTT，则加ras-FP引物，ras-RP引物及探针ras-N1-FAM，ras-M2-TET。
若检测ras基因突变GGT＞AGT，则加ras-FP引物，ras-RP引物及探针ras-N1-FAM，ras-M3-TET。
扩增条件：
94℃，3min
94℃，5s→60℃，30s 50个循环。
检测结果：选取的40例基因组DNA(8例在EGFR21外显子处有突变，32例正常对照)，检测它们与EGFR21FAM、EGFR21TET的反应情况。在EGFR21外显子处有突变的8例基因组DNA与EGFR21FAM、EGFR21TET反应时均有特异性扩增曲线出现，32例正常对照仅与EGFR21TET反应时才出现扩增曲线。
检测结论：8例肿瘤标本的基因组DNA发生EGFR21外显子突变，对Iressa可能有良好的反应性。
实施例2：纤维支气管镜标本和手术标本的EGFR mRNA突变检测及其Iressa药物敏感性预测
(1)标本总RNA抽提：异硫氰酸胍/酚/氯仿总RNA纯化法。将纤维支气管镜标本和手术标本肿瘤组织在液氮中磨成粉末后，再以2-50mg组织加入1ml Trizol液研磨，研磨液室温放置5分钟，加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。取上层水相于一新的离心管，加0.5ml异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。弃去上清液，加入至少1ml 75％乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟。然后将RNA溶于水中，或贮存于70％乙醇并保存于-70℃。
(2)cDNA合成方法：M-MLV反转录法。取总RNA 2μg加随机引物0.5μL(100mg/L)，Rnasin 0.5μL(40uM/L)，加DEPC水至10μL.65℃水浴5min变性后，立即冰浴。再加5×M-MLV缓冲液6μL，5mmol/L dNTP 2μL，Rnasin0.5μL，M-MLV1μL(200Mu/L)，加DEPC水至30μL混匀.37℃60min水浴。反转录后95℃5min以破坏管中残余的酶，将反转录产物-20℃保存备用。
(3)常规PCR反应系统：
依次混匀下列试剂：
35μl H2O
5μl 10×PCR反应缓冲液
4μl 25mmol/L MgCl2
4μl 4种dNTP
0.5μl EGFR19 FP引物
0.5μl EGFR19 RP引物
0.5μl 反转录产物DNA(约1ng)
混匀后离心5秒。
若扩增EGFR exon 21基因片段，则加EGFR21FP引物和EGFR21RP引物。
若扩增EGFR exon 18基因片段，则加EGFR18FP引物和EGFR18RP引物。
若扩增ras基因片段，则加rasFP引物和rasRP引物。
将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U)，混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
用94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
(3)Taqman-MGB实时荧光定量PCR检测突变：
使用下述反应体系：
5×PCR Buffer 5μl
dNTP Mixture 0.75μl
Mg Solution 0.5μl
EGFR19 FP引物 0.5μl
EGFR19 RP引物 0.5μl
探针EGFR19FAM(另一管为EGFR19TET) 0.6μl
Ex Taq HS 0.25μl
反转录产物DNA 1μl
dH2O 补充至25μl
若检测EGFR exon 21基因突变，则加EGFR21FP引物，EGFR21RP引物及探针EGFR21FAM，EGFR21TET。
扩增条件：
94℃，3min
94℃，5s→60℃，30s 50个循环。
检测结果：选取的40例手术标本(DNA在EGFR21外显子处有突变，32例正常对照)，检测它们EGFR mRNA突变情况。在8例基因组EGFR21外显子处有突变的标本，其EGFR mRNA与EGFR21FAM、EGFR21TET反应时均有特异性扩增曲线出现。32例正常对照的EGFR mRNA仅与EGFR21TET反应时才出现扩增曲线。
检测结论：检测肿瘤标本EGFR mRNA突变的结果与检测肿瘤标本基因组EGFR的结果是一致的，同样可以用于Iressa敏感性预测。
实施例3：基因组DNA快速简化抽提法的EGFR突变检测及其Iressa药物敏感性预测
(1)标本DNA抽提：快速简化抽提法。取纤维支气管镜肿瘤标本或手术肿瘤标本约1mg，加入50μl含0.38mg/ml的蛋白酶K的TE缓冲液，60℃30分钟，100℃水浴15分钟，14000r/min离心2分钟后分别取0.5-1μl上清液作为PCR反应模板。
(2)常规PCR反应系统：同实施例1。
