CN106929564A

CN106929564A - 乳腺癌易感基因检测试剂盒

Info

Publication number: CN106929564A
Application number: CN201511020828.4A
Authority: CN
Inventors: 王秀莉; 王旺; 玄兆伶; 李大为; 梁峻彬; 陈重建
Original assignee: ANNOROAD GENETIC TECHNOLOGY (BEIJING) Co Ltd
Current assignee: Annuo uni-data (Yiwu) Medical Inspection Co. Ltd.; Zhejiang Annuo uni-data Biotechnology Co. Ltd.
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: CN106929564B

Abstract

本发明提供一种乳腺癌易感基因检测试剂盒。本发明的乳腺癌易感基因检测试剂盒包含12组用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变热点的引物组，能够使对上述乳腺癌易感基因的PCR扩增效率基本相同，从而能够使以所述PCR扩增产物作为希望测序的DNA片段的二代测序最终获得的针对上述突变热点的测序数据具有良好的均一性。

Description

乳腺癌易感基因检测试剂盒

技术领域

具体而言，本发明涉及用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的二代测序DNA文库构建方法及检测试剂盒。

背景技术

乳腺癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌而位居第二位。在我国的许多大中城市，乳腺癌已占妇女恶性肿瘤死因的首位，严重威胁着女性健康。

早诊断早发现，乳腺癌病情的治愈还是相当乐观的。在第Ⅳ期得到诊断的乳腺癌患者只有20％能够存活到5年之后，而在第Ⅰ期就诊的患者100％活到5年之后。因此乳腺癌的早期诊断是目前亟待解决的问题。

BRCA(breast cancer susceptibility gene)是遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其与乳腺癌密切相关。自BRCA1和BRCA2基因成功地定位、分离后，国内外学者对其进行了广泛、深入的研究。BRCA1和BRCA2为乳腺癌遗传性主要的风险因子。二者都是抑癌基因，均呈常染色体显性遗传，且容易引发早年发病。

BRCA1基因定位于17q21，编码BRCA1蛋白含1863个氨基酸，在维持细胞正常增殖、分化中发挥重要作用，并参与DNA损伤修复功能，是第1个被证实和克隆的BRCA。BRCA1基因突变会引发DNA修复功能障碍，使细胞代谢和增殖紊乱，促进细胞恶变和肿瘤发生。

BRCA2基因位于13q12，编码BRCA2蛋白含3418个氨基酸，对细胞生长的调节有重要作用。BRCA2变异范围达整个基因的编码区，目前尚未发现非编码区的变异。BRCA2基因发生突变后表达的蛋白质失去了修复DNA损伤的功能，导致染色体不稳定，促进肿瘤发生。总之，BRCA1和BRCA2突变、功能缺失，造成基因不稳定，逃避集体防御体系监视，使细胞非控制性增殖，导致肿瘤的发生^[1]。

有研究表明，有5％～10％的乳腺癌和10％～15％的卵巢癌是由BRCA1/2突变引起的，而在乳腺癌和卵巢癌高发家族中80％的患者BRCA1/2基因存在突变。与正常女性相比，携带BRCA1或BRCA2基因突变的女性，患乳腺癌或卵巢癌的风险高5-20倍，一生中可能有45％-65％的概率患乳腺癌，11％-40％的概率患卵巢癌，且易早年发病^[2,3]。据报道，乳腺癌的BRCA1和BRCA2基因检测方法有很多，Ozcelik H等曾利用Long-range PCR扩增BRCA1和BRCA2两个基因全基因，设计17对引物，采用invitrogen公司的SequalPrep Long PCR体系扩增，由于扩增片段长度太长，引物设计区域不恰当，导致出现扩增产物中非特异带型较多，干扰BRCA1和BRCA2目标区域富集^[4]。利用多重PCR技术将BRCA1和BRCA2外显子区域扩增富集，需设计几十到几百对引物分到不同PCR体系中^[5-7]。同样地，扩增片段、引物设计、退火温度和延伸时间优化不恰当，会导致非特异性条带的增多，可能有十几对引物混合在一个反应中，经常会导致交互配对或增加错配产物，影响目标区域扩增效率及产物量，最终导致测序数据均一性差，非特异序列占比多。

因此本领域迫切需要建立新的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测技术。通过对样本的BRCA1和BRCA2的高通量单重PCR扩增富集技术，可更全面准确的评估患乳腺癌的风险。能够早期客观、灵敏和稳定的检测BRCA1和BRCA2基因突变，以便进行及时、有针对性的治疗或预防乳腺癌，降低医疗成本，节约社会资源。

参考文献

非专利文献

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[2]黄清丰,李茹捧,付倩,吕晶,张兰.基因导向的乳腺癌治疗进展研究[J].中国医药指南.2014,12(6):39.

