CN107723351A - 一种循环肿瘤dna肺癌驱动基因的高通量检测方法 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
本发明公开了一种循环肿瘤DNA肺癌驱动基因的高通量检测方法,本方法选取目前肺癌最常见的突变基因,结合第二代高通量测序技术,更全面的检测肺癌的基因突变情况。由于采用患者的血浆样本,因此,本方法可以极大的降低患者检测的创伤;其次、对22个肺癌基因进行全外显子检测,比基于real‑time PCR和一代Sanger测序技术平台的检测方法更全面;由于只对22个基因进行检测,能以更高的测序深度对样本进行检测,因此,检测的精度可以达到0.1%。从而为患者的更多、更优的个体化精准治疗方案提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种循环肿瘤DNA中驱动基因的高通量检测方法,尤其涉及一种肺癌基因突变情况的检测方法。
背景技术
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率居各癌症之首。每年全世界有超过130万的患者死于肺癌,近一半发生在发展中国家。据2010年我国卫生部的统计,肺癌死亡率为30.83/10万,肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤。肺癌从组织病理学上可以分为小细胞癌(SCLC)和非小细胞癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)两大类,其中非小细胞癌约占肺癌重病例的85%。在我国肺癌患者5年的生存率仅为13%,其部分原因是目前化疗仍是肺癌主要治疗手段,然而多数化疗会产生较大的毒副作用,不同患者间的化疗效果会有较大差异。随着肿瘤分子生物学的发展,肺癌的分子靶向治疗因其特异性高,毒副作用小,日益成为临床医生首选治疗方式。然后,由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术,大多数肺癌患者无法利用之相匹配的精准治疗方案,从而使患者错失了治疗的最优方案。
在肺癌中常见的突变基因有EGFR、KARS、ALK、ROS1、MET、HER2、BRAF、RET、NRAS、HRAS、DDR2、NTRK1、FGFR3、RICTOR、AKT1、MEK1、PIK3CA、PTEN、FGFR1、BIM、MAPK1、PDGFRA、TP53等。EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是膜受体酪氨酸激酶家族成员之一,当EGFR被配体激活,形成二聚体而激活酪氨酸激酶,引起细胞内多种信号通路的级联激活反应,调节相关重要基因的表达,从而影响细胞的增殖、迁移、分化以及凋亡。EGFR下游的信号转导通路主要有:Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路,PI3K/PDK1/Akt通路等。在中国非小细胞肺癌中,EGFR的突变概率超过35%。因此,针对EGFR及其信号通路的靶标检测和靶向药物治疗已成为肿瘤个体化诊疗的重要手段。RAS相关的蛋白质家族是在所有的细胞和器官中普遍性表达。当ras基因发生突变后,可产生永久性激活的Ras蛋白。最终导致细胞持续性生长并阻止凋亡,进而产生癌变。RAS基因(K-ras,H-ras和N-ras)是人类癌症中最常见的癌基因;永久激活Ras蛋白被发现,在人类肿瘤中,20%至25% ras基因发生了突变。因此,只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂治疗。研究表明,许多肿瘤病人在其肿瘤的发生和转移过程中均有c-met过度表达和基因扩增,发生的概率为2-4%。c-met基因扩增能活化EGFR信号转导通路下游的ERBB3/PI3K/AKT信号途径,促进肿瘤细胞增长,抑制其凋亡,引发肿瘤细胞对EGFR-TKIs类药物的耐药性,是非小细胞肺癌(NSCLC)对吉非替尼、厄洛替尼等分子靶向药物产生激发耐药的重要机制之一。ROS1(C-Ros Oncogene 1,Receptor TrosineKinase)与SLC34A2、CD74等基因发生融合后,会持续激活ROS1酪氨酸激酶区及下游JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK等信号通路,进而引起肿瘤的发生。ROS1的基因重排在多种恶性肿瘤中均有发现,在非小细胞肺癌中的概率约为1%。EML4-ALK融合基因是非小细胞肺癌中新发现的分子靶向之一,在非小细胞肺癌中发生的概率为3-7%。所有的EML4-ALK融合基因均有生物学活性,其嵌合产物可导致ALK酪氨酸激酶持续高表达,从而激活下游PI3K/AKT、MAPK等信号通路,导致肿瘤的发生和转移。EML4-ALK融合基因存在与否与ALK激酶抑制剂的疗效相关,小分子酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼对含有EML4-ALK融合基因突变的肺癌患者疗效显著。目前,靶向治疗方案越来越多,相应的靶向位点也在增加。因此,癌症基因突变检测对于癌症的个体化治疗具有重要的意义。目前常用的基因突变检测有测序法、PCR-SSCP、ARMS、数字PCR以及第二代高通量测序技术(NGS)等。其中测序法、PCR-SSCP、ARMS、数字PCR癌症基因检测技术,都只能提供几个基因的少数位点的突变信息。而利用第二代高通量测序技术,可以一次检测全部所需基因,获取基因全部的突变信息,有助于医生更准确制定治疗方案。
