CN103981273A - 一组评估乳腺癌风险的突变基因群及其检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组可用于乳腺癌风险评估的突变基因群及其检测试剂盒，所述突变基因群是包含以下七条基因的突变基因的集合，所述七条基因是：BRCA1基因、BRCA2基因、TP53基因、MLH1基因、MLH3基因、MSH3基因和CDH1基因，所述七条基因的突变基因中总携带25个突变位点，该突变位点如表3所示。本发明还公开了一种评估乳腺癌风险的突变基因群的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：检测本发明所述的突变基因群中的突变基因的探针或引物。本发明提供的评估乳腺癌风险的突变基因群的检测试剂盒具有检测效率高，检测速度快，检出率高等优点。

Description

一组评估乳腺癌风险的突变基因群及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一组评估乳腺癌风险的突变基因群及其检测试剂盒。
背景技术
遗传性乳腺癌最常见病因是BRCA1和BRCA2基因的突变，目前已证实对突变携带者的早期诊断和预防性干预能提高乳腺癌的生存率。但BRCA1/2基因突变只能解释一小部分遗传性乳腺癌的病因，其它在乳腺癌的遗传病因中扮演重要角色的高显性基因还包括TP53、PTEN和CDH1等，另外还有很多中显性和低显性基因也能导致遗传性乳腺癌。
在临床上，很多以乳腺癌为先证者的肿瘤家系中，往往合并各种不同的恶性肿瘤，而不仅仅是乳腺癌和卵巢癌。同时乳腺癌与很多其它遗传性肿瘤综合症的相关性仍不明确，在很多不以乳腺癌为主要表型的遗传性肿瘤综合症中也经常会出现乳腺癌患者(例如：MMR基因)。因此在传统的肿瘤遗传咨询中，在基因检测前先根据先证者以及家族史中肿瘤的不同类型和特征来划分不同的遗传性肿瘤综合症，然后进行相关基因的突变检测以明确病因。这种方法便于确定高危人群，明确易感基因，提高了检测效率，但同样有可能出现遗漏。目前在中国尚没有成熟的肿瘤遗传咨询系统，同时也缺少相关的系统性研究。
近年来高通量测序技术的飞速发展使同时对多个特定的基因进行序列测定和突变检测成为可能，同时其成本与传统测序技术中单个基因的序列测定相当。然而，如何应用高通量测序技术进行胚系突变的检测对不同家族史中恶性肿瘤类型做出限定，特别是针对亚洲人群和中国人群中家族型乳腺癌易感基因方面的研究非常有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前评估乳腺癌患病风险的方法较为局限，特别是针对亚洲人群和中国人群中家族型乳腺癌易感基因突变体与乳腺癌患病风险之间关系的研究非常有限的问题，提供了一组评估乳腺癌风险的突变基因群及其检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一组评估乳腺癌风险的突变基因群，所述突变基因群是包含以下七条基因的突变基因的集合，所述七条基因是：BRCA1基因、BRCA2基因、TP53基因、MLH1基因、MLH3基因、MSH3基因和CDH1基因。
本发明所述突变基因群是由携带突变位点的基因组成。其中所述突变位点为本领域常规的突变位点，较佳地包括indel突变位点(插入或缺失引起的序列改变insertion or deletion，indel)、无义突变位点、拼接区突变位点或错义突变位点，更佳地本发明所述七条基因的突变基因中总携带25个突变位点，该突变位点如表3所示。上述突变位点可以用本领域常规的测序方法检测，所述测序方法较佳地为一代测序方法或二代测序方法，优选地为二代测序方法。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一组评估乳腺癌风险的突变基因群，所述突变基因群是包含以下二十二条基因的突变基因的集合，所述二十二条基因是：BRCA1基因、BRCA2基因、TP53基因、MLH1基因、MLH3基因、MSH3基因、CDH1基因、PALB2基因、FANCD2基因、FANCI基因、SLX4基因、RAD51C基因、RAD50基因、CDKN2A基因、CYP17A1基因、RGSL1基因、FGFR3基因、WRN基因、UGT1A4基因、TNFRSF13B基因、MUTYH基因和SPINK1基因。
较佳地，所述二十二条基因的突变基因中总携带41个突变位点，该突变位点如表4所示。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：一种乳腺癌突变基因，所述乳腺癌突变基因的核苷酸序列是表5所示的22个携带突变位点的基因中的任意一个。
本发明所述乳腺癌突变基因是指携带有突变位点的基因，所述携带突变位点的突变基因如表5所示。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为：一种评估乳腺癌风险的突变基因群的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：检测如本发明所述的突变基因群中的突变基因的探针以及用于二代测序的试剂。
本发明提供一组检测本发明所述突变基因群的探针，所述探针是包含能够与本发明所述突变基因群中的全部突变基因发生杂交反应的探针的集合。利用本发明提供的探针，结合二代测序技术，能够检测本发明所述突变基因群中的全部突变基因。
本发明所述的探针为本领域常规的探针，所述探针较佳地为带有示踪物(或标记物)的寡聚核苷酸片段，只要该探针能与本发明所述的突变基因群中的突变基因杂交即可。本发明所述探针的制备方法为本领域常规制备方法，所述探针的制备方法较佳地包括：采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或其他适宜方法纯化即得。本发明所述探针的设计方法优选地为：选取待测基因的外显子编码区以及侧翼的部分内含子区域，利用Agilent Sureselect XT Custom Kit(700Kb-34Mb)设计探针。