[3]Antoniou A,Pharoah P D,Narod S,et al.Average risks of breast andovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in caseseries unselected for family history:A combined analysis of 22 studies.Am JHum Genet,2003,72:1117-1130.

[4]Ozcelik H,Shi X,Chang MC,et al.Long-range PCR andnext-generation sequencing of BRCA1 and BRCA2 in breast cancer.J Mol Diagn.2012,14:467–475.

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[7]Ellison G,Huang S,Carr H,et al.A reliable method for the detection ofBRCA1 and BRCA2 mutations in fixed tumour tissue utilising multiplexPCR-based targeted next generation sequencing[J].BMC clinical pathology,2015,15(1):5.

发明内容

一种可行的策略是，对于BRCA1/2中的突变热点，分别设计引物并在独立的PCR反应体系中以同一PCR反应条件将它们分别扩增出来。但是，在这种策略下，如何设计引物使得各突变热点在同一PCR反应条件下的扩增效率基本一致、从而使最终获得的测序数据具有良好的均一性，且不产生非特异产物，成为最大的难点。

本发明的目的在于提供：能够在同一PCR反应条件下、以基本一致的扩增效率扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的三个突变热点的扩增试剂盒以及PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变热点的方法；使最终获得的对于这些突变热点的测序数据具有良好均一性的、构建用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的二代测序DNA文库的方法；以及用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的试剂盒。

本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现，通过使用特定的PCR扩增引物，可以在同一PCR反应程序中同时扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的三个突变热点，并达到基本一致的扩增效率，进而使得最终获得的对于这些突变热点的测序数据具有良好均一性，从而完成了本发明。

即，本发明包括：

1.一种构建用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的二代测序DNA文库的方法，其包括：

步骤A：分别以等摩尔量的人基因组DNA作为模板，使用等摩尔量的下述引物组，在同一PCR反应条件下，扩增人基因组DNA片段；

步骤B：以扩增得到的人基因组DNA片段的混合物作为希望进行测序的DNA片段，构建二代测序DNA文库；

其中，所述引物组为

引物组1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；

引物组2：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；

引物组3：核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物；以及

引物组4：核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物；

引物组5：核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物；

引物组6：核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物；

引物组7：核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的下游引物；

引物组8：核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示的下游引物；

引物组9：核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的下游引物；

引物组10：核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的下游引物；

引物组11：核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示的下游引物；以及

引物组12：核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示的下游引物；

所述PCR反应条件的变性温度为95℃，退火温度为56℃。

2.根据项1所述的方法，其中，所述PCR反应条件的延伸温度为72℃。

3.根据项1或2中任一项所述的方法，其中，所述模板在进入该PCR反应的温度循环前在95℃进行了3分钟的预变性。

4.根据项1～3中任一项所述的方法，其中，所述步骤B包括：

步骤B-1：将所述人基因组DNA片段进行末端修复，得到平末端的DNA片段；

步骤B-2：将所述平末端的DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；

步骤B-3：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及

步骤B-4：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。

5.根据项4所述的方法，其中，所述步骤B还包括：

在所述步骤B-4之后进行的步骤B-5：从所述扩增产物中纯化回收具有目的大小的片段。

6.根据项4或5所述的方法，其中，在所述步骤B-1与所述步骤B-2之间、所述步骤B-2与所述步骤B-3之间以及所述步骤B-3与所述步骤B-4之间，还包括纯化步骤。

7.一种用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的试剂盒，其包括：

用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂；

用于构建二代测序DNA文库的试剂；和

用于对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂；

其中，所述用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂包括下述引物组1～12：

引物组12：核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示的下游引物。

优选地，所述SEQ ID NO：1～24的引物是等摩尔量的。

8.根据项7所述的试剂盒，其中，所述用于构建二代DNA测序文库的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4 DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Taq酶、dNTP、T4多聚核苷酸激酶以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液；所述对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：再合成试剂、线性化P7接头、线性化P5接头、DNA聚合酶、dNTP、冲洗杂交液/缓冲液、100％甲酰胺(质量/体积)、用于测序的Read 2引物、Index i7测序引物、用于测序的Read 1引物、Hiseq Rapid PE Flow Cell、ddH₂O以及增强光感度/照相用试剂；所述用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：dNTP、MgC1₂、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。

