CN101463390B - Egfr基因外显子20突变的检测探针、液相芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种EGFR基因外显子20突变的检测探针、液相芯片及其检测方法。所述EGFR基因外显子20突变的液相芯片，包括有：包被有探针的微球：包被有碱基序列选自于SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6任一种的、针对外显子20野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：12任一种的、针对外显子20突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；以及用于扩增出具有外显子20突变位点的目标序列的引物。本发明所提供的方法快速，准确，操作简便，大大提高检测效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的是涉及EGFR基因外显子20突变的检测探针、液相芯片及其检测方法。
背景技术
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，为ErbB家族的四个成员之一，因此又名HER1或ErbB1。EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，为以EGFR为靶向的肿瘤治疗和针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。因此，以表皮生长因子受体(EGFR)为治疗靶标的分子靶向治疗成为国内外肿瘤界关注的焦点。其中，EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)吉非替尼(Genfitinib，Irressa)和厄洛替尼(Erlotinib，特罗凯，Tarceva)已被美国食品药品监督管理局批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。我国在2005年2月也批准了吉非替尼进入临床。这些药物用于其他肿瘤(如乳腺癌、结肠癌和胃癌等)的治疗，目前也已经进入临床试验阶段。吉非替尼，厄洛替尼是一种口服的小分子EGFR拮抗剂，可与ATP竞争结合EGFR酪氨酸激酶区的ATP结合袋从而抑制EGFR的活性，已应用于晚期和不适宜传统化疗方案的非小细胞肺癌患者的临床治疗，是目前对于部分NSCLC患者治疗最有效的药物。
尽管在EGFR突变的NSCLC中，吉非替尼、厄洛替尼可以达到较好的效果，但开始治疗后6～12个月发生的耐药明显限制了患者生存时间的延长。近来研究提示，EGFR外显子20的插入性突变(D770-N771)可以使受体对EGFR-TKI的敏感性降低100倍，临床上也发现具有此突变的患者对EGFR-TKI治疗反应不明显。EGFR基因外显子20上的T790M突变大多数导致获得性耐药，也与原发耐药相关。T790M突变与其他敏感性突变如L585R同时存在时，癌症细胞对EGFR-TKI也是抵抗的。在未治疗的NSCLC患者中，T790M突变与性别、是否吸烟或组织学状态无关，但更常见于晚期患者；而且7例对TKI治疗无反应得患者中，3例与敏感性突变同时存在。在开始对吉非替尼、厄洛替尼有反应但后来复发的患者(具有EGFR突变)中，存在EGFR外显子20的继发性突变-T790M，耐药的原因是突变导致EGFR结构发生变化，使TKI与其结合出现位阻效应。一些研究这认为，药物治疗之前T190M突变细胞即在患者体内存在，当细胞暴露于TKI后，由于耐药而发挥选择作用，使T790M突变细胞数目明显增多，由此说明原发耐药和继发耐药的区别可能是T790M突变细胞的多少差异。
在TKI治疗后复发的NSCLC中有50％的患者发现有T790M突变，因此，检测EGFR外显子20基因有无突变，是临床非小细胞肺癌诊断治疗的一个重要辅助工具，可准确预测分子靶向药物治疗的有效性，便于临床准确用药，显著提高药物疗效，使病人最大限度地受益，同时可以避免不合理用药所造成的病人医疗费用增加和社会医疗资源浪费，减少不必要治疗的时效损失以及经济损失。