当前,癌症基因检测以组织样本为主。基于肿瘤组织样本的检测,存在两个问题:一、肿瘤组织大都来源于活检技术即穿刺和活检钳活检,这样会给病人带来极大的痛苦,是有创检测;二、对于某些晚期的病人,不能穿刺或者手术,病人样本就很难获取,因此就很难根据检测的结果对病人进行靶向用药。而且,采用靶向治疗的患者,都已经处于中晚期,身体状况较差。因此,尽量减少检测对身体的创伤具有非常重要意义。另一方面,随着精准治疗的不断发展,越来越多靶向治疗可供选择;同时也存在越来越多的靶向位点需要检测。因此,会产生一个问题,更多的治疗选择需要从患者身上获得更多的样品。基于上述发展过程中产生的矛盾,临床上迫切需要一种能够替代目前市场上需要较多样本的基因检测方法。近年来研究发现肿瘤患者外周血存在肿瘤循环DNA(ctDNA);而且越来越多的临床研究表明是非常好的组织样本的代替品。本专利采用血浆作为检测样本,有如下优势:1、提供肿瘤实时信息---当前肿瘤的突变状态;2、非侵入性液体活检---减少患者的成本和风险;3、没有肿瘤组织可用---仍然可以方便进行检测;4、消除组织样本偏差---评估全身肿瘤的整体状态。
因此,个体化精准治疗,能提高晚期肺癌患者的生存质量和生存时间。但是需要对靶标位点进行精准检测。而利用血浆样本,结合第二代高通量测序技术,可以更全面的检测肺癌的基因突变信息,从而获得更好的治疗方案,提高预后效果。
发明内容
本发明提供一种准确度高、临床意义明确的循环肿瘤DNA肺癌基因突变筛查方法。
实现本发明目的的一种循环肿瘤DNA肺癌基因突变的筛查方法,包括如下步骤:
(1)根据人类基因组HG19,调取肺癌高频突变基因的外显子序列。常见肺癌基因列表如下:
调取外显子的序列包含列表基因的基因区域,以及己知各个转录本的启动子区域需要加入内含子区域以便检测融合;
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列,每个序列沿着基因位置挪动设计,探针之间的挪动大小60bp;
(3)采用原位合成技术,在芯片上大量合成设计的探针,并利用多聚酶链式反应和转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针,并制作肺癌基因高通量检测试剂盒;
所述试剂盒检测方法包括如下步骤:
从患者血浆中提取100-300ng cfDNA (Cell Free DNA),然后利用肺癌常见基因探针将目的基因序列捕获出来,再用测序仪(Illumina Nextseq 500) 进行高通量测序,进而分析,找出与肺癌相关基因的所有突变信息,从而得到患者肺癌的变异情况,以达到准确基因诊断的目的。
利用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序,分析的过程包括单核昔酸多态性分析(SNP分析)过程、插入缺失标记分析(InDel分析)、基因融合和大片段扩增缺失分析流程;
所述单核昔酸多态性分析(SNP分析)过程包括如下步骤:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核昔酸多态性(SNP)的信息;
(5)统计测序结果信息,短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等,过滤低质量值(小于25)和低覆盖度(小于10)的单核昔酸;
(6)利用ANNOVAR3、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对单核昔酸进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核昔酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核昔酸影响蛋白功能预测;
(7)根据疾病样品和正常样品信息,选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核昔酸作为候选的单核昔酸,在候选的单核昔酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核昔酸。同时,过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核昔酸作为最后疾病相关的候选单核昔酸;
所述插入缺失标记分析(InDel分析)流程包括如下步骤:
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t7 -e 40 -M 3 -f);
(2)用Pinel软件找出序列中所含有的括入/缺失(InDel)的信息(所用到参数:Pindel-k -H 50 -w 10 -E 0.6 -a 8 -M 10 -m 10 -d 100 -A 50 );
(3)利用CCDS、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对InDel进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸括入/氨基酸缺失/移码突变);
(4)根据疾病样品和正常样品信息,选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels,在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel,最后筛选出疾病相关的候选InDels;
所述大片段扩增确和缺失分析流程包括如下步.:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4) 用ONCOCNV6.4统计目标区域覆盖大小,然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标,每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图,得出扩增和缺失的分析图。