9.一种用于扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂盒，其包括用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂；

优选地，所述SEQ ID NO：1～24的引物是等摩尔量的。

10.根据项9所述的试剂盒，其中，所述用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：dNTP、MgC1₂、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。

发明效果

根据本发明，通过使用特定的PCR扩增引物，可以在同一PCR反应程序中同时扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的三个突变热点，并达到基本一致的扩增效率，进而使得最终获得的对于这些突变热点的测序数据具有良好均一性。

发明的具体实施方式

在一个方面中，本发明提供一种构建用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的二代测序DNA文库的方法(本发明的建库方法)，其包括：

步骤A：分别以等摩尔量的人基因组DNA作为模板，使用等摩尔量的下述引物组1～12，在同一PCR反应条件下，扩增人基因组DNA片段；

所述PCR反应条件的变性温度为95℃，退火温度为56℃。

在采用二代测序方法检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的情况下，出于节省测序数据、降低测序成本的考虑，希望最终获得的测序数据在各个突变位点间具有良好的均一性，即，在一定的测序深度下(例如100×、500×或1000×等)，所获得的包含各个突变位点的reads的数量(即覆盖深度)基本一致(例如±20％一致、±10％一致或±5％一致)。这种均一性取决于希望进行测序的DNA片段中包含各个突变位点的DNA片段的数量是否基本相等。如果希望进行测序的DNA片段是通过分别使用等量的基因组DNA模板以及扩增引物在同一PCR反应条件下进行PCR扩增而得到的，那么，包含各个突变位点的DNA片段的数量是否基本相等取决于针对于每个位点的扩增引物组在所述PCR反应条件下的总扩增效率是否基本一致。

通过使用上述引物组及PCR反应条件，可以将乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2中的三个突变热点以基本上相同的扩增效率扩增出来。

所述三个突变热点是指：人17号染色体第41276047–41276048位碱基(Chr17:41276047-41276048)、人17号染色体第41209083位碱基(Chr17:41209083)以及人13号染色体第32914438位碱基(Chr13:32914438)。

所述引物组1～12的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO：1

TGGAGAACAAGGAATCATTTTC

SEQ ID NO：2

TGAAGTTGTCATTTTATAAACCTTT

SEQ ID NO：3

GCCTAATCTTACTAGACATGTCT

SEQ ID NO：4

AGAAATGGATTTATCTGCTCTTC

SEQ ID NO：5

GGTCAATTCTGTTCATTTGCA

SEQ ID NO：6

TCTAGAATCTTTAAAAATAAAGGACG

SEQ ID NO：7

AGGAGATAATCATAGGAATCCCA

SEQ ID NO：8

TTTTAAAATGATAAAATGAAGTTGTCA

SEQ ID NO：9

ATACACTCTTGTGCTGACTTA

SEQ ID NO：10

CGTTGTCATTAGTTCTTTGGT

SEQ ID NO：11

AAAGTATCTAGCACTGTGTATGTA

SEQ ID NO：12

CTTTCTCTTATCCTGATGGGTT

SEQ ID NO：13

ATCTCTGCAAAGGGGAGT

SEQ ID NO：14

AAATATGACGTGTCTGCTCC

SEQ ID NO：15

ACAGAGTGGTGGGGTGAGAT

SEQ ID NO：16

TGACGTGTCTGCTCCACTTC

SEQ ID NO：17

CTTTACCTTTCTGTCCTGGG

SEQ ID NO：18

ATCTGCCTGCCTCAGTC

SEQ ID NO：19

GGCAGGTTGTTACGAGGCAT

SEQ ID NO：20

ACAGATTTTCCACTTGCTGTGC

SEQ ID NO：21

ACCTTGTGATGTTAGTTTGGA

SEQ ID NO：22

CTTGTGAGCTGGTCTGAATG

SEQ ID NO：23

TGGAAACTTCAGATATATGTAAATGT

SEQ ID NO：24

ACGTATAGCAGTATTTTCTTCTCT

优选地，该用于扩增人基因组DNA片段的PCR反应的延伸温度为72℃。

优选地，所述模板进行特异引物PCR反应时在95℃进行了3分钟的预变性。优选地，该用于扩增人基因组DNA片段的PCR扩增的循环数可以为25～35次，例如30次。

除了使用上述引物外，该用于扩增人基因组DNA片段的PCR反应可以使用常规的PCR试剂来进行。

在扩增得到所述人基因组DNA片段后，可以采用常规的二代测序DNA文库构建方法，以这些人基因组DNA片段的混合物作为希望进行测序的DNA片段，构建二代测序DNA文库。例如，所述二代测序DNA文库构建步骤B可以包括：

