CN104789664A - 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒 - Google Patents

用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104789664A
CN104789664A CN201510154947.2A CN201510154947A CN104789664A CN 104789664 A CN104789664 A CN 104789664A CN 201510154947 A CN201510154947 A CN 201510154947A CN 104789664 A CN104789664 A CN 104789664A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
breast cancer
long
brca2
pairs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510154947.2A
Other languages
English (en)
Inventor
陈重建
梁峻彬
玄兆伶
王秀莉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Annoroad Genetic Technology (Beijing) Co., Ltd.
Annuo uni-data (Yiwu) Medical Inspection Co. Ltd.
Zhejiang Annuo uni-data Biotechnology Co. Ltd.
Original Assignee
ANNOROAD GENETIC TECHNOLOGY (BEIJING) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ANNOROAD GENETIC TECHNOLOGY (BEIJING) Co Ltd filed Critical ANNOROAD GENETIC TECHNOLOGY (BEIJING) Co Ltd
Priority to CN201510154947.2A priority Critical patent/CN104789664A/zh
Publication of CN104789664A publication Critical patent/CN104789664A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686Polymerase chain reaction [PCR]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒,所述引物组总共18个引物对,其中包含:引物对1:正向引物BR1_P6.1F:5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’,反向引物BR1_P6.1R:5’-TAGCCAGGC ATAGTTGCACA-3’;引物对2:正向引物BR1_P6.2F:5’-CTCCACCTCCCTGGTTCAGT-3’,反向引物BR1_P6.2R:5’-AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG-3’;引物对3:正向引物BR1_P7F:5’-GGCTCAAAGGACCTCCTACC-3’,反向引物BR1_P7R:5’-AGGCAGAGGAACCTCTT GAA -3’。本发明有益效果:该检测方法需要的引物数量少,能够有效的对BRCA1和BRCA2目的区域进行富集,扩增条带清晰、单一。该技术明显缩短时间,成本也大大降低。

Description

用于乳腺癌易感基因 BRCA1 和 BRCA2 的 Long-range PCR 检测的引物组、方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种PCR扩增方法,尤其涉及一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和 BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒。
背景技术
乳腺癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤,其死亡率仅次于肺癌而位居第二位。BRCA(breast cancer susceptibility gene)是遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因,其与乳腺癌密切相关。自BRCA1和 BRCA2基因成功地定位、分离后,国内外学者对其进行了广泛、深入的研究。在我国的许多大中城市,乳腺癌已占妇女恶性肿瘤死因的首位,严重威胁着女性健康。
早诊断早发现,乳腺癌病情的治愈还是相当乐观的。在第Ⅳ期得到诊断的乳腺癌患者只有20%能够存活到5年之后,而在第Ⅰ期就诊的患者100%活到5年之后。因此乳腺癌的早期诊断是目前亟待解决的问题。
BRCA1和BRCA2为乳腺癌遗传性主要的风险因子。二者都是抑癌基因,均呈常染色体显性遗传,且容易引发早年发病。BRCA1基因定位于17q21,编码BRCA1蛋白含1863个氨基酸,在维持细胞正常增殖、分化中发挥重要作用,并参与DNA损伤修复功能,是第一个被证实和克隆的BRCA。BRCA1基因突变会引发DNA修复功能障碍,使细胞代谢和增殖紊乱,促进细胞恶变和肿瘤发生。
BRCA2基因位于13q12,编码BRCA2蛋白含3418个氨基酸,对细胞生长的调节有重要作用。BRCA2变异范围达整个基因的编码区,目前尚未发现非编码区的变异。BRCA2基因发生突变后表达的蛋白质失去了修复DNA损伤的功能,导致染色体不稳定,促进肿瘤发生。总之,BRCA1和BRCA2突变、功能缺失,造成基因不稳定,逃避集体防御体系监视,使细胞非控制性增殖,导致肿瘤的发生[1]。
有研究表明,有5%~10%的乳腺癌和10%~15%的卵巢癌是由BRCA1/2突变引起的,而在乳腺癌和卵巢癌高发家族中80%的患者BRCA1/2基因存在突变。与正常女性相比,携带BRCA1或BRCA2基因突变的女性,患乳腺癌或卵巢癌的风险高5-20倍,一生中可能有45%-65%的概率患乳腺癌,11%-40%的概率患卵巢癌,且易早年发病[2,3]。
据报道,乳腺癌的BRCA1和BRCA2基因检测方法有很多,Ozcelik H等曾利用Long-range PCR扩增BRCA1和BRCA2两个基因全基因,设计17对引物,采用invitrogen公司的SequalPrep Long PCR体系扩增,由于扩增片段长度太长,引物设计区域不恰当,导致出现扩增产物中非特异带型较多,干扰BRCA1和BRCA2目标区域富集[4]。利用多重PCR技术将BRCA1和BRCA2外显子区域扩增富集,需设计200多对引物分到不同PCR体系中。同样扩增片段、引物设计、退火温度和延伸时间优化不恰当,会导致非特异性条带的增多,可能有10几对引物混合在一个反应中,经常会导致交互配对或增加错配产物,影响目标区域扩增效率及产物量。
因此本领域迫切需要建立新的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测技术,而通过对样本的BRCA1和BRCA2的Long-range PCR扩增,可更全面准确的评估患乳腺癌的风险。能够早期客观、灵敏和稳定的检测BRCA1和BRCA2基因突变,以便进行及时、有针对性的治疗或预防乳腺癌,降低医疗成本,节约社会资源。
参考文献:
[1] 登云特,王国平.乳腺癌易感基因BRCA1/2的研究进展[J/CN].中国乳腺病杂志:电子版,2013,7(5):374-378.