其中所述用于二代测序的试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。
本发明所述的检测试剂盒更佳地还包括将从检测对象中提取的基因组DNA制成可供测序使用的文库的试剂。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五为：一种评估乳腺癌风险的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：扩增本发明所述的突变基因群中突变基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:96所示。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之六为：一种评估乳腺癌风险的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：扩增本发明所述的突变基因群中突变基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:152所示。
本发明提供一组检测本发明所述突变基因群的引物，所述引物是能够扩增出本发明所述突变基因群中的全部突变基因的引物的集合。利用本发明提供的引物，结合一代测序技术，能够检测本发明所述的突变基因群中的全部基因突变。
本发明所述引物只要能与本发明所述突变基因群中的突变基因部分序列互补，并扩增出本发明所述突变基因群中的突变基因即可，本发明所述引物的序列较佳地为：如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:152所示。
本发明所述引物的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为人工合成全序列。
本发明所述检测试剂盒较佳地还包括：dNTP溶液，DNA聚合酶，用于核酸分离或纯化的试剂，阳性对照或阴性对照。
本发明所述的用于核酸分离或纯化的试剂更佳地为抽提所述检测对象中的基因组DNA的试剂，所述试剂较佳地包括：蛋白酶、饱和酚、氯仿：异戊醇(24：1)、醋酸钠、无水乙醇、70％乙醇、TE溶液等，优选地利用Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA以及其它任何可以用于进行DNA提取的试剂或容器。
本发明所述的阳性对照为本领域常规的阳性对照，较佳地为包含本发明所述突变基因群中突变基因序列的基因组DNA储备液或包含相应突变基因群中突变基因序列的质粒作为阳性对照。
本发明所述的阴性对照为本领域常规的阴性对照，较佳地为源于健康人经确认不包含突变基因序列的野生型基因组DNA序列储存液。
本发明所述的检测试剂盒，更佳地还包括从检测对象或肿瘤患者体内提取组织或血液的器械，所述器械较佳地包括：任何能用于取血的釆血针、注射器等。
本发明所述的检测样本较佳地为来自检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可。所述检测样本较佳地为血液、血浆、组织样本和体液中的一种或几种，更佳地为血液或组织样本，优选地为血液。
一种本发明所述检测试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：
(1)利用本发明所述检测试剂盒抽取检测对象外周血提取基因组DNA；
(2)将所得基因组DNA制成可供双端短序列测序、单端长序列测序或单端短序列测序的文库；
(3)对步骤(2)所得DNA测序文库进行测序即得。
其中步骤(1)所述的抽取检测对象外周的方法为本领域常规方法，较佳地为利用检测试剂盒中的采血针抽取检测对象5ml外周血提取基因组DNA。
其中所述提取基因组DNA的方法为本领域常规提取基因组DNA的方法，较佳地为利用Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA(产品号为57704)。
其中步骤(2)所述文库的构建方法为本领域常规的文库构建方法，所述文库的构建方法较佳地包括以下步骤：
将提取的基因组DNA末端补平并进行5’端磷酸化，将30μ1DNA、45μ1纯水、10μ1具有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液、4μ1包含10mM dNTPMix、5μ1T4DNA聚合酶、1μ1Klenow酶、5μ1Τ4连接酶混合后，在20℃温浴30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。末端悬A:将上步的产物溶解在32μ1缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μ1，1mM dATP10μ1、KlenowΕχο-3μ1，在37℃保持30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒)，产物由QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒(part#28004)连接：DNA溶解在10μl缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2χ25μ1、PE Adapter Oligo Mix10μl，DNA连接酶5μ1,在20℃保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA即得文库。