步骤B-2：将所述平末端的DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；以及

步骤B-4：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。

优选地，所述步骤B还可以包括：在所述步骤B-4之后进行的步骤B-5：从所述扩增产物中纯化回收具有目的大小的片段。该步骤例如可以通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取包含目的条带的凝胶，并回收其中的DNA来进行。这里，所述具有目的大小的片段的大小为例如197～343bp。

优选地，在所述步骤B-1与所述步骤B-2之间、所述步骤B-2与所述步骤B-3之间以及所述步骤B-3与所述步骤B-4之间，还包括纯化步骤。该纯化步骤可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如可以通过使用纯化磁珠来进行。

在另一方面中，本发明还提供一种用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的试剂盒(本发明的检测试剂盒)，其包括：

用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂；

用于构建二代测序DNA文库的试剂；和

用于对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂；

其中，所述PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂包括上述引物组1～12，其用作PCR扩增的引物。

在上述试剂盒中，所述引物组1～12应该独立包装，但属于同一引物组的上游引物和下游引物可以独立包装，也可以合并包装。

优选地，所述用于构建二代DNA测序文库的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4 DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Taq酶、dNTP、T4多聚核苷酸激酶以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液。

优选地，所述对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：再合成试剂、线性化P7接头、线性化P5接头、DNA聚合酶、dNTP、冲洗杂交液/缓冲液、100％甲酰胺(质量/体积)、用于测序的Read 2引物、Index i7测序引物、用于测序的Read 1引物、Hiseq RapidPE Flow Cell、ddH₂O以及增强光感度/照相用试剂。

优选地，所述用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：dNTP、MgC1₂、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。

本发明的检测试剂盒可以用于实施本发明的建库方法。

在另一方面中，本发明提供一种用于扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂盒(本发明的扩增试剂盒)，其包括用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂；

其中，所述用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂包括上述引物组1～12。

优选地，本发明的扩增试剂盒中，所述用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：dNTP、MgC1₂、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。

本发明的扩增试剂盒可以用于例如人基因组DNA为模板，扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的基因片段。

实施例

以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例是用于解释本发明，并非对本发明的限定。

实施例1 采用上述引物组1～12，以人基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，得到乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的基因片段，并构建二代测序用DNA文库

实验前准备：

准备1例血细胞提取的浓度为20ng/μL的人基因组DNA样本30μL，引物用TE buffer(1×)pH 8.0稀释至10μM浓度，PCR试剂冰上融化备用。

实验步骤：

1)取若干0.2mL EP管，每个管内配置PCR体系，体系如下：

上游引物、下游引物各0.6μL(分别构成上述引物组1～12)，Taq酶0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 4μL，模板1μL，加入ddH₂O补至25μL。另做阴性对照，不加入模板。配制完成后，混匀离心，置于PCR仪反应。

其中，

反应体系如下：

2)PCR结束后，将所有PCR产物混合在一起，用1.8×Ampure磁珠(Beckman)对反应产物进行纯化，进行建库；

3)建库实验按照KAPA建库试剂盒说明书进行，文库产物QC质检后Miseq PE250测序，共测6M数据量。

对比例1 采用引物组1'～12'，以人基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，得到乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的基因片段，并构建二代测序用DNA文库

引物组1'～12'中，引物组1'～11'同引物组1～11，引物组12'中的上游引物为AAACTTCAGATATATGTAA(SEQ ID NO：23')，下游引物为ATAGCAGTATTTTCTTCTCT(SEQ ID NO：24')。