目前，EGFR(酪氨酸激酶区)基因突变的检测标准是组织DNA样本的直接测序。该方法由Lynch等和Pacz等率先报道，优点是可以确切了解EGFR基因突变的范围和类型，并且基因突变与吉非替尼临床疗效的关系已得到肯定。然而，基因测序作为临床常规诊断方法也存在不少障碍，有待排除。首先，微量组织标本的检测困难。组织DNA经PCR扩增后进行基因测序，DNA需要量至少在100ng以上。目前检测EGFR基因突变的标本主要取自术后的组织样本，然而70％-80％的癌症患者在确诊时已难以进行根治性手术切除，无法获得组织标本进行EGFR基因突变测定。晚期癌症病人唯一能够获得组织的途径是穿刺活检，但肿瘤穿刺活检组织的样本很少，通常仅含数万个细胞，因而微量组织标本的EGFR基因检测相当困难。这类标本的EGFR基因检测国内还没有成功的报道。其次，肿瘤穿刺活检手术仅适用部分病人，标本采集的难度较大。晚期肿瘤多处于破裂出血的高危状态，穿刺活检作为一种损伤性手术存在一定的医疗风险，并且相当一部分病人由于病灶所处的特殊解剖部位(如脑转移、病灶邻近心脏及大血管等)而不适宜进行这种手术，导致不能提供肿瘤组织进行基因诊断。最后，该方法对技术的要求高、结果判读耗时费力。基因测序虽然是最直观、准确的检测方法，可以明确诊断突变的范围及其类型，但其检测周期长，从收到待检样品到顺利完成检测发出报告，需要连续的15-21小时。如以正常工作时间进行检测，实际至少需要3个工作日才能发出检测结果报告，因此，难以满足指导临床用药时效性的要求。因此，建立一种采样方便、病人痛苦小、特异性好、灵敏度高、准确快速、简便易行且无需组织标本的EGFR基因突变诊断方法是NSCLC患者应用EGFR TKIs治疗需要解决的重要问题。
此外，由于肿瘤的异质性，游离核酸中可能仅有非常小量的突变基因，而含有大量的野生型基因，混杂大量野生型基因会阻碍突变基因的检出，因此如何排除野生型序列对检测的干扰是首要解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供用于EGFR基因外显子20突变检测的探针序列。
实现上述目的的技术方案如下：
用于EGFR基因外显子20突变检测的探针：包括有
选自于SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6任一种的、针对外显子20引入酶切位点BstUI的野生型探针，和选自于SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：12任一种的、针对外显子20引入酶切位点BstUI的突变型探针。
本发明的另一目的是提供EGFR基因外显子20突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检测EGFR基因外显子20上的相关突变，从而可用于预测吉非替尼，厄罗替尼等药物治疗疗效。
实现上述目的的技术方案如下：
一种EGFR基因突变检测液相芯片，主要包括有：(A)包被有探针的微球：包被有碱基序列选自于SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6任一种的、针对外显子20野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：12任一种的、针对外显子20突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；以及
(B)用于扩增出具有外显子20突变位点的目标序列的引物，该引物带有酶切位点，且该目标序列的末端具有生物素标记。
优选地，(A)包被有探针的微球为：包被有碱基序列选自于SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3任一种的、针对外显子20野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQ IDNO：7～SEQ ID NO：9任一种的、针对外显子20突变型的氨基修饰探针的微球。
以上所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性环境中的序列。通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-30个T，更优选为10个T。
优选地，用于扩增出具有外显子20突变位点的目标序列的引物包括有SEQ ID NO：13～SEQ ID NO：15引物序列，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。
本发明的另一目的还在于提供一种EGFR基因外显子20突变的检测方法，该方法具有快速、准确、操作简便等优点。
一种EGFR基因外显子20突变的检测方法，使用上述的EGFR基因外显子20突变检测液相芯片，包括以下步骤：
(1)用带有酶切位点的PCR引物对野生型和突变型的标本进行第一轮PCR扩增；
(2)将步骤(1)中的PCR扩增后的产物进行酶切；
(3)以酶切后的产物为模板进行对突变型的EGFR基因进行第二轮PCR扩增，得到具有外显子20突变位点的目标PCR扩增后产物，且产物的末端具有生物素标记；
(4)第二轮PCR扩增产物与上述相应的包被有探针的微球进行杂交；
(5)杂交反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，然后进行信号检测。
本发明的主要优点在于：
