CN107723350A - 一种遗传性乳腺癌突变基因高通量筛查方法 - Google Patents
一种遗传性乳腺癌突变基因高通量筛查方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速准确且能够覆盖最新的遗传性乳腺癌突变基因的所有外显子区域的遗传性乳腺癌突变基因的筛查方法。本发明的基本方案是从个体中抽取3‑5ml的血液，从血液中提取3‑5ug gDNA,并利用超声将其打断、扩增，从而构建人的全基因组文库，然后利用本发明的遗传性乳腺癌突变基因扫描试剂盒对相关致病基因进行捕获，然后利用新一代测序仪进行高通量测序，分析找出这些基因相关的突变信息，以达到遗传性乳腺癌突变基因筛查的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因的筛查方法，尤其是一种遗传性乳腺癌突变基因的筛查方法。
技术背景
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，发生于乳房腺上皮组织，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，严重影响妇女身心健康。在我国，乳腺癌发病率增长最快，每年以3-4%的速度在增长，占妇女癌症死亡第一位。乳腺癌细胞之间连接松散，容易脱落，癌细胞一旦脱落便随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。乳腺癌的自然病程通常很长，癌细胞倍增时间平均为90天，往往人们在就诊时就发现已有淋巴结转移。乳腺癌的病因尚未完全清楚，已知乳腺癌家族史是乳腺癌发生的危险因素。根据规律，女性乳腺癌发病率与年龄和易患乳腺癌的高危因素（包括携带乳腺癌相关的突变基因）有关。根据乳腺癌患者情况可分为隐形乳腺癌、男性乳腺癌、炎性乳癌、妊娠期和哺乳期乳腺癌。隐形乳腺癌常以淋巴结转移为首发症状。男性乳腺癌较为罕见，只占1%。炎性乳腺癌应用手术或放疗的预后较差，平均生存期为4～9个月。目前大多数炎性乳腺癌均采用化疗及放疗的综合治疗，反复的化疗和放疗给患者带来了极大的痛苦。在乳腺癌患者中，家族性乳腺癌占20%～25%，遗传性乳腺癌占5%-10%。对遗传性乳腺癌突变基因筛查，有助于乳腺癌的防治，针对易感基因突变的人群，采取积极的预防措施，包括增加体检频率、药物性预防和手术切除，从而降低乳腺癌的危害。
经大量研究，目前已知的遗传性乳腺癌突变基因包括：BRCA1，BRCA2，TP53，PTEN等。BRCA1和BRCA2两个基因能编码具有多重功能的蛋白，其突变表型往往具有诱发乳腺癌和卵巢癌的趋向。目前所知BRCA1和BRCA2与同源重组、DNA损伤修复、胚胎生长、转录调控等均有关。BRCA1是调控G/M期关键点的调控因子，是激活Chkl激酶所必需的，而后者对DNA损伤时诱导G/M 期阻滞起重要作用。同时，BRCA1 还控制了Cdc25C和Cdc2/ Cyclin B1激酶蛋白的表达、磷酸化以及胞内定位的调节，这两种蛋白对细胞周期过程中G/M期的顺利进行起重要作用。BRCA1在有丝分裂期定位于中心体，并且与中心体的γ-微管蛋白相互作用。p53也能反过来抑制BRCA1的表达，借此达到稳定自身的作用。野生型的BRCA1还能诱导凋亡并且抑制雌激素依赖性转录通路，该通路与乳腺上皮细胞增生有关，基因突变后抑制作用减弱而致病。不同人群中的BRCA的突变率及突变基因位点有较大的差异。携带有BRCA1 或BRCA2缺陷基因的女性将有高达87%的几率患上乳腺癌。奥拉帕尼（多（AD P）- 核糖聚合酶(PARP) 抑制剂）目前已被FDA批准用于遗传性乳腺癌突变基因BRCA的突变。Tp53是一种肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。由这种基因编码的蛋白质(protein)是一种转录因子(transcriptional factor)，控制着细胞周期的启动。p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。细胞中抑制癌变的基因"p53"会判断DNA变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复，若DNA变异较大，"p53"就诱导细胞凋亡。p53基因突变后，由于其空间构象发生改变，失去了对细胞生长、凋亡和DNA 修复的调控作用，p53基因由抑癌基因转变为癌基因。PTEN是迄今发现的第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因，也是继p53基因后另一个较为广泛地与肿瘤发生关系密切的基因。PTEN酶参与化学通路的传导，可以把信号传导给细胞，使细胞停止分裂并发生凋亡。这些功能可阻止不受控制的细胞生长进而限制肿瘤的形成。PTEN酶还有协助控制细胞转移、细胞与周围组织的粘附、血管发生和维持细胞遗传信息的稳定性等功能。PTEN的突变会造成PTEN酶的失活，激活PI3K-AKT信号途径从而致癌。目前，已发现许多与遗传性癌相关的基因，从中选取了与乳腺癌相关性最高的42个基因。通过测定这些的基因的基因型，预测乳腺癌的风险，从而降低乳腺癌的危害。
近年来，随着基因组测序技术的迅猛发展，肿瘤个体化分子诊断逐渐成为肿瘤研究领域的热点。新一代高通量测序技术（NGS）不仅通量大、速度快、灵敏度高，而且大大降低了成本，是目前最先进的基因测序手段。本发明的目的是提供一种快速准确且能够覆盖遗传性乳腺癌突变基因的诊断方法。本发明的基本方案是从血液中提取gDNA，利用超声打断构建基因组文库，然后进行遗传性乳腺癌突变基因捕获，利用新一代测序仪进行高通量测序，分析找出遗传性乳腺癌突变基因的突变情况，达到乳腺癌筛查的目的。
发明内容
本发明提供一种准确度高、预测性好的乳腺癌基因筛查方法。
实现本发明目的的一种遗传性乳腺癌突变基因高通量筛查，包括如下步骤:
(1)根据人类基因组HG19，调取如下基因的外显子序列。常见乳腺癌基因列表如下：
调取外显子的序列包含列表基因的基因区域，以及己知各个转录本的启动子区域;
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;
(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应和转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作遗传性乳腺癌突变基因高通量捕获试剂盒;
所述试剂盒检测方法包括如下步骤:
从正常人血液中提取3-5ug基因组 DNA，利用超声打断，扩增，构建人的全基因组文库，然后利用遗传性乳腺癌突变基因高通量捕获试剂盒中探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(Illumina Nextseq 500) 进行高通量测序，进而分析，找出遗传性乳腺癌突变基因的所有突变信息，以达到对遗传性乳腺癌突变基因筛查的目的。
利用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序，分析的过程包括单核昔酸多态性分析(SNP分析)过程、插入缺失标记分析(InDel分析)和大片段扩增缺失分析流程;
所述单核昔酸多态性分析(SNP分析)过程包括如下步骤:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核昔酸多态性(SNP)的信息;
(5)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等，过滤低质量值(小于25)和低覆盖度(小于10)的单核昔酸;
(6)利用ANNOVAR3、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对单核昔酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核昔酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核昔酸影响蛋白功能预测;
(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核昔酸作为候选的单核昔酸，在候选的单核昔酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核昔酸。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核昔酸作为最后疾病相关的候选单核昔酸;
所述插入缺失标记分析(InDel分析)流程包括如下步骤:
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t7 -e 40 -M 3 -f);
(2)用Pinel软件找出序列中所含有的括入/缺失(InDel)的信息(所用到参数:Pindel-k -H 50 -w 10 -E 0.6 -a 8 -M 10 -m 10 -d 100 -A 50 );
(3)利用CCDS、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸括入/氨基酸缺失/移码突变);
(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels;
所述大片段扩增确和缺失分析流程包括如下步:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4) 用ONCOCNV6.4统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图。
所述基因融合分析流程包括如下步:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用factera检测多个基因基因的全部或一部分的编码区首尾相连。包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果，得到基因融合结果。
本发明的一种遗传性乳腺癌突变基因的筛查方法的有益效果如下:
本发明的一种遗传性乳腺癌突变基因的筛查方法，是以DNA文库的方式进行捕获测序，而过量的探针，保证了对目标片段的完全捕获。本方法以正常人血液基因组DNA为样本，采取深度测序的方法（500X）检测遗传性乳腺癌突变基因的突变情况。相比于其它检测方法，本方法有以下优势:
1、无创检测;本方法只需抽取患者血液(10ml)既可完成整个的检测流程。
2、预测性强;遗传性乳腺癌突变基因列表包含了目前发现的与遗传性乳腺癌相关性最紧密的基因。
3、采取高深度测序，平均要达到500X，保证检测的覆盖度，准确度高;本方法的提供的遗传性乳腺癌突变基因捕获试剂盒覆盖了目前最新的遗传性乳腺癌突变基因的所有外显子区域。
具体实施方式
本发明的一种遗传性乳腺癌突变基因的筛查方法，包括如下步骤:
1.样本文库制备:
(1)、超声片段化：起始量为3ug，加无核酶的水到100ul稀释到30ng/ul。采用SCIENTZ08-Ⅲ杯式超声波细胞粉碎机进行超声片段化，设定参数为：功率70%，打断3s，停止1s，循环30-60min。
(2)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，取180ul磁珠加入超声打断后的PCR产物中，抽打混匀，温室孵育5min。
(3)、将PCR单管放于磁力架上，静置5min，去上清，保持PCR管在磁力架上，加入80%乙醇（新配）200ul漂洗，静置30s后去上清，80%乙醇漂洗两遍，室温干燥10min（还有2min时用小抢头吸残液），直至无乙醇残留。
（4）将PCR管从磁力架上取出，加入65ul超纯灭菌水，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，将PCR单管置于磁力架上，静置5min后小心吸取上清60ul于新的PCR管中。
（5）将40ul Endprep mix加入（4）中60ul上清的PCR管中，吹打混匀，短暂离心，进行末端修复，反应条件为30℃、30min。
(4)、将PCR管从磁力架中取出，加入20ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清17.5ul于新的PCR管中，再在PCR管中加入12.5ul dA-Tailing（解冻后放4℃，离心后再使用），吹打混匀。进行末端加尾，反应条件为37℃ 30min, 70℃ 5min,4℃ 5min。
(5)、在上步加尾后的产物中加入Ligation mix 和adapter各2.5ul，吹打混匀，短暂离心，放入PCR仪中，反应条件为30℃ 10min ，20℃ 20min。
(6)、在上步连接产物中加入15ul的超纯灭菌水，再加入50ul磁珠，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，放入磁力架上，静置5min，澄清后去上清，保持PCR管在磁力架上，用200ul的80%乙醇（新配）漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(7)、将PCR管从磁力架上取出，加入25ul超纯灭菌水，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，将PCR单管置于磁力架上，静置5min后小心吸取上清22ul于新的PCR管中。