其中步骤(3)所述测序的方法为本领域常规的测序方法，较佳地为利用Illumina HiSeq2000测序仪进行二代测序。利用试剂盒中的探针对表1所示基因捕获目标区域的目标基因进行扩增，根据步骤(2)所制备的文库的不同，可以对所得目标基因序列分别进行双端短序列测序、单端长序列测序或单端短序列测序。用Illumina HiSeq2000测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成。
本发明所述检测试剂盒的使用方法较佳地还包括步骤(4)，将所得测序结果进行统计分析，利用软件Chromas v1.45对将所得测序结果DNA片段进行分析即得。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：利用本发明提供的可用于乳腺癌风险评估的突变基因群，结合高通量测序技术，可以实现在全基因组范围内对与遗传性乳腺癌相关基因进行比较研究，特别是对于评估乳腺癌的发生的风险、以及该疾病在发展过程中涉及复杂生物学过程的多基因异常改变现象具有特殊的优势。本发明提供的用于评估乳腺癌风险的突变基因群的检测试剂盒具有检测效率高，检测速度快，检出率高等优点。
附图说明
图1为第49号家系遗传分析图谱。
图2为第22号家系遗传分析图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1中国人群遗传性乳腺癌易感基因的筛选
材料和方法：
从2011年6月到2012年7月，在复旦大学附属肿瘤医院就诊的乳腺癌患者中，根据以下入选标准，我们进行连续性入组。
入选标准为：乳腺癌患者发病年龄≤35岁，同时至少有一名具有血缘关系的亲属也为恶性肿瘤患者；乳腺癌发病年龄＞35岁，但≤50岁，同时至少有2名同一侧(父系或母系)的具有血缘关系的亲属也为恶性肿瘤；乳腺癌发病年龄＞50岁，同时至少有3名同一侧(父系或母系)的具有血缘关系的亲属也为恶性肿瘤。
通过问卷的方法收集患者的病史和家族史，并收集5ml外周血提取基因组DNA待测，该检测经过复旦大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。
样本处理：样本中基因组利用STAR DNA Blood7k Kit(购买自Hamilton，Germany)进行抽提，具体操作方法请参见该试剂盒的使用说明书。
将基因组DNA切成片段后进行建库。选取待测基因的外显子编码区以及侧翼的部分内含子区域，利用Agilent Sureselect XT Custom Kit(700Kb-34Mb)(该试剂盒购买自Agilent Technologies公司)设计探针对基因组DNA进行捕获，探针的设计方法请参考该试剂盒的使用说明书。基因捕获目标区域如表1所示：
表1 基因捕获目标区域
高通量测序：
将捕获后的目标区域DNA经过纯化处理后在HiSeq2000(Illumina)上进行高通量测序，纯化处理方法和高通量测序方法请参考高通量测序仪HiSeq2000的使用说明书。
生物信息学分析：
应用BWA软件将所得基因组信息与NCBI中规定人类基因组参考序列进行比较(BWA软件的使用方法请参考文献：Li H,Durbin R(2009)Fast andaccurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.Bioinformatics25:1754-1760.)。应用SAMtools软件辨认插入或缺失的序列改变(insertion ordeletion，indel突变)(SAMtools的使用方法请参考文献：Li H,Handsaker B,Wysoker A,Fennell T,Ruan J,et al.(2009)The Sequence Alignment/Map formatand SAMtools.Bioinformatics25:2078-2079.)，应用SOAPsnp软件对单核苷酸序列的改变(SNP)进行确认(SOAPsnp软件的使用方法请参考Li R,Li Y,Fang X,Yang H,Wang J,et al.(2009)SNP detection for massively parallelwhole-genome resequencing.Genome Res19:1124-1132.)，最后应用ANNOVAR软件对indel和SNP进行注释(ANNOVAR软件的使用方法请参考文献：Wang K,Li M,Hakonarson H(2010)ANNOVAR:functional annotationof genetic variants from high-throughput sequencing data.Nucleic Acids Res38:e164.)。
针对检测出的indel突变、无义突变和拼接区突变进行手工筛选后，将测试人群中具有很高检出频率的突变基因排除。所有的错义突变经过dbSNP130、SIFT(软件使用方法请参考网站：http://sift.jcvi.org/)和Polyphen2(软件使用方法请参考网站：http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)软件的筛选后，不符合条件的被排除，所得基因组测序数据经过上述方法处理和过滤后，去除错误和无效的数据。
利用上述方法中筛选出来的碱基改变，对目标DNA片段进行PCR扩增，并利用常规的第一代测序技术进行DNA序列测定，最后用软件Chromasv1.45对DNA片段序列进行分析。经过上述实验确认携带突变基因的先证者，通过从先证者健在的亲属抽取5ml外周血提取基因组DNA，从其过世的亲属中接受过外科手术或活检者体内获取的石蜡包埋组织样本提取正常组织的基因组DNA。对目标DNA片段进行PCR扩增后，应用一代测序技术进行DNA序列测定，最后用软件Chromas v1.45对DNA片段进行分析。
统计学分析：
携带基因突变状态不同的患者被分组进行平均发病年龄的比较，根据不同的情况选取双尾t检验或者ANOVA法，统计软件选用SPSS v19.0。P值为双侧的，P<0.05被认定为具有统计学的显著性。
中国人群遗传性乳腺癌易感基因的筛选结果：