(1)采用本发明提供的EGFR基因外显子20突变检测液相芯片，检测时的反应条件均一，检测结果特异性好，灵敏度高，检测准确度达99％以上。
(2)本发明的检测方法步骤简单，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。
(3)本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。
(4)本发明采用“引入酶切位点，然后酶切富集”的方法进行目标序列的PCR扩增进而用于检测，避免了产物中大量野生型序列对检测结果所造成的干扰。
(5)本发明所提供的液相芯片、检测方法不仅能检测肿瘤组织样本中的EGFR基因突变，同时也能检测肿瘤病人体液中的EGFR基因突变，从而具有采样方便、病人痛苦小、能够动态监测的优势。
附图说明
图1是BstUI的酶切富集突变型示意图。
具体实施方式
本申请人已开发的EGFR外显子19和外显子21项目是通过内切先去除大量的野生型基因，然后用PCR去扩增突变型基因。但因为EGFR外显子20基因的突变位点处没有相应的酶切位点可以把野生型有目的的去除。本发明首次采用通过PCR技术在突变区引入酶切位点的方法，然后通过酶切来去除野生型，从而达到富集突变型序列的目的。
(1)1stPCR引入酶切位点：EGFR外显子20存在一种突变型：T790M(ACG-＞ATG)。在密码子790处引入酶切位点是通过把密码子791处第二位的“A”突变为“G”，从而引入BstUI(CGCG)的酶切位点[2]。设计一对引物，扩增约105bp的片段来富集含有密码子790的片段，通过酶切可以去除野生型，富集突变型。(见图1)
(2)2nd PCR进一步富集突变型的EGFR外显子20基因：为了进一步富集突变型的EGFR外显子20基因和进行下游液相芯片技术的检测，经过酶切去除野生型EGFR外显子20基因后，我们将进行第二轮的PCR对突变型的EGFR外显子20基因进行扩增。
(3)用液相芯片技术检测突变型的EGFR外显子20基因。
本发明需要用到的主要材料
溶液配方：偶联液(pH4.5)：0.1mol/L MES(Sigma M-2933)
洗涤液：0.2ml/LTween-20(SigmaP-9416)，1g/L SDS(SigmaL-4390)
TE(pH8.0)(储存液)：10mmol/L Tris(Sigma 337501)，1mmol/L EDTA(Sigma E-5134)2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5MNaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
实施例1EGFR基因外显子20突变检测液相芯片试剂盒的制备
一、探针序列设计及微球包被
针对EGFR外显子20的野生型与突变型序列，设计特异的寡核苷酸探针，包括碱基序列为SEQ.ID NO：1-6的、针对外显子20野生型的探针，和SEQ.ID NO：7-12的、针对外显子20突变型的探针，其中，SEQ.ID NO：4-6分别是SEQ.ID NO：1-3的反向互补序列，SEQ IDNO：10-12分别是SEQ ID NO：7-9的反向互补序列。
每种微球包被的具体步骤如下：
(1)取微球母液(购自Luminex公司)涡漩震荡成微球悬液；
(2)取出8ul微球母液，共含0.8×105-1.2×105个微球至0.5ml离心管中；
(3)10,000rpm离心3min，弃去上清液；
(4)加入10ul偶联液(pH4.5)，充分混匀；
(5)加入2pmol/ul探针工作液2ul；
(6)加入2.5ul浓度为5mg/ml的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐)工作液，25℃孵育30min；重复该步骤一次；
(7)加入0.2ml洗涤液，充分混匀，12,000g离心3min，弃去上清液；重复该步骤一次；
(8)加入500ulTE溶液，充分混匀；
(9)12,000g离心3min，弃去上清液；
(10)加入20ulTE溶液，储存于2-8℃。
制备得到的EGFR基因外显子20突变检测液相芯片试剂盒包括有：六种包被有野生型探针的微球和六种包被有突变型探针的微球，使用时选择其中的一对包被有野生型探针和突变型探针的微球液相芯片既可用于检测。
A.包被探针的微球，每种微球包被的探针的碱基序列如下：
| 微球号 | 探针名称 | 引入酶切位点(BstUI)后的探针碱基序列 | SEQ.IDNO： |
| 28 | E20W1(野生型) | 5’NH2-TTTTTTTTTTCATGAGCCGCGTGATGAGCT3’ | 1 |
| 63 | E20W2(野生型) | 5’NH2-TTTTTTTTTTGGCATGAGCCGCGTGATGAG3’ | 2 |
| 38 | E20W3(野生型) | 5’NH2-TTTTTTTTTTATGAGCCGCGTGATGAGCTG3’ | 3 |