(8)、将PCR primer mix和Amplification mix 2解冻后颠倒混匀，在上步连接产物中加入3ul的primer mix和25ul的Amplification mix 2，吹打混匀，短暂离心，进行PCR扩增，反应条件为
第一步95℃ 3min
第二步98℃ 20s
第三步60℃ 15s
第四步72℃ 30s
第五步72℃ 5min
第六步Hold at 4℃
第二----四步扩增15cycle。
(9)、用上步扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带亮度。
(10)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，取50ul加入PCR扩增产物中，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，置于磁力悬架上，静置5min，待溶液澄清后去上清，用200ul的80%乙醇（新配）漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(11)、将PCR管从磁力架中取出，加入40ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中，用Qubit测溶液浓度并记录，-20℃保存。
2.样本富集液相杂交
(1)、用于杂交的建库后DNA总量为500ng，根据检测的溶液浓度计算杂交时加入EP管的溶液体积。
(2)、在上步的EP管中加入2.5ul的cot-1 DNA，2.5ul的SS DNA，2ul的P5（500um），2ul的P7-x（500um），短暂离心。
(3)、将上步混合好的溶液在60℃真空干燥30 min，直至无液体残留。
(4)、在上步干燥后的EP管中加入10ul超纯灭菌水，轻弹混匀，水化10 min，短暂离心，取10ul加入PCR八连排中。
(5)、将上步PCR八连排放入PCR仪中进行PCR反应，反应条件为
第一步95℃ 5min
第二步65℃ 5min
第三步65℃ 无限
在95℃结束后，将1ul RNAsin和5ul RNAbait混合（每个样品所取量），在65℃ 2.5min时将RNAsin和RNAbait混合液以及杂交液放入65℃PCR仪中，在65℃ 5min结束后先在八连排每个孔中加入6ul的混合液，加入时吹打混匀，2.5min后加入10ul（每个样品所取量）杂交液，加入后吹打混匀，65℃过夜。
3.捕获
(1)、洗磁珠，取Dnabeads磁珠震荡混匀，根据样品数取磁珠（每个样品取30ul磁珠），用200ul beads洗液洗3次。
(2)、悬浮磁珠于binding buffer中，每个样品取165ul的binding buffer。
(3)、吸取binding buffer和磁珠的结合液165ul于杂交样品中，震荡45min（每隔5min上下颠倒混匀），45min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清。
(4)、加165ul的洗液1于上步磁珠中，洗15min，每5min颠倒混匀一次，15min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清。
(5)、将洗液2提前放入70℃PCR仪预热，加165ul的洗液2于上步磁珠中，颠倒混匀，在70℃洗10min，10min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清，洗液2洗3次。
(6)、在上步八连排的每个孔中加入22 ul的超纯灭菌水，3ul的primer和25ul的Amplification mix2，颠倒混匀，进行PCR扩增，扩增程序为:
第一步95℃ 3min
第二步98℃ 20s
第三步60℃ 15s
第四步72℃ 30s
第五步72℃ 5min
第六步Hold at 4℃
第二----四步扩增15cycle。
(7)、将上步八连排放在磁力架上，待溶液澄清后，吸上清进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小及亮度。
(8)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，吸取上步八连排中的上清于新的PCR单管中，吸取50ul磁珠加入PCR单管中，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，置于磁力悬架上，静置5min，待溶液澄清后去上清，用200ul的80%乙醇（新配）漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(9)、将PCR管从磁力架中取出，加入40ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中，用Qubit测溶液浓度并记录，-20℃保存。
以上得到的DNA通过Illumina Nextseq 500测序，得到测序的数据。
4.SNP分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核昔酸多态性(SNP)的信息;
(5)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等，过滤低质量值(大于25)和低覆盖度(大于10)的单核昔酸;
(6)利用ANNOVAR3、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对单核昔酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核昔酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核昔酸影响蛋白功能预测;
(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核昔酸作为候选的单核昔酸，在候选的单核昔酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核昔酸。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核昔酸作为最后疾病相关的候选单核昔酸;