从2011年6月到2012年7月，共有3102例乳腺癌患者在复旦大学附属肿瘤医院接受治疗，其中符合入选标准的患者共134例，其中35例患者拒绝参加研究，共有99例患者进入研究。所有先证者者及其家系的临床病理资料如表2所示，其中90％的先证者为浸润性导管癌。
表2 先证者及其家系的临床病例资料
所有先证者中有13例双侧乳腺癌患者，有11例患者除了乳腺癌外，还患有其他恶性肿瘤。在这些先证者的家族史中，乳腺癌是最常见的恶性肿瘤，占所有家系的59.6％，其它常见的家族史还包括结肠癌、肺癌、胃癌等。在所有的99个家系中，根据NCCN指南的遗传性恶性肿瘤的筛选标准，符合遗传性乳腺癌/卵巢癌综合症(HBOC)的家系有88个，符合Li-Fraumeni综合症(LFS)的家系有11个，符合lynch综合症(LS)的家系有15个，有9个家系不符合以上任何筛选标准。
对99例先证者的157个基因上的2211个外显子进行了检测，共发现4934个indel突变和56847个SNP突变。将所得测序数据经过上述方法进行过滤、筛选，经过一代测序的验证，发现有35例先证者的基因携带突变位点，其余64例先证者未检出基因携带基因突变位点。35例先证者携带分布于不同基因中的41个致病性突变位点，由包含上述致病性突变位点的突变基因组成了突变基因群。其中高显性基因BRCA1基因、BRCA2基因、TP53基因、MLH1基因、MLH3基因、MSH3基因和CDH1基因携带其中25个突变位点的组成的突变基因群以及25个致病性突变位点如表3所示，表3中ID为先证者的编号。
表3 25个致病性突变位点
携带41个致病性突变位点形成的突变基因的序列以及41个致病性突变位点如表4示：
表4 41个致病性突变位点
上述41个致病性突变位点中有22个致病性基因突变位点从未报道，22个新的致病性突变位点以及携带所述致突变位点的基因序列如表5所示：
表5 22个新的致病性突变位点
表4所示41个致病性突变位点分别为：
一、BRCA1基因：
c.754delC：BRCA1基因cDNA第754号碱基的位置缺失一个碱基C，造成BRCA1蛋白质在第252号氨基酸位置上的精氨酸变成缬氨酸，并造成结构移码，在46个氨基酸后蛋白质截断。
c.1214C>G：BRCA1基因cDNA第1214号碱基的位置上碱基C变成G，造成BRCA1蛋白质在第405号氨基酸位置上的丝氨酸变成终止密码子，从而导致蛋白质在此处截断。
c.2110_2111delAA：BRCA1基因cDNA第2110和2111号位置上的碱基AA缺失，从而造成BRCA1蛋白质在第704号氨基酸的位置天冬酰胺变成半胱氨酸，并造成结构移码，在7个氨基酸后蛋白质截断。
c.4228delG：BRCA1基因cDNA第4228号位置上的碱基G缺失，导致BRCA1蛋白质第1410号氨基酸位置上的谷氨酸变成赖氨酸，并造成结构移码，在5个氨基酸后蛋白质截断。
c.5468-1_5474del8：BRCA1基因cDNA第5468位置为内含子与外显子拼接区的第一个碱基，在基因组DNA上，该位置先前推进一个碱基(5468-1，在内含子上)开始，向后一直到cDNA第5474位置，一共缺失了8个碱基，造成BRCA1蛋白质第1410号氨基酸位置上的丙氨酸变成甘氨酸，并造成结构移码，在9个氨基酸后蛋白质截断。
c.5503C>T：BRCA1基因cDNA第5503号碱基的位置上碱基C变成T，造成BRCA1蛋白质在第1835号氨基酸位置上的精氨酸变成成终止密码子，从而导致蛋白质在此处截断。
二、BRCA2基因
c.2442delC：BRCA2基因cDNA第2442号位置上的碱基C缺失，导致BRCA2蛋白质第815号氨基酸位置上的蛋氨酸变成色氨酸，并造成结构移码，在10个氨基酸后蛋白质截断。
c.2808_2811delACAA：BRCA2基因cDNA第2808到2810号位置上的碱基ACAA缺失，从而造成BRCA2蛋白质在第938号氨基酸的位置丙氨酸变成脯氨酸，并造成结构移码，在21个氨基酸后蛋白质截断。
c.5682C>G：BRCA2基因cDNA第5682号碱基的位置上碱基C变成G，造成BRCA2蛋白质在第1894号氨基酸位置上的酪氨酸变成终止密码子，从而导致蛋白质在此处截断。
c.5699C>G：BRCA2基因cDNA第5699号碱基的位置上碱基C变成G，造成BRCA2蛋白质在第1900号氨基酸位置上的丝氨酸变成终止密码子，从而导致蛋白质在此处截断。
c.7007G>A：BRCA2基因cDNA第7007号碱基的位置上碱基G变成A，造成BRCA2蛋白质在第2336号氨基酸位置上的精氨酸变成组氨酸。
c.7142delC：BRCA2基因cDNA第7142号位置上的碱基C缺失，导致BRCA2蛋白质第2381号氨基酸位置上的脯氨酸变成组氨酸，并造成结构移码，在13个氨基酸后蛋白质截断。
c.7409dupT：BRCA2基因cDNA第7409号位置上的碱基T重复一次，导致BRCA2蛋白质第2471号氨基酸位置上的苏氨酸变成组氨酸，并造成结构移码，在4个氨基酸后蛋白质截断。
c.8485C>T：BRCA2基因cDNA第8485号碱基的位置上碱基C变成T，造成BRCA2蛋白质在第2829号氨基酸位置上的谷氨酰胺变成终止密码子，从而导致蛋白质在此处截断。
c.8517C>A：BRCA2基因cDNA第8517号碱基的位置上碱基C变成A，造成BRCA2蛋白质在第2839号氨基酸位置上的酪氨酸变成终止密码子，从而导致蛋白质在此处截断。
c.8956_8957insAA：BRCA2基因cDNA第8956到8957号位置上插入碱基AA，从而造成BRCA2蛋白质在第2986号氨基酸的位置异亮氨酸变成赖氨酸，并造成结构移码，在3个氨基酸后蛋白质截断。