| 16 | E20W4(野生型) | 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCTCATCACGCGGCTCATG3’ | 4 |
| 12 | E20W5(野生型) | 5’NH2-TTTTTTTTTTCTCATCACGCGGCTCATGCC3’ | 5 |
| 53 | E20W6(野生型) | 5’NH2-TTTTTTTTTTCAGCTCATCACGCGGCTCAT3’ | 6 |
| 22 | E20M1(ACG-＞ATG) | 5’NH2-TTTTTTTTTTGGCATGAGCCGCATGATGAG3’ | 7 |
| 25 | E20M2(ACG-＞ATG) | 5’NH2-TTTTTTTTTTGCATGAGCCGCATGATGAGCT3’ | 8 |
| 36 | E20M3(ACG-＞ATG) | 5’NH2-TTTTTTTTTTATGAGCCGCATGATGAGCTGC3’ | 9 |
| 14 | E20M4(ACG-＞ATG) | 5’NH2-TTTTTTTTTTCTCATCATGCGGCTCATGCC3’ | 10 |
| 30 | E20M5(ACG-＞ATG) | 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCTCATCATGCGGCTCATGC3’ | 11 |
| 51 | E20M6(ACG-＞ATG) | 5’NH2-TTTTTTTTTTGCAGCTCATCATGCGGCTCAT3’ | 12 |
B.引物：用于扩增出富集有EGFR基因外显子20需检测的相应突变位点的目标序列的引物，且扩增出的目标序列的末端可具有生物素标记，每种引物的碱基序列如下：
| 引物名称 | 碱基序列 | 一轮或二轮PCR | SEQ.ID NO： |
| E790R | 5’GCCGAAGGGCATGAGCCGC 3’ | 一轮及二轮 | 13 |
| E790F | 5’GAAGCCTACGTGATGGCCAG 3’ | 一轮 | 14 |
| E790F-bio | 5’biotin-TACGTGATGGCCAGCGTGGA 3’ | 二轮 | 15 |
实施例2运用EGFR基因突变检测液相芯片对肺癌血清样本的检测
一、待测样本的准备(血浆、血清和胸水上清游离核酸的提取均可按以下方法)：
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明，详细步骤如下：
(1)取患者抗凝静脉血或胸腔积液约2.5ml，3000rpm离心15分钟，取300μl上清加到一个1.5ml干净无菌的离心管中；
(2)向离心管中加入500μl AP1缓冲液，涡旋振荡充分混匀；
(3)加入100μlAP2缓冲液，涡旋振荡充分混匀；
(4)室温下12,000rpm离心10分钟
(5)吸取上清加入放在2ml收集管上的吸附柱AxyPrep中，盖上盖子，以6,000rpm离心1分钟；
(6)倒掉废液收集管中的废液，用800μl缓冲液W1洗涤1次，以6,000rpm离心1分钟；
(7)倒掉废液收集管中的废液，加入800μl缓冲液W2，以12,000rpm离心1分钟；倒掉废液收集管中的废液，加入500μl缓冲液W2，以12,000rpm离心1分钟，弃掉废液；
(8)将吸附柱AxyPrep放回空收集管中，12,000rpm离心1分钟；
(9)将吸附柱AxyPrep置于一干净无菌的1.5ml离心管中，加入40μl TE缓冲液，室温下放置1分钟，12,000rpm离心1分钟洗脱DNA，电泳检测，-20℃保存。
二、待测样品的PCR扩增与酶切富集：
(1)第一轮PCR扩增
PCR反应体系：
| 反应体系 | 每反应(μl) |
| 灭菌ddH2O | 28.8 |
| 5×Buffer | 10 |
| 2.5mM dNTP混合液 | 2 |
| MgCl225mM | 5 |
| 引物F：E790F(10uM) | 1 |
| 引物R：E790R(10uM) | 1 |
| Taq酶(5U/ul) | 0.2 |
| 模板DNA | 2 |
| 总体积 | 50 |
PCR反应条件：
(2)PCR产物BstUI酶切：
反应体系如下：
| 样品体系(60℃温育2小时) | 每反应(μl) |
| 10×Buffer C | 5 |
| BstUI内切酶(10U/ul) | 0.5 |
| BSA | 0.5 |
| PCR产物 | 10 |
| 灭菌ddH2O | 34 |
| 总体积 | 50 |
(3)第二轮PCR扩增
PCR反应体系：
| 反应体系 | 每反应(ul) |
| 灭菌ddH2O | 28.8 |
| 5×Buffer | 10 |
| 2.5mM dNTP混合液 | 2 |
| MgCl225mM | 5 |