所述基因融合分析流程包括如下步.:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用factera检测多个基因的全部或一部分的编码区首尾相连。包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果,得到基因融合结果。
本发明的一种循环肿瘤DNA肺癌基因的检测方法的有益效果如下:
本发明的一种循环肿瘤DNA肺癌基因的检测方法,是以DNA文库的方式进行捕获测序,因此,样品DNA的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响,而过量的探针,保证了对目标片段的完全捕获。所以,即使可能出现的某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来,其灵敏度相对于其他方法要高出许多。本方法以患者血浆循环肿瘤DNA为样本,采取高深度测序的方法(10000X)检测其驱动基因的突变情况。相比于临床上传统的病理学诊断而言,本方法有以下优势:
1、无创检测;本方法只需抽取患者血液(10ml)既可完成整个的诊断流程,而不需要取个体患处的组织或细胞。
2、预测性强;临床诊断通常只能在患者身体己经出现病理改变(出现肿块,蛋白改变)时做出诊断,因此,临床上肿瘤患者的发现,特别是恶性肿瘤,往往发现时病人己经处于中晚期。而基因诊断不仅可以对己患病的个体进行准确的诊断。
3、采取高深度测序,平均要达到10000X,保证低频突变能够检测出,能检测每个位点0.1%以上的基因突变。准确度高;本方法提供的肺癌基因捕获试剂盒覆盖了目前最新的肺癌高频突变基因的所有外显子区域。
具体实施方式
本发明的一种循环肿瘤DNA肺癌基因的检测方法,包括如下步骤:
1.样本文库制备:
(1)、吸取60ul纯化后的DNA(ctDNA)和40ul Endprep mix于PCR单管中,吹打混匀,短暂离心,进行末端修复,反应条件为30℃、30min。
(2)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温,震荡混匀,取180ul磁珠加入末端修复好的PCR产物中,抽打混匀,温室孵育5min。
(3)、将PCR单管放于磁力架上,静置5min,去上清,保持PCR管在磁力架上,加入80%乙醇(新配)200ul漂洗,静置30s后去上清,80%乙醇漂洗两遍,室温干燥10min(还有2min时用小抢头吸残液),直至无乙醇残留。
(4)、将PCR管从磁力架中取出,加入20ul超纯灭菌水洗脱,轻弹混匀,静置5min,短暂离心,置于磁力架上,待溶液澄清后吸上清17.5ul于新的PCR管中,再在PCR管中加入12.5ul dA-Tailing(解冻后放4℃,离心后再使用),吹打混匀。进行末端加尾,反应条件为37℃ 30min, 70℃ 5min,4℃ 5min。
(5)、在上步加尾后的产物中加入Ligation mix 和adapter各2.5ul,吹打混匀,短暂离心,放入PCR仪中,反应条件为30℃ 10min ,20℃ 20min。
(6)、在上步连接产物中加入15ul的超纯灭菌水,再加入50ul磁珠,震荡混匀,室温孵育5min,短暂离心,放入磁力架上,静置5min,澄清后去上清,保持PCR管在磁力架上,用200ul的80%乙醇(新配)漂洗两次,室温干燥10min,直至无乙醇残留。
(7)、将PCR管从磁力架上取出,加入25ul超纯灭菌水,轻弹混匀,静置5min,短暂离心,将PCR单管置于磁力架上,静置5min后小心吸取上清22ul于新的PCR管中。
(8)、将PCR primer mix和Amplification mix 2解冻后颠倒混匀,在上步连接产物中加入3ul的primer mix和25ul的Amplificstion mix 2,吹打混匀,短暂离心,进行PCR扩增,反应条件为
第一步95℃ 3min
第二步98℃ 20s
第三步60℃ 15s
第四步72℃ 30s
第五步72℃ 5min
第六步Hold at 4℃
第二----四步扩增15cycle。
(9)、用上步扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察条带亮度。
(10)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温,震荡混匀,取50ul加入PCR扩增产物中,震荡混匀,室温孵育5min,短暂离心,置于磁力悬架上,静置5min,待溶液澄清后去上清,用200ul的80%乙醇(新配)漂洗两次,室温干燥10min,直至无乙醇残留。
(11)、将PCR管从磁力架中取出,加入40ul超纯灭菌水洗脱,轻弹混匀,静置5min,短暂离心,置于磁力架上,待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中,用Qubit测溶液浓度并记录,-20℃保存。
2.样本富集液相杂交
(1)、用于杂交的建库后DNA总量为500ng,根据检测的溶液浓度计算杂交时加入EP管的溶液体积。
(2)、在上步的EP管中加入2.5ul的cot-1 DNA,2.5ul的SS DNA,2ul的P5(500um),2ul的P7-x(500um),短暂离心。
(3)、将上步混合好的溶液在60℃真空干燥30 min,直至无液体残留。
(4)、在上步干燥后的EP管中加入10ul超纯灭菌水,轻弹混匀,水化10 min,短暂离心,取10ul加入PCR八连排中。
(5)、将上步PCR八连排放入PCR仪中进行PCR反应,反应条件为
第一步95℃ 5min
第二步65℃ 5min
第三步65℃ 无限
在95℃结束后,将1ul RNAsin和5ul RNAbait混合(每个样品所取量),在65℃ 2.5min时将RNAsin和RNAbait混合液以及杂交液放入65℃PCR仪中,在65℃ 5min结束后先在八连排每个孔中加入6ul的混合液,加入时吹打混匀,2.5min后加入10ul(每个样品所取量)杂交液,加入后吹打混匀,65℃过夜。
3.捕获