18个先证者(18.2％)携带BRCA1和BRCA2突变位点，其中7个在BRCA1基因上，11个在BRCA2基因上。其中7个突变位点既往有报道，而其它11个突变位点为新发现。有一个BRCA1基因上的突变5589del8，在我们以往的研究中发现在中国人群中重复出现，在本次研究中发现有2个先证者携带这个突变。另外一个BRCA2基因上的突变2670delC，也在先证者中发现了2个携带者。所有BRCA1/2突变携带者所在家系都符合NCCN的遗传性乳腺癌/卵巢癌综合症标准，占所有88个综合症家系的20.5％。在所有7例携带BRCA1基因突变的先证者中，5例为三阴性乳腺癌患者，在11例BRCA2突变携带者中，2例的乳腺癌为三阴性。
三、TP53基因
c.320dupA：TP53基因cDNA第320号位置上的碱基A重复一次，导致BRCA2蛋白质第107号氨基酸位置上的酪氨酸变成终止密码子，从而导致蛋白质在此处截断。
c.523C>G：TP53基因cDNA第523号碱基的位置上碱基C变成G，造成TP53蛋白质在第2336号氨基酸位置上的精氨酸变成组氨酸。
c.839G>C：TP53基因cDNA第839号碱基的位置上碱基G变成C，造成TP53蛋白质在第280号氨基酸位置上的精氨酸变成苏氨酸。
共有3个先证者携带TP53基因的突变，包括一个移码突变c.522_523insA和两个错义突变c.725C>G and c.1041G>C，两个错义突变的位点在P53基因突变数据库(www-p53.iarc.fr,database version R16)有报道，而移码突变则为新发现的位点。在3个携带突变的家系中，只有一个符合NCCN的LFS标准，占所有15个符合LFS标准家系的6.7％。在3个携带突变的先证者中，有2个的乳腺癌发病年龄小于30岁，有一个的家系符合LFS标准，而另一个则不符合，突变携带者占所有乳腺癌发病年龄小于30岁者的10％。最后一个携带者的发病年龄为37岁，家系不符合LFS标准，但家族成员中有乳腺恶性分叶状肿瘤的患者。在所有99个家系中，有2个家系的家族成员中有乳腺恶性分叶状肿瘤的患者，这2个家系都携带TP53的突变。
四、MMR基因
MLH1 c.194G>A：MLH1基因cDNA第194号碱基的位置上碱基G变成A，造成MLH1蛋白质在第65号氨基酸位置上的甘氨酸变成天冬氨酸。
MLH3 c.1189_1191delTAT：MLH3基因cDNA第1189到1191号位置上的碱基TAT缺失，从而造成MLH3蛋白质在第397号氨基酸位置上的异亮氨酸缺失。
MSH3 c.162_179del18：MSH3基因cDNA第162到179号位置上的18个碱基缺失，从而造成MSH3蛋白质从第57号到62号位置上的6个氨基酸缺失。
MSH3 c.199_207del9：MSH3基因cDNA第199到207号位置上的9个碱基缺失，从而造成MSH3蛋白质从第67号到69号位置上的3个氨基酸缺失。
MSH3 c.2305delG：MSH3基因cDNA第2305号位置上的碱基G缺失，导致MSH3蛋白质第769号氨基酸位置上的缬氨酸开始蛋白质截断。
5个先证者携带MMR基因突变，一个突变在MLH1基因上，一个在MLH3基因上，另外3个都在MSH3基因上。MLH1基因上的突变为错义突变，在既往的研究中有报道。MLH3和MSH3上的突变都为indel改变，既往都没有报道。在5个携带MMR突变位点的先证者所在的家系中，有2个符合NCCN的lynch综合症筛选标准，其中一个为MLH1基因，一个为MSH3基因，他们占所有符合LS标准的15个家系的13.3％。
五、其它基因
CDH1 c.1296C>G：CDH1基因cDNA第1296号碱基的位置上碱基C变成G，造成CDH1蛋白质在第432号氨基酸位置上的天冬酰胺变成赖氨酸。
PALB2 c.1050_1051delinsTCT：PALB2基因cDNA第1050到1051号位置上缺失两个碱基，并插入碱基TCT，从而造成PALB2蛋白质在第350号氨基酸位置上的谷氨酰胺变成组氨酸，并造成结构移码，在11个氨基酸后蛋白质截断。
FANCD2 c.4234_4239delAGTGAG：FANCD2基因cDNA第4234到4239号位置上的6个碱基AGTGAG缺失，从而造成FANCD2蛋白质从第1412号到1413号位置上的2个氨基酸缺失。
FANCI c.2699_2704dupGGCAAT：FANI基因cDNA第2699到2704号位置上的6个碱基GGCAAT重复一次，从而造成FANCI蛋白质从第901号到902号位置插入2个氨基酸。
SLX4 c.3583_3585delATT：SLX4基因cDNA第3583到3585号位置上的3个碱基ATT缺失，从而造成SLX4蛋白质第1195号位置上的异亮氨酸缺失。
RAD51C c.343dupG：RAD51C基因cDNA第343号位置上的碱基G重复一次，导致RAD51C蛋白质第115号氨基酸位置上的缬氨酸变成甘氨酸，并造成结构移码，在24个氨基酸后蛋白质截断。
RAD50 c.1291_1295delGAGAT：RAD50基因cDNA第1291号到1295号位置上缺失5个碱基GAGAT，导致RAD50蛋白质第431号氨基酸位置上的谷氨酸变成赖氨酸，并造成结构移码，在3个氨基酸后蛋白质截断。
CDKN2A c.480G>A：CDKN2A基因cDNA第480号碱基的位置上碱基G变成A，造成CDKN2A蛋白质在第160号氨基酸位置上的色氨酸变成终止密码子，从而导致蛋白质在此处截断。
CYP17A1 c.987delC：CYP17A1基因cDNA第987号位置上的碱基C缺失，导致CYP17A1蛋白质从第329号氨基酸位置上的酪氨酸开始蛋白质截断。
RGSL1 c.1357C>T：RGSL1基因cDNA第1357号碱基的位置上碱基C变成T，造成RGSL1蛋白质在第453号氨基酸位置上的谷氨酰胺变成终止密码子，从而导致蛋白质在此处截断。
FGFR3 c.2072delG：FGFR3基因cDNA第2072号位置上的碱基G缺失，从而造成FGFR3蛋白质在第691号氨基酸的位置上甘氨酸变成丙氨酸，并造成结构移码，在17个氨基酸后蛋白质截断。
WRN c.4245dupT：WRN基因cDNA第4245号位置上的碱基T重复一次，导致WRN蛋白质从第1416号氨基酸位置上的天冬氨酸开始蛋白质截断。