| 引物F：E790F-bio(10uM) | 1 |
| 引物R：E790R(10uM) | 1 |
| Taq酶(5U/ul) | 0.2 |
| 模板DNA | 2 |
| 总体积 | 50 |
PCR反应条件：
三、杂交及Luminex检测
(1)配制微球工作液：将实施例1中，包被有SEQ ID NO：1的野生型氨基修饰探针的微球和包被有SEQ ID NO：7突变型氨基修饰探针的微球，涡旋震荡成微球悬液，随即取出所需微球到灭菌离心管中(每反应0.5ul，其中每种微球为2000个/ul)，加入1.5×杂交液缓冲液(每个反应32.5ul)和TE缓冲液(每个反应14ul)，此为微球工作液；
(2)根据样品情况，使用记号笔对96孔板(杂交板)进行标记(阴性对照孔标记为“N”)，然后每孔加入47ul微球工作液；
(3)各样品孔加入3ul相应的待杂交检测样品(第二轮PCR产物)；“N”孔加入3ul TE；
(4)置杂交板于PCR仪中，95℃变性3min；54-60℃杂交15min；
(5)用1×杂交缓冲液配制SA-PE(链亲和素藻红蛋白)工作液(10ug/ml)，并置60℃水浴锅预热；
(6)往杂交完毕的杂交板中加入已预热至60℃的SA-PE工作液(10ug/ml)，每孔25ul；
(7)置PCR仪上60℃反应5min；
(8)将Luminex仪器托盘温度设置为60℃，按Luminex仪器使用方法设置仪器参数(每个样品读取微球100个，读数时间25s)。将杂交板置于Luminex仪器托盘中，检测样品MFI值。
四、检测结果与数据分析
反应后产物通过Luminex序列分析仪器检测，检测结果如表1所示。以荧光值(MFI)大于100为cut-off值，当突变型探针的MFI值大于100时，判定该样本为存在外显子20的T790M突变，否则判定该样本为外显子20野生型。
根据上述判定标准，本实施例所检测的20份样本中，3例存在外显子20点突变(2号，7号，11号样本)。
表1血清样本的检测结果
| 序号NO： | 阴性对照 | 外显子20野生型 | 外显子20突变型 |
| 1 | 25 | 1631 | 89 |
| 2 | 15 | 485 | 951 |
| 3 | 28 | 1398 | 88 |
| 4 | 17 | 1373 | 23 |
| 5 | 22 | 1277 | 67 |
| 6 | 31 | 1416 | 39 |
| 7 | 26 | 395 | 724 |
| 8 | 30 | 1463 | 53 |
| 9 | 21 | 1562 | 86 |
| 10 | 19 | 1490 | 64 |
| 11 | 28 | 326 | 713 |
| 12 | 19 | 1431 | 82 |
| 13 | 24 | 1669 | 39 |
| 14 | 27 | 1414 | 57 |
| 15 | 13 | 1402 | 79 |
| 16 | 26 | 1384 | 71 |
| 17 | 22 | 1465 | 44 |
| 18 | 18 | 1382 | 63 |
| 19 | 20 | 1504 | 72 |
| 20 | 27 | 1368 | 69 |
表2血清样本EGFR外显子20突变类型分析结果
| 样本号 | 测序分析结果 | 液相芯片分析结果 |
| 1 | 野生型 | 野生型 |
| 2 | T790M点突变 | T790M点突变 |
| 3 | 野生型 | 野生型 |
| 4 | 野生型 | 野生型 |
| 5 | 野生型 | 野生型 |
| 6 | 野生型 | 野生型 |
| 7 | T790M点突变 | T790M点突变 |
| 8 | 野生型 | 野生型 |
| 9 | 野生型 | 野生型 |
| 10 | 野生型 | 野生型 |
| 11 | T790M点突变 | T790M点突变 |
| 12 | 野生型 | 野生型 |
| 13 | 野生型 | 野生型 |
| 14 | 野生型 | 野生型 |
| 15 | 野生型 | 野生型 |
| 16 | 野生型 | 野生型 |
| 17 | 野生型 | 野生型 |
| 18 | 野生型 | 野生型 |
| 19 | 野生型 | 野生型 |
| 20 | 野生型 | 野生型 |
实施例3运用实施例1中的EGFR基因外显子20突变检测液相芯片对肺癌组织样本的检测
取上述实施例2所用的1-20号病人的肺癌组织样本进行检测，具体过程如下：
一、待测样本的准备
肺癌组织样本中DNA的提取：取肺癌术后或活检的组织标本5-50mg，研磨后，用pH7.4的PBS溶液洗涤2次；洗涤后的组织标本重悬于1ml的消化液(50mmol/L Tris，1mmo/L Na2EDTA，0.5％Tween-20，200ug/ml的蛋白酶K 200，pH8.5)，55℃水浴消化1小时，99℃水浴15min灭活蛋白酶K；12000转/分钟离心10分钟；取上清，通过酚-氯仿-异戊醇法抽提，乙醇沉淀法获得用于PCR反应的DNA样品。也可通过微量离心柱法提取DNA；