(3)Taqman-MGB实时荧光定量PCR检测突变：同实施例1。
实施例4：基因组DNA微量离心柱提取法EGFR突变检测及其Iressa药物敏感性预测
(1)标本DNA抽提：微量离心柱提取法。取纤维支气管镜肿瘤标本或手术肿瘤标本约1mg，加200μl组织裂解液，研磨。加200μl中和液，颠倒离心管数次。4℃下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。加异丙醇500μl充分混匀。加入微量离心柱，4℃下12000g离心1分钟。加洗涤液洗涤一次，加去蛋白液洗涤一次，微量离心柱移入新的离心管，加50μl TE缓冲液，静止1分钟后，4℃下12000g离心20秒离心1分钟。将离心管DNA贮于4℃或-20℃冰箱。
(2)常规PCR反应系统：同实施例1。
(3)Taqman-MGB实时荧光定量PCR检测突变：同实施例1。
实施例5：石蜡包埋组织ras基因突变检测
(1)石蜡包埋组织DNA抽提：改良酚/氯仿DNA纯化法。制备DNA。将甲醛固定、石蜡包埋的组织块切成8μm厚的薄片，取4～5片放入1.5ml Eppendorf管中。每管加入1.0ml二甲苯，振摇混匀30min，溶解石蜡。10000r/min离心5min，用干净滴管吸去上清，保留沉淀。重复加二甲苯步骤一次尽可能除去石蜡。然后加1.0ml无水乙醇，轻轻翻转混匀3min。10000r/min离心5min，除去上清。重复加无水乙醇尽可能除去二甲苯。最后干燥样品，使乙醇完全挥发。制备石蜡包埋组织DNA：(1)蛋白酶K消化：每管加100～200μl含SDS的细胞裂解缓冲液，同时加入蛋白酶K，使其终浓度为200μg/ml。65℃水浴数小时或过夜，不时震摇，至组织消化完全。(2)氯仿抽提：加入醋酸钾溶液，翻转混匀，4℃静置15min后，加入氯仿，充分震摇后10000r/min离心10min，将上清液转入一新的Ep管，沉淀弃去。(3)乙醇沉淀DNA：加3倍体积的冷无水乙醇至DNA溶液中，翻转混匀，在-20℃过夜、10000r/min离心10min。弃去上清，沉淀以70％乙醇洗涤，再离心弃去上清，将沉淀在室温中干燥。加入50μlTE(pH8.0)溶解DNA，待其完全溶解后，取少量样品以752紫外光栅分光光度计测定DNA含量及纯度，并作0.8％琼脂糖凝胶电泳观察，确定DNA的质量。
(2)Taqman-MGB实时荧光定量PCR检测ras基因突变，突变类型GGT＞TGT等：
使用下述反应体系：
5×PCR Buffer 5μl
dNTP Mixture 0.75μl
Mg Solution 0.5μl
ras-FP引物 0.5μl
ras-RP引物 0.5μl
探针ras-M1-FAM(另一管为ras-N1-FAM) 0.6μl
Ex Taq HS 0.25μl
反转录产物DNA 1μl
dH2O 补充至25μl
若检测ras基因突变GGT＞GTT，则加探针ras-M2-FAM。若检测ras基因突变GGT＞AGT，则加探针ras-M3-FAM。
若检测EGFR exon 21基因突变，则加EGFR21-FP引物，EGFR21-RP引物及探针EGFR-21FAM，EGFR21-TET。
若检测EGFR exon 18基因突变，则加EGFR18-FP引物，EGFR18-RP引物及探针EGFR18-FAM，EGFR18-TET。
扩增条件：
94℃，3min
94℃，5s→60℃，30s 50个循环。
检测结果：选取的20例石蜡包埋标本(10例正常对照)，检测它们ras突变情况。在10例基因组ras有突变的标本，其DNA分别与ras-M1-FAM、ras-M2-FAM、ras-M3-FAM、ras-M4-FAM反应时均有特异性扩增曲线出现。10例正常对照的ras DNA仅与ras-N1-FAM反应时才出现扩增曲线。
检测结论：石蜡包埋标本检测ras基因突变的结果与检测标本基因组ras突变类型是一致的，本法可以用于ras基因突变类型的检测。
序列表
SEQ.ID.NO.1：
2101 catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg gtggtggccc tggggatcgg
2161 cctcttcatg cgaaggcgcc acatcgttcg gaagcgcacg ctgcggaggc tgctgcagga
2221 gagggagctt gtggagcctc ttacacccag tggagaagct cccaaccaag ctctcttgag
2281 gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg ggctccggtg cgttcggcac
2341 ggtgtataag ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa
2401 ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg aagcctacgt
2461 gatggccagc gtggacaacc cccacgtgtg ccgcctgctg ggcatctgcc tcacctccac
2521 cgtgcagctc atcacgcagc tcatgccctt cggctgcctc ctggactatg tccgggaaca
2581 caaagacaat attggctccc agtacctgct caactggtgt gtgcagatcg caaagggcat
SEQ.ID.NO.2：
ATGACTGAATA TAAACTTGTG GTAGTTGGAG CT
GGTGGCGT AGGCAAGAGT GCCTTGACGA
TACAGCTAAT TCAGAATCAT TTTGTGGACG AATATGA TCC A ACA
Claims (4)
1、一种肿瘤相关基因突变的PCR检测方法，其特征在于以肿瘤相关基因为检测目的基因，使用专门设计的特异性寡核苷酸引物序列和探针，采用TaqMan-MGB检测试剂系统，通过实时荧光定量PCR方法，对肿瘤相关基因的特定位点突变进行检测；其中：
所述的肿瘤基因是指EGFR基因及其突变基因和ras基因及其突变基；
所述的特异性寡核苷酸引物序列和探针如下：
引物序列至少包括下述之一种，以及由该引物序列采用任意标记方法或修饰方法而生成的寡核苷酸衍生物：
名称
寡核苷酸序列
EGFR18S-FAM：
ACCGGAGCCCAGCAC
EGFR18S-TET：
CCGGAGCTCAGCACT
EGFR19S-FAM
AGGAATTAAGAGAAGCAAC
EGFR19S-TET
CTATCAAGAACATCTCCG
EGFR19S-1a-HEX
TCGCTATCAAAACATCT
EGFR19S-1b-HEX
CTATCAAGACATCTCCG
EGFR19S-2-FAM
CATCTCCGAAAGCCAA
EGFR19S-2-HEX
AAGCAACACTCGATGTGA
EGFR21S-FAM
TTTGGCCAGCCCAAA
EGFR21S-TET
TTTGGCCCGCCCAA
EGFR18-FP
TGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATT
EGFR18-RP
TGTGCCAGGGACCTTACCTTAT
EGFR19-FP
TTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAG
EGFR19-RP
AACTCACATCGAGGATTTCCTTGT
EGFR19-2-FP
AGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA
EGFR19-2-RP
GGGTGGGCCTGAGGTTCA
EGFR21-FP
TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT
EGFR21-RP
CCGCAGCATGTCAAGATCAC
ras-FP
CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT
ras-RP
AGCTGTATCGTCAAGGCACTCTT
ras-N1
TGGAGCTGGTGGCGTA
ras-M1
TGGAGCTTGTGGCGTAG
ras-M2
TGGAGCTGTTGGCGTAG
ras-M3
TTGGAGCTAGTGGCGTAG
Ras-M4
ATCAAGGAATCGAAAGC
探针至少包括下述之一种，以及由该探针采用任意标记方法或修饰修饰方法而生成的寡核苷酸衍生物：
名称
寡核苷酸序列及标记基团
EGFR18-FAM：
FACCGGAGCCCAGCACP
EGFR18-TET：
7CCGGAGCTCAGCACTP
EGFR19-FAM
FAGGAATTAAGAGAAGCAACP
EGFR19-TET
7CTATCAAGAACATCTCCGP
EGFR19-1a-HEX
6TCGCTATCAAAACATCTP
EGFR19-1b-HEX
6CTATCAAGACATCTCCGP
EGFR19-2-FAM
FCATCTCCGAAAGCCAAP
EGFR19-2-HEX
6AAGCAACACTCGATGTGAP
EGFR21-FAM
FTTTGGCCAGCCCAAAP
EGFR21-TET
7TTTGGCCCGCCCAAP
ras-N1-FAM
FTGGAGCTGGTGGCGTAP
ras-M1-FAM
FTGGAGCTTGTGGCGTAGP
ras-M2-FAM
FTGGAGCTGTTGGCGTAGP
ras-M3-FAM
FTTGGAGCTAGTGGCGTAGP
Ras-M4-FAM
FATCAAGGAATCGAAAGCP
其中，F代表FAM基团，P代表MGB基团，7代表TET基团，6代表HEX基团.