除此之外，其他操作同实施例1。所得测序结果如下。

实施例2 采用216对引物组(其中包含上述引物组1～12)，利用WaferGen平台在纳升水平进行PCR扩增及建库

本实施例中Barcode Primer、TE master mix和Universal Outer Primer均购买于WaferGen公司。

1、实验前准备：

1)WaferGen平台点样仪开机准备，包括检查氦气气压、确认系统内部湿度、检查压力瓶、废液筒、洗液瓶、开机运行warm up程序和tip clean程序；

2)准备96孔板、384孔板、1.5mL EP管等试验耗材；

3)配制85％乙醇，预平衡磁珠，建库试剂冰上融化备用；

2、试验样本

共选取23例血液提取样本和1例阴性对照，样本稀释到10ng/μL备用，分别稀释20μL；

3、试验步骤：

1)吸取所用的24个Barcode Primer转移到新96孔板，每孔5.8μL；

2)取24份已稀释至10ng/μL的样本17.3μL和NTC样本，按样本顺序加入已加Barcode Primer的96孔板，NTC样本加H₂O做阴性对照，贴膜后震匀离心备用；

3)取一个1.5mL EP管，加入TE master mix 679μL和Universal OuterPrimer 135μL，配制TE master mix和Universal Outer Primer的混合液，并分装到384孔板，每孔加入10μL，共分48孔，后将2)中配制的混合液也按顺序加到384孔内，每孔10μL；

4)新取一384孔板，加入稀释好的216对引物(1.25μM)7.2μL，并加入3)配制的混合液5μL，封膜，震匀离心，确保孔内无气泡；

5)上述两块384孔板2600g离心5分钟后，分别放置到点样仪上进行点样，样本和引物对分别点样50nL，最终反应体系为100nL；

6)点样结束后，将点制好的5184孔芯片2600g离心5分钟；

7)放入T-100 Thermal Cycler，选择COT40程序，运行程序；

8)反应完成后，芯片倒置2600g离心5分钟，收集芯片内反应液；

9)回收后的反应液取20μL进行纯化，其余-20℃冻存，反应液加入80μL1×TE Buffer(pH 8.0)、80μL Ampure磁珠，震匀5～10秒，使其均质化，短暂离心后室温孵育5分钟；

10)放置在磁力架上2分钟吸附磁珠，待吸附完全液体澄清后弃上清；

11)加入200μL 85％的乙醇，在磁力架上旋转EP管，确保能够充分洗涤磁珠，转三圈后静置30秒，弃上清；

12)再重复上步两次；

13)换小枪头弃剩余乙醇并晾干；

14)用26μL 1×TE Buffer(pH 8.0)洗脱磁珠，震匀10s，静置2分钟，短暂离心放至磁力架上吸附2分钟，吸25μL上清转移至新的1.5mL EP管内；

15)加入75μL 1×TE Buffer(pH 8.0)，再加入90μL Ampure磁珠，震匀5-10秒，使其均质化，短暂离心后室温孵育5分钟；

16)重复10)-13)，然后加入21μL 1×TE Buffer(pH 8.0)洗脱磁珠，震匀10秒，静置2分钟，短离放至磁力架上吸附2分钟，吸20μL上清转移至新的1.5mL EP管内，标记后Qubit测浓度出库质检并且进行Miseq测序。

测序结果表明，在整个BRCA1和BRCA2基因区域，最终获得的各位点的测序数据具有良好均一性，且不存在非特异序列。

还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。

上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

工业实用性

根据本发明，提供一种能够使最终获得的测序数据具有良好均一性的扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变热点的方法、构建用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的二代测序DNA文库的方法、以及用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的试剂盒。

Claims

其中，所述引物组为：

所述PCR反应条件的变性温度为95℃，退火温度为56℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR反应条件的延伸温度为72℃。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述模板在进入该PCR反应的温度循环前在95℃进行了3分钟的预变性。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤B包括：

步骤B-4：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤B还包括：

6.根据权利要求4所述的方法，其中，在所述步骤B-1与所述步骤B-2之间、所述步骤B-2与所述步骤B-3之间以及所述步骤B-3与所述步骤B-4之间，还包括纯化步骤。

用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂；

用于构建二代测序DNA文库的试剂；和

用于对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂；

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述用于构建二代DNA测序文库的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4 DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Taq酶、dNTP、T4多聚核苷酸激酶以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液；所述对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：再合成试剂、线性化P7接头、线性化P5接头、DNA聚合酶、dNTP、冲洗杂交液/缓冲液、100％甲酰胺(质量/体积)、用于测序的Read 2引物、Indexi7测序引物、用于测序的Read 1引物、Hiseq Rapid PE Flow Cell、ddH₂O以及增强光感度/照相用试剂；所述用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：dNTP、MgC1₂、Taq酶、PCR反应缓冲液以及双蒸水。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：dNTP、MgC1₂、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及双蒸水。