二、待测样品的PCR扩增与酶切富集：
具体方法同实施例2。
三、杂交与上机检测：
具体方法同实施例2进行检测。
四、检测结果与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测，检测结果如表3所示。判定标准同实施例2所述(见表4)。实验结果显示，肺癌组织样本检测的分析结果与用血清样本进行检测分析的结果一致，即20例样本中存在3例外显子20的点突变T790M(2号，7号，11号样本)。说明本发明所提供的用血清游离核酸进行EGFR基因突变检测的方法是可行的，也说明本发明所提供的方法是稳定可靠的。
表3肺癌组织样本的检测结果
| 序号NO： | 阴性对照 | 外显子20野生型 | 外显子20突变型 |
| 1 | 19 | 1865 | 91 |
| 2 | 17 | 560 | 1028 |
| 3 | 21 | 1479 | 82 |
| 4 | 20 | 1463 | 47 |
| 5 | 23 | 1414 | 81 |
| 6 | 15 | 1568 | 79 |
| 7 | 16 | 661 | 925 |
| 8 | 11 | 1675 | 79 |
| 9 | 19 | 1764 | 88 |
| 10 | 24 | 1499 | 65 |
| 11 | 17 | 557 | 963 |
| 12 | 16 | 1501 | 74 |
| 13 | 15 | 1801 | 77 |
| 14 | 28 | 1625 | 69 |
| 15 | 22 | 1620 | 97 |
| 16 | 14 | 1513 | 84 |
| 17 | 13 | 1605 | 72 |
| 18 | 27 | 1528 | 83 |
| 19 | 21 | 1640 | 75 |
| 20 | 19 | 1528 | 89 |
表4、肺癌组织样本EGFR突变类型分析结果
| 样本号 | 血清样本分析结果 | 组织样本分析结果 |
| 1 | 野生型 | 野生型 |
| 2 | T790M点突变 | T790M点突变 |
| 3 | 野生型 | 野生型 |
| 4 | 野生型 | 野生型 |
| 5 | 野生型 | 野生型 |
| 6 | 野生型 | 野生型 |
| 7 | T790M点突变 | T790M点突变 |
| 8 | 野生型 | 野生型 |
| 9 | 野生型 | 野生型 |
| 10 | 野生型 | 野生型 |
| 11 | T790M点突变 | T790M点突变 |
| 12 | 野生型 | 野生型 |
| 13 | 野生型 | 野生型 |
| 14 | 野生型 | 野生型 |
| 15 | 野生型 | 野生型 |
| 16 | 野生型 | 野生型 |
| 17 | 野生型 | 野生型 |
| 18 | 野生型 | 野生型 |
| 19 | 野生型 | 野生型 |
| 20 | 野生型 | 野生型 |
实施例4运用实施例1中的EGFR基因外显子20突变检测液相芯片对血清样本的检测取上述实施例2所用的1-10号病人的血清样本进行检测，具体过程如下：
一、待测样本的准备
具体方法同实施例2。
二、待测样品的PCR扩增与酶切富集：
具体方法同实施例2。
三、杂交与上机检测：
具体方法同实施例2进行检测，不同的是所选的微球包被的一对野生型和突变型探针分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：10。
四、检测结果与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测，检测结果如表5所示。判定标准同实施例2所述(见表6)。实验结果显示，分析结果与实施例2分析的结果一致，即10例样本中存在2例外显子20的点突变T790M(2号和7号样本)。说明实施例所提供的四组探针(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：9；SEQ IDNO：4和SEQID NO：10)进行EGFR基因突变检测的方法是可行的，也说明本发明所提供的探针是准确可靠的。(本发明所提供的野生型和突变型探针SEQ ID NO：5-6和SEQ ID NO：11-12分别是SEQ ID NO：2-3和SEQ ID NO：8-9的反向互补序列，其检测效果和SEQ ID NO：2-3和SEQ ID NO：8-9相同，试验数据省略)
表5血清样本的检测结果
表6血清样本EGFR突变类型分析结果
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>EGFR基因外显子20突变的检测探针、液相芯片及其检测方法
<160>15
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