2、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述TaqMan-MGB检测试剂系统由下述组成一和组成二到四中任意一项或多项构成：
组成一：Taqman-MGB实时荧光定量PCR试剂系统
(1)5X PCR反应缓冲液 含50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，100-500mmol/L KCl，0.5-25mmol/L MgCl2，25mmol/L的二硫苏糖醇，0.25-2.5％TritonX-100；
(2)dNTP 含0.6-15mmol/L各种dNTP；
(3)前向引物和后向引物 由所述引物序列所合成的引物，各种引物浓度范围：10-200μmol/L；
(4)探针 由所述探针序列所合成的探针，探针浓度范围10-200μmol/L；
(5)热启动DNA多聚酶 0.5-5U；
组成二：DNA提取试剂系统
用于标本DNA抽提的酚/氯仿法、微量离心柱法或简化方法的试剂系统；
组成三：RNA提取试剂系统
用于标本RNA抽提的异硫氰酸胍/酚/氯仿法、微量离心柱法或简化方法的试剂系统；
组成四：反转录反应试剂系统
采用M-MLV；AMV或其它具有反转录活性的酶类催化的反转录反应的试剂系统。
3、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的基因突变位点包括：
(1)EGFR exon 18：2155 G＞A
EGFR exon 19：2235-2249del GGAATTAAGAGAAGC
2236-2250del GAATTAAGAGAAGCA
2238-2255del ATTAAGAGAAGCAACATC
2239-2247del TTAAGAGAA
2240-2257del TAAGAGAAGCAACATCTC
2254-2277del TCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATC
2248 G＞C
2237 A＞T
EGFR exon 21：2573 T＞G
其中，＞表示错配，del表示缺失，数字表示位点；
(2)ras 基因片段ATGACTGAATA TAAACTTGTG GTAGTTGGAG CT
GGTGGCGT
AGGCAAGAGT GCCTTGACGA TACAGCTAAT TCAGAATCAT TTTGTGGACG
AATATGATCCA ACA中加下划线的三个核苷酸
GGT的任一核苷酸的任何缺失和错配突变，尤其特指：GGT＞TGT；GGT＞GTT；GGT＞AGT等突变。
4、一种肿瘤相关基因突变的PCR检测试剂系统，其特征在于由下述组成一和组成二到四中任意一项或多项构成：
组成一：Taqman-MGB实时荧光定量PCR试剂系统
(1)5X PCR反应缓冲液 含50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，100-500mmol/L KCl，0.5-25mmol/L MgCl2，25mmol/L的二硫苏糖醇，0.25-2.5％TritonX-100；
(2)dNTP 含0.6-15mmol/L各种dNTP；
(3)前向引物和后向引物 所述引物序列所合成的引物，各种引物浓度范围：10-200μmol/L；
(4)探针 所述探针序列所合成的探针，探针浓度范围10-200μmol/L；
(5)热启动DNA多聚酶 0.5-5U；
组成二：DNA提取试剂系统
用于标本DNA抽提的酚/氯仿法、微量离心柱法或简化方法的试剂系统；
组成三：RNA提取试剂系统
用于标本RNA抽提的异硫氰酸胍/酚/氯仿法、微量离心柱法或简化方法的试剂系统；
组成四：反转录反应试剂系统
采用M-MLV；AMV或其它具有反转录活性的酶类催化的反转录反应的试剂系统。
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| CN 200510026931 CN1710102A (zh) | 2005-06-20 | 2005-06-20 | 一种肿瘤相关基因突变的pcr检测方法及试剂系统 |
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- 2005-06-20 CN CN 200510026931 patent/CN1710102A/zh active Pending
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