UGT1A4 c.175delG：UGT1A4基因cDNA第175号位置上的碱基G缺失，从而造成UGT1A4蛋白质在第59号氨基酸的位置上缬氨酸变成色氨酸，并造成结构移码，在7个氨基酸后蛋白质截断。
TNFRSF13B c.704_705delCT：TNFRSF13B基因cDNA第704和705号位置上的碱基CT缺失，从而造成TNFRSF13B蛋白质在第235号氨基酸的位置脯氨酸变成精氨酸，并造成结构移码，在169个氨基酸后蛋白质截断。
TNFRSF13B c.102delC：TNFRSF13B基因cDNA第102号位置上的碱基C缺失，从而造成TNFRSF13B蛋白质在第36号氨基酸的位置上的谷氨酸变成赖氨酸，并造成结构移码，在48个氨基酸后蛋白质截断。
MUTYH c.850-2A>G：MUTYH基因cDNA第850位置为内含子与外显子拼接区的第一个碱基，在基因组DNA上，该位置先前推进2个碱基的内含子850-2位置上的A变成G，这种拼接区的突变，容易造成转录后RNA剪切的错误，从而导致蛋白质的改变。
SPINK1 c.194+2T>C：SPINK1基因cDNA第194位置为内含子与外显子拼接区的最后一个碱基，在基因组DNA上，该位置先后推进2个碱基的内含子194+2位置上的T变成C，这种拼接区的突变，容易造成转录后RNA剪切的错误，从而导致蛋白质的改变。
发现一例携带CDH1突变位点的先证者，发病年龄为47岁，病理类型为浸润性导管癌。患者的母亲和舅舅都为胃癌患者，但病理类型不详。
在除BRCA1/2之外的携带可能导致蛋白质功能丧失突变的基因中，我们还发现有6个为Fanconi Anemia通路相关基因，它们是PALB2、FANCD2、FANCI、SLX4、RAD50和RAD51C，占非BRCA1/2基因的27.3％(见表)。
其它非BRCA1/2基因还包括与遗传性前列腺癌相关的基因RGSL1，与家族性黑色素瘤和胰腺癌相关的基因CDKN2A，与家族性男性乳腺癌相关的基因AR，与遗传性胰腺炎相关的基因SPINK1，与CVID相关的基因TNFRSF13B，编码UDP-葡萄糖醛酸转移酶的基因UGT1A4，以及与Saethre-Chotzen综合症相关的基因FGFR3，目前已有研究报道这些基因的突变同样会增加乳腺癌的发病风险。
另外，还有与Werner综合症相关的基因WRN、MAP相关基因MUTYH和CAH相关基因CYP17A1，它们都以常染色体隐性遗传模式致病。
从本实施例可见，与单独携带BRCA1/2突变位点的患者相比，合并携带BRCA1/2和其它突变位点的患者的乳腺癌发病年龄要早，虽然这两者的差别没有达到统计学的显著性(P＝0.07)，但后者比前者要早6年(42岁vs48岁)。
在单突变位点和多突变位点的家系中，我们还发现多突变位点与单突变位点基因型相比，会表现出完全不同的表型。检测结果表明：第49号家系为单独携带MSH3突变位点的家系，其表现为典型的lynch综合症特征，同时家系分析也验证了MSH3突变位点的基因型与患恶性肿瘤的表型相吻合，遗传家系分析结果如图1所示。第22号家系为合并携带MSH3突变位点与BRCA1突变位点的家系，家系表现为典型的HBOC综合症特性，而没有lynch综合症的表型，同时家系分析也证实表型与BRCA1的基因型相吻合，而与MSH3基因型无法完全吻合，遗传家系分析结果如图2所示。其中BC乳腺癌；OC，卵巢癌；PC，胰腺癌；GC，胃癌；Lym，淋巴瘤；LC，肝癌；RC，直肠癌；NC，鼻咽癌；CC，结肠癌。
这些先证者的发病年龄、家族史特点和肿瘤病理类型见表6。
表6 突变携带者的发病年龄、家族史特点和肿瘤病理类型
ID 年龄 IHC 家族史
56 35 HR-/Her-2- HBOCS
6 32 HR-/Her-2- HBOCS
22 37 HR-/Her-2- HBOCS
5 40 HR-/Her-2- HBOCS
26 40 HR+/Her-2- HBOCS
52 34 HR+/Her-2- HBOCS
29 39 HR-/Her-2- HBOCS
3 46 HR+/Her-2- HBOCS
4 42 HR+/Her-2- HBOCS,LS
68 38 HR+/Her-2- HBOCS
2 37 HR+/Her-2+ HBOCS
7 30 HR+/Her-2- HBOCS
54 70 HR+/Her-2- HBOCS
24 26 HR-/Her-2- HBOCS,LS
45 43 HR+/Her-2- HBOCS
42 34 HR+/Her-2- HBOCS,LS
13 32 HR+/Her-2- HBOCS
71 28 UA HBOCS
65 30 UA HBOCS,LFS,LS
83 20 HR+/Her-2+ HBOCS
38 37 UA HBOCS
46 52 HR+/Her-2- HBOCS,LS
67 46 HR+/Her-2- HBOCS
49 32 HR-/Her-2+ HBOCS,LFS,LS
75 51 HR+/Her-2- HBOCS
94 47 HR-/Her-2- HBOCS
51 45 HR+/Her-2- HBOCS
35 30 HR+/Her-2+ HBOCS
86 52 HR-/Her-2- HBOCS
77 34 HR+/Her-2+ HBOCS
64 27 HR-/Her-2- HBOCS
88 45 HR+/Her-2- HBOCS
15 34 HR+/Her-2- HBOCS,LFS
60 47 HR-/Her-2- HBOCS,LS
96 35 HR+/Her-2- HBOCS
表6中英文缩写的含义分别是：IHC肿瘤免疫组化类型，HR激素受体；HBOCS遗传性乳腺癌/卵巢癌综合征；LFS Li-Fraumeni综合症；LS Lynch综合症；UA不能获得；InDels小插入或缺失；fs移码突变；non-fs非移码突变。