5.InDel分析流程
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t7 -e 40 -M 3 -f);
(2)用Pinel软件找出序列中所含有的括入/缺失(InDel)的信息(所用到参数:Pindel-k -H 50 -w 10 -E 0.6 -a 8 -M 10 -m 10 -d 100 -A 50 );
(3)利用CCDS、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸括入/氨基酸缺失/移码突变);
(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels;
6.大片段扩增缺失分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4) 用ONCOCNV6.4统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图。
上面所述的实施案例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种遗传性乳腺癌突变基因高通量筛查方法，包括制作遗传性乳腺癌突变基因扫描试剂盒的方法和试剂盒筛查方法，遗传性乳腺癌突变基因突变试剂盒的方法包括如下步骤：
(1)根据人类基因组HG19，调取遗传性乳腺癌突变基因的外显子序列。
2.常见遗传性乳腺癌突变基因列表如下：
调取外显子的序列包含列表基因的基因区域，以及己知各个转录本的启动子区域;
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;
(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作遗传性乳腺癌突变基因扫描试剂盒;
所述试剂盒筛查方法包括如下步骤:
从正常人血液中提取基因组DNA，然后利用遗传性乳腺癌突变基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序，进而分析，找出遗传性乳腺癌突变基因的所有突变信息，以达到遗传性乳腺癌突变基因筛查的目的。
3.根据权利要求1所述的一种遗传性乳腺癌突变基因的筛查方法，其特征在于：分析样本采用血液中基因组DNA，采用测序仪进行高通量测序，分析的过程包括单核昔酸多态性分析过程、所述括入缺失标记分析流程和大片段扩增确实分析流程;
所述单核昔酸多态性分析过程包括如下步骤:
(1)测序仪获取原始短序列;
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据;
(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上;
(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等;
(5)过滤低质量值和低覆盖度的单核昔酸;
(6)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对单核昔酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核昔酸功能、SIFT预测单核昔酸影响蛋白功能预测;
(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核昔酸作为候选的单核昔酸，在候选的单核昔酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核昔酸，同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的
单核昔酸作为最后疾病相关的候选单核昔酸;
所述括入缺失标记分析过程包括如下步骤
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据比对到人类基因组上;
(2)找出序列中所含有的括入/缺失的信息;
(3)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能;
(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels;
所述大片段扩增确实分析流程包括如下步骤:
(1)测序仪获取原始短序列;
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据;
(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上;
(4)统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图，所述括入缺失标记分析过程包括如下步骤：
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据比对到人类基因组上;
(2)找出序列中所含有的括入/缺失的信息;
(3)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能;
(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的基因融合作为候选的融合基因，在候选的融合基因中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的融合基因，最后筛选出疾病相关的候选融合基因，所述基因融合分析流程包括如下步.:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 550)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用factera检测多个基因基因的全部或一部分的编码区首尾相连，包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果，得到基因融合结果。
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Cited By (5)
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|---|---|---|---|---|
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