(1)、洗磁珠,取Dnabeads磁珠震荡混匀,根据样品数取磁珠(每个样品取30ul磁珠),用200ul beads洗液洗3次。
(2)、悬浮磁珠于binding buffer中,每个样品取165ul的binding buffer。
(3)、吸取binding buffer和磁珠的结合液165ul于杂交样品中,震荡45min(每隔5min上下颠倒混匀),45min后置于磁力架上,待澄清后吸弃上清。
(4)、加165ul的洗液I于上步磁珠中,洗15min,每5min颠倒混匀一次,15min后置于磁力架上,待澄清后吸弃上清。
(5)、将洗液II提前放入70℃PCR仪预热,加165ul的洗液II于上步磁珠中,颠倒混匀,在70℃洗10min,10min后置于磁力架上,待澄清后吸弃上清,洗液II洗3次。
(6)、在上步八连排的每个孔中加入22 ul的超纯灭菌水,3ul的primer和25ul的Amplification mix2,颠倒混匀,进行PCR扩增,扩增程序为
第一步95℃ 3min
第二步98℃ 20s
第三步60℃ 15s
第四步72℃ 30s
第五步72℃ 5min
第六步Hold at 4℃
第二----四步扩增15cycle。
(7)、将上步八连排放在磁力架上,待溶液澄清后,吸上清进行琼脂糖凝胶电泳,观察条带大小及亮度。
(8)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温,震荡混匀,吸取上步八连排中的上清于新的PCR单管中,吸取50ul磁珠加入PCR单管中,震荡混匀,室温孵育5min,短暂离心,置于磁力悬架上,静置5min,待溶液澄清后去上清,用200ul的80%乙醇(新配)漂洗两次,室温干燥10min,直至无乙醇残留。
(9)、将PCR管从磁力架中取出,加入40ul超纯灭菌水洗脱,轻弹混匀,静置5min,短暂离心,置于磁力架上,待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中,用Qubit测溶液浓度并记录,-20℃保存。
以上得到的DNA通过Illumina Nextseq 500测序,得到测序的数据。
4.SNP分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核昔酸多态性(SNP)的信息;
(5)统计测序结果信息,短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等,过滤低质量值(大于25)和低覆盖度(大于10)的单核昔酸;
(6)利用ANNOVAR3、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对单核昔酸进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核昔酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核昔酸影响蛋白功能预测;
(7)根据疾病样品和正常样品信息,选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核昔酸作为候选的单核昔酸,在候选的单核昔酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核昔酸。同时,过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核昔酸作为最后疾病相关的候选单核昔酸;
5.InDel分析流程
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t7 -e 40 -M 3 -f);
(2)用Pinel软件找出序列中所含有的括入/缺失(InDel)的信息(所用到参数:Pindel-k -H 50 -w 10 -E 0.6 -a 8 -M 10 -m 10 -d 100 -A 50 );
(3)利用CCDS、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对InDel进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸括入/氨基酸缺失/移码突变);
(4)根据疾病样品和正常样品信息,选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels,在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel,最后筛选出疾病相关的候选InDels;
6.大片段扩增缺失分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4) 用ONCOCNV6.4统计目标区域覆盖大小,然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标,每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图,得出扩增和缺失的分析图。
7.基因融合分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用factera检测多个基因基因的全部或一部分的编码区首尾相连。包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果,得到基因融合结果。
上面所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神前提下,本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种循环肿瘤DNA肺癌驱动基因的高通量检测方法,包括肺癌高频突变基因扫描试剂盒的方法和试剂盒的筛查方法。
2.肺癌高频突变基因扫描试剂盒的方法包括如下步骤:
(1)根据人类基因组HG19,调取肺癌高频突变基因的外显子序列;
常见肺癌基因列表如下:
调取外显子的序列包含列表基因的基因区域,以及己知各个转录本的启动子区域;
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列,每个序列沿着基因位置挪动设计,探针之间的挪动大小60bp;
(3)采用原位合成技术,在芯片上大量合成设计的探针,并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针,并制作肺癌基因扫描试剂盒;
所述试剂盒筛查方法包括如下步骤:
从病人血浆中提取100-300ng cfDNA (Cell Free DNA),然后利用肺癌常见基因探针将目的基因序列捕获出来,再用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序,进而分析,找出与肺癌相关基因的所有突变信息,从而得到患者肺癌的变异情况,以达到准确基因诊断的目的。
3.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤DNA肺癌基因的检测方法,其特征在于:分析样本采用血浆中循环肿瘤DNA,采用测序仪进行高通量测序,分析的过程包括单核昔酸多态性分析过程、所述括入缺失标记分析流程、大片段扩增确实分析流程和基因融合分析流程;
所述单核昔酸多态性分析过程包括如下步骤:
(1)测序仪获取原始短序列;
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据;
(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上;
(4)统计测序结果信息,短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等;
(5)过滤低质量值和低覆盖度的单核昔酸;
(6)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对单核昔酸进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核昔酸功能、SIFT预测单核昔酸影响蛋白功能预测;
(7)根据疾病样品和正常样品信息,选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核昔酸作为候选的单核昔酸,在候选的单核昔酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核昔酸;同时,过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核昔酸作为最后疾病相关的候选单核昔酸;
所述括入缺失标记分析过程包括如下步骤:
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据比对到人类基因组上;
(2)找出序列中所含有的括入/缺失的信息;
(3)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对InDel进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能;
(4)根据疾病样品和正常样品信息,选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels,在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel,最后筛选出疾病相关的候选InDels;
所述大片段扩增确实分析流程包括如下步骤:
(1)测序仪获取原始短序列;
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据;
(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上;
(4)统计目标区域覆盖大小,然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标,每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图,得出扩增和缺失的分析图;
所述括入缺失标记分析过程包括如下步骤
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据比对到人类基因组上;
(2)找出序列中所含有的括入/缺失的信息;
(3)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对InDel进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能;
(4)根据疾病样品和正常样品信息,选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的基因融合作为候选的融合基因,在候选的融合基因中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的融合基因,最后筛选出疾病相关的候选融合基因;
所述基因融合分析流程包括如下步.:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 550)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用factera检测多个基因基因的全部或一部分的编码区首尾相连,包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果,得到基因融合结果。
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