根据所得基因组测序结果判断：突变基因群与遗传性乳腺癌具有一定的关联度。本发明共筛选到22个在遗传性乳腺癌中发生突变的基因，所述22个基因共携带41个致病性突变位点。利用上述携带致病性突变位点的基因组成的突变基因群，可以评估和预防遗传性乳腺癌风险。该基因群经大样本临床病例验证后，可以应用于对遗传性乳腺癌风险进行评估和预测，指导临床实施个体化局部治疗和全身化疗，大幅度提高遗传性乳腺癌患病风险的评估准确率。
高通量测序技术可以实现在全基因组范围内对与疾病相关基因进行比较研究，特别是对肿瘤发生和发展所涉及的复杂生物学过程中多基因异常改变的研究具有特殊的优势。
实施例2合成试剂盒所需要的引物
引物合成：针对本发明所述突变位点位点设计了如下引物，如表7所示，引物序列请参见序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:152。
表7 肿瘤突变位点位点引物
表7中Ex-Fw和Ex-Rv引物的含义为巢式PCR中的第一对PCR引物，In-Fw和In-Rv引物的含义为巢式PCR反应中的巢式引物。
利用表7所示的引物对病人基因组DNA进行巢式PCR，所述巢式PCR的反应体系和反应程序为本领域常规技术，根据目的片段的大小适当调整巢式PCR反应程序即可，并利用一代测序技术对所得PCR产物进行测序。利用本方法能检测出本发明所述全部致病性突变位点，所述致病性突变位点以及携带所述致病性突变位点的基因序列如表4所示。
实施例3制备检测试剂盒所需的探针
基因的捕获目标区域如表1所示：选取待测基因的外显子编码区以及侧翼的部分内含子区域，利用Agilent Sureselect XT Custom Kit(700Kb-34Mb)(该试剂盒购买自Agilent Technologies公司)设计探针，所得探针的序列与表4所示携带致病性突变位点的基因序列相同或互补，探针的设计方法请参考该试剂盒的使用说明书。
实施例4利用实施例2所述检测试剂盒检测临床乳腺癌病人样本
步骤1：取检测对象血液，利用检测试剂盒中的采血针抽取检测对象5ml外周血提取基因组DNA。
步骤2：提取血液基因组DNA。利用Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA(该试剂盒的产品号为57704)。
步骤3：利用实施例2合成的引物，以步骤(2)所得病人基因组DNA为模板，进行巢式PCR扩增。所述巢式PCR的反应体系和反应程序为本领域常规方法，根据目的片段的大小适当调整巢式PCR反应程序即可。利用一代测序技术对所得PCR产物进行测序，能够检测出本发明所述全部致病性突变位点，所述致病性突变位点以及携带所述致病性突变位点的基因序列如表4所示。
步骤4：结果统计分析，利用软件Chromas v1.45对将所得测序结果DNA片段进行分析即得。
在99例乳腺癌患者中，当只检测BRCA1和BRCA2两个基因时，可以发现18个突变位点携带者(18.2％)；当同时检测BRCA1、BRCA2、TP53、CDH1、MLH1、MLH3和MSH3这7个高显性基因时，可以发现26例携带突变位点的患者(26.3％)；当检测所有22个基因时，可以发现所有35例携带突变位点的患者(35.4％)。
实施例5利用实施例3所述检测试剂盒检测临床乳腺癌病人样
1、试剂盒的使用：
步骤1：取检测对象血液，利用检测试剂盒中的采血针抽取检测对象5ml外周血提取基因组DNA。
步骤2：提取血液基因组DNA。可以使用Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA(产品号为57704)。
步骤3：将所得基因组DNA制成可供测序的文库。将所得血液基因组DNA制成可供双端短序列测序、单端长序列测序或单端短序列测序的文库，文库的制备方法包括以下步骤：
将提取的基因组DNA末端补平并进行5’端磷酸化，将30μ1DNA、45μ1纯水、10μ1具有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液、4μ1包含10mM dNTPMix、5μ1T4DNA聚合酶、1μ1Klenow酶、5μ1Τ4连接酶混合后，在20℃温浴30分钟(试剂购买自Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。末端悬A:将上步的产物溶解在32μ1缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μ1，1mM dATP10μ1、KlenowΕχο-3μ1，在37℃保持30分钟(试剂购买自Illumina样本准备试剂盒)，产物由QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒(part#28004)连接：DNA溶解在10μl缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2χ25μ1、PE Adapter Oligo Mix10μl，DNA连接酶5μ1,在20℃保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA即得文库。
步骤4：利用实施例3制备的探针从所述DNA测序文库对目标DNA进行捕获。基因的捕获目标区域如表1所示。对所得目标DNA分别进行双端短序列测序、单端长序列测序或单端短序列测序。用Illumina HiSeq2000测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成(由Illumina公司)。
步骤5：结果统计分析，利用软件Chromas v1.45对将所得测序结果DNA片段进行分析即得。
在与实施例4相同的99例乳腺癌患者中，当只检测BRCA1和BRCA2两个基因时，可以发现18个突变位点携带者(18.2％)；当同时检测BRCA1、BRCA2、TP53、CDH1、MLH1、MLH3和MSH3这7个高显性基因时，可以发现26例携带突变位点的患者(26.3％)；当检测所有22个基因时，就可以发现所有35例携带突变位点的患者(35.4％)。