catgagccgc gtgatgagct 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ggcatgagcc gcgtgatgag 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atgagccgcg tgatgagctg 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
agctcatcac gcggctcatg 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ctcatcacgc ggctcatgcc 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cagctcatca cgcggctcat 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ggcatgagcc gcatgatgag 20
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gcatgagccg catgatgagc t 21
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
atgagccgca tgatgagctg c 21
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ctcatcatgcg gctcatgcc 20
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
agctcatcat gcggctcatg c 21
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
gcagctcatc atgcggctca t 21
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gccgaagggc atgagccgc 19
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
gaagcctacg tgatggccag 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tacgtgatgg ccagcgtgga 20
Claims (4)
1.用于EGFR基因外显子20突变检测的探针，其特征是，包括有：
选自于SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6任一种的、针对外显子20引入酶切位点BstUI的野生型探针，和选自于SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：12任一种的、针对外显子20引入酶切位点BstUI的突变型探针。
2.一种EGFR基因外显子20突变检测液相芯片，其特征是，包括有：
(A)包被有探针的微球：包被有碱基序列选自于SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6任一种的、针对外显子20野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQ ID NO：7～SEQID NO：12任一种的、针对外显子20突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；以及
(B)用于扩增出具有外显子20突变位点的、末端具有生物素标记的目标序列的引物，所述引物序列为SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15，其中SEQ ID NO：13所示引物序列带有酶切位点。
3.根据权利要求2所述的EGFR基因外显子20突变检测液相芯片，其特征是，(A)包被有探针的微球为：包被有碱基序列选自于SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3任一种的、针对外显子20野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：9任一种的、针对外显子20突变型的氨基修饰探针的微球。
4.根据权利要求2或3所述的EGFR基因外显子20突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-30个T。
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