对比实施例1根据传统的NCCN的标准检测临床乳腺癌病人样本
目前在NCCN指南中，涉及遗传性肿瘤风险评估和预防的指南包括乳腺癌、卵巢癌和结直肠癌。我们根据NCCN的标准把实施例1所述的99例乳腺癌患者人群划分为遗传性乳腺癌/卵巢癌综合症、Li-Fraumeni综合症和Lynch综合症等，利用实施例2和实施例3所述检测试剂盒分别对检测对象进行检测。
经过统计后的检测结果表明：将实施例4所述99个乳腺癌患者根据NCCN的HBOCS标准能找出18例BRCA1/2突变位点携带者。利用本发明所述检测试剂盒同时检测BRCA1、BRCA2、TP53、CDH1、MLH1、MLH3和MSH3这7个高显性基因中携带的25个突变位点时，能检出18例BRCA1/2突变携带者，当检测所有22个基因上的41个突变位点时，可以发现18例BRCA1/2突变携带者(参见实施例5)。根据传统的一代测序技术最终确定出18例BRCA1/2突变携带者(参见实施例4)。
利用NCCN的TP53基因检测标准(Li-Fraumeni syndrome)，能检测出2例TP53基因突变携带者(2％)。利用本发明所述检测试剂盒检测BRCA1、BRCA2、TP53、CDH1、MLH1、MLH3和MSH3这7个高显性基因中携带的25个突变位点时，能检出3(3％)例TP53基因突变携带者。检测所有22个基因上的41个突变位点则可以检测出3例TP53突变位点携带者(3％)。这些患者根据传统的一代测序技术最终确定出3例TP53突变位点携带者。因此利用本发明试剂盒的检出率比NCCN标准提高33％。
利用NCCN的MMR基因检测标准(Lynch syndrome)，能检测出2例MMR突变位点携带者(2％)。利用本发明所述检测试剂盒检测BRCA1、BRCA2、TP53、CDH1、MLH1、MLH3和MSH3这7个高显性基因中携带的25种突变位点时，能检出3例MMR突变位点携带者(3％)。检测所有22个基因上的41个突变位点则可以找到所有5例MMR突变位点携带者(5％)。这些患者根据传统的一代测序技术最终确定出5例。因此利用本发明试剂盒的检出率比NCCN标准提高60％。
在所有患者中利用NCCN只检测BRCA1/2基因的标准，检测出18例BRCA1/2突变位点携带者，而利用本发明所述检测试剂盒检测后，发现除了18例BRCA1/2突变位点携带者之外(18.2％)，还另外有17例患者携带其它基因的突变(一共35例，35.3％)，这些患者根据传统的一代测序技术最终确定出35例。因此利用本发明所述试剂盒对突变位点的检出率比传统方法提高了50％。
通过上述实验结果可以看出，应用传统的NCCN指南进行检测前的筛选，能够找到大部分的突变位点携带者，但仍然有一定的遗漏；而应用本发明所述检测试剂盒能够对所有已知的待测基因同时进行检测，不受先证者家族史的限制，能够弥补传统遗传咨询模式的缺陷。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一组评估乳腺癌风险的突变基因群，其特征在于，所述突变基因群是包含以下七条基因的突变基因的集合，所述七条基因是：BRCA1基因、BRCA2基因、TP53基因、MLH1基因、MLH3基因、MSH3基因和CDH1基因。
2.如权利要求1所述的突变基因群，其特征在于，所述七条基因的突变基因中总携带25个突变位点，该突变位点如表3所示。
3.一组评估乳腺癌风险的突变基因群，其特征在于，所述突变基因群是包含以下二十二条基因的突变基因的集合，所述二十二条基因是：BRCA1基因、BRCA2基因、TP53基因、MLH1基因、MLH3基因、MSH3基因、CDH1基因、PALB2基因、FANCD2基因、FANCI基因、SLX4基因、RAD51C基因、RAD50基因、CDKN2A基因、CYP17A1基因、RGSL1基因、FGFR3基因、WRN基因、UGT1A4基因、TNFRSF13B基因、MUTYH基因和SPINK1基因。
4.如权利要求3所述的突变基因群，其特征在于，所述二十二条基因的突变基因中总携带41个突变位点，该突变位点如表4所示。
5.一种乳腺癌突变基因，其特征在于，所述乳腺癌突变基因的核苷酸序列是表5所示的22个携带突变位点的基因中的任意一个。
6.一种评估乳腺癌风险的突变基因群的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：检测如权利要求1～4中任一项所述的突变基因群中的突变基因的探针以及用于二代测序的试剂。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括将检测对象中抽提出的基因组DNA制成可供测序的文库的试剂。
8.一种评估乳腺癌风险的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：扩增权利要求1或权利要求2所述的突变基因群中突变基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:96所示。
9.一种评估乳腺癌风险的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：扩增权利要求3或权利要求4所述的突变基因群中突变基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:152所示。
10.如权利要求8或9所述的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒还包括：dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分离或纯化核酸的试剂，阳性对照或阴性对照。
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