[2] 黄清丰,李茹捧,付倩,吕晶,张兰.基因导向的乳腺癌治疗进展研究[J].中国医药指南.2014,12(6):39.
[3] Antoniou A, Pharoah P D, Narod S, et al: Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in case series unselected for family history: A combined analysis of 22 studies. Am J Hum Genet, 2003,72:1117-1130.
[4] Ozcelik H, Shi X, Chang MC, et al. Long-range PCR and next-generation sequencing of BRCA1 and BRCA2 in breast cancer. J Mol Diagn. 2012;14:467–475。
发明内容
本发明的首要目的是提供用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组,以及提供一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的方法和试剂盒,以优化的Long-range PCR方法代替其他PCR方法进行检测分析。
为了实现本发明的目的,本发明的技术方案如下:
一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组,包括用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对和用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA2的8个引物对,其中,用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对中包含以下3个引物对:
(1)引物对1:
正向引物BR1_P6.1F:5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R:5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
(2)引物对2:
正向引物BR1_P6.2F:5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R:5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
(3)引物对3:
正向引物BR1_P7F:5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R:5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’ 。
本发明的另一种目的是提供一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的方法,包括以下步骤:
A.利用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织DNA提取试剂盒(DP304)对采集的样本进行DNA提取;
B.利用总共18个引物对分别进行目标序列的Long-range PCR扩增,其中BRCA1需要10个引物对进行10个片段的扩增,所述10个引物对中包含下述3个引物对:
(1)引物对1:
正向引物BR1_P6.1F:5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R:5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
(2)引物对2:
正向引物BR1_P6.2F:5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R:5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
(3)引物对3:
正向引物BR1_P7F:5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R:5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’ ,
BRCA2需要8个引物对进行8个片段的扩增;
C. QIAquick Gel Extraction Kit回收纯化扩增产物,Invitrogen Qubit2.0测定PCR产物浓度;
D.将纯化后的扩增子等摩尔混合;
E.以1ug混合后的扩增子进行小片段文库构建;
F.对测序文库进行 2100 Bioanalyzer(Agilent)/LabChip GX(Caliper)及QPCR检测,利用Illumina HiSeq™ 2500对文库进行测序。
进一步的,所述的Long-range PCR扩增体系如下:
SequalPrep 10×反应缓冲液(包括Mg 2+和dNTPs) 2ul
SequalPrep PCR增强剂 2ul
二甲基亚砜DMSO 0.4ul
引物对(2.5umol/L) 1ul
SequalPrep Long 聚合酶 0.25ul
DNA模板 50ng
ddH2O 加至20ul 。
进一步的,所述的Long-range PCR扩增的条件为:
94℃预变性2分钟;
然后进入循环:94℃变性10秒,55-65℃退火30秒,68℃延伸9-14分钟,进行10个循环;
然后再进行25个循环,每个循环延伸的时间增加20秒;
最后72℃延伸10分钟,4℃保存。
本发明的再一目的是提供一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的试剂盒,包括:溶液A:SequalPrep 10×反应缓冲液(包括Mg 2+和dNTPs);溶液B:SequalPrep PCR增强剂;溶液C:二甲基亚砜DMSO;溶液D:引物对(2.5umol/L);溶液E:SequalPrep Long 聚合酶;溶液F:ddH2O,其中,溶液D的引物对包括用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对和用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA2的8个引物对,其中,用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对中包含以下3个引物对:
(1)引物对1:
正向引物BR1_P6.1F:5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R:5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
(2)引物对2:
正向引物BR1_P6.2F:5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R:5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
(3)引物对3:
正向引物BR1_P7F:5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R:5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’
本发明的有益效果:相对于多重PCR检测,该检测方法无需设计特别多对的引物,而且在PCR过程中减少非特异性条带的扩增,有效的对BRCA1和BRCA2条带进行了富集。相对于其他的Long-range PCR检测方法,在该引物扩增条件下,扩增出结果的条带清晰、单一。与定制化芯片杂交捕获技术相比,Long-range PCR可以明显缩短时间,时间缩短了60%以上,成本也大大降低了。
附图说明
图 1为本发明所述Long-range PCR 扩增BRCA1和BRCA2全长检测电泳图;
图2为现有技术的扩增BRCA1和BRCA2全长检测电泳图;
图3是LabChip GX(Caliper)检测文库片段大小分布图;
图4是利用Illumina HiSeq™ 2500进行测序的结果。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于进一步说明本发明,并不用于限制本发明的范围。任何与所记载内容相似或相等的方法及材料均可应用于本发明中。所述的较佳实施例仅作示范之用。实施例中未注明具体条件的实验方法,按本技术领域常规方法进行或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.引物设计
BRCA1(chr17:38447840-385339940)和BRCA2(chr13:31784617-31873809)全基因组区域作为long-range PCR扩增区域,合成18对引物(10对BRCA1引物和8对BRCA2引物)。这些扩增子长度从4.2kb-14kb。引物信息详见下表1:
表1:10对BRCA1引物和8对BRCA2引物
2. DNA提取
DNA提取采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织DNA提取试剂盒(DP304)。
3. Long-PCR扩增体系20ul反应体系
SequalPrep 10×反应缓冲液(包括Mg 2+和dNTPs) 2ul
SequalPrep PCR增强剂 2ul
二甲基亚砜DMSO 0.4ul
引物对(2.5umol/L) 1ul
SequalPrep Long 聚合酶 0.25ul
DNA模板 50ng
ddH2O 加至20ul 。
其中,Long-PCR扩增反应程序如下:
Long-PCR扩增条件为:94℃预变性2分钟;然后进入循环:94℃变性10秒,55-65℃退火30秒,68℃延伸9-14分钟,进行10个循环;后续进行25个循环,每个循环延伸时间增加20秒;最后72℃延伸10分钟;4℃ 保存。
4.琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化
切胶纯化按照QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA)试剂盒实验流程进行。纯化后Qubit2.0(Invitrogen)测定PCR产物浓度(按照199:1的比例配制预混液,然后将预混液以199ul分装至Qubit EP管中,扣盖写好标记,再加入1ul相应的PCR产物,振荡混匀,室温暗室2分钟后,测定浓度)。浓度见表2。
5.将纯化后的18个扩增子等摩尔混合后按照1ug起始量进行文库构建。DNA小片段文库构建-Illumina’s protocols(Ilumina, San Diego, CA)
5.1样本打断:
取上述总量1μg等摩尔混合的PCR产物作为起始样本,采用80μl打断体系,不足的部分用TE 缓冲液补齐。使用Biorupter Sonication System将样品DNA打断至200bp。具体操作方法见《Bioruptor Sonication System UCD-600标准操作流程》。
5.2.末端修复(End Repair)
配制末端修复Mix:预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂,将其置于冰上化冻并充分混匀。单个样本配制量参见表3,多样本可按比例配制Mix。将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。
末端修复反应:向1.5 ml离心管中分装25ul Mix,根据建库任务单向相应管中加入DNA样本。将反应体系置于Thermomixer中20℃温浴30 分钟。反应结束后使用1.8× Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA,溶于32μl EB。
5.3.末端加“A”(A-Tailing)
配制末端加“A”Mix:预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂,将其置于冰上化冻并充分混匀。单个样本配制量参见表4,多样本可按比例配制Mix,将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。
末端加“A”反应:向1.5 ml的离心管中分装18ul Mix,根据建库任务单向相应管中加入DNA。将样本置于Thermomixer中37℃温浴30分钟。使用1.8× Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA,溶于18μl EB中。
5.4. Adapter的连接(Adapter Ligation)
配制Adapter的连接Mix:预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂,将其置于冰上化冻并充分混匀。单个样本配制量参见表5,多样本可按比例配制Mix,将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。
Adapter的连接反应:向1.5 ml的离心管中分装好32ul Mix,根据建库任务单向相应管中加入DNA。将样本置于Thermo mixer中20℃温浴15分钟。使用1.8× Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA,溶于30μl EB中。
5.5. PCR反应
配制PCR反应体系:从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂,将其置于冰上化冻并充分混匀。在0.2 ml的PCR管中配制PCR反应体系,单个样本配制量参见表6,多样本可按比例配制混合物(模板量X根据连接产物浓度来决定,用量约50-100ng),将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。
PCR反应:设置PCR程序,使用前需要与任务单再次核对。PCR反应的程序如下,反应结束后,及时将样品取出放入4℃冰箱保存并按要求退出程序或关闭仪器。
5.6. PCR产物的回收纯化
0.9× Ampure磁珠回收纯化反应体系中的PCR产物,溶于30μl EB中。
5.7.文库定量
对文库进行2100 Bioanalyzer(Agilent)/LabChip GX(Caliper)及QPCR 检测,记录文库浓度。构建好的文库用Illumina HiSeq™ 2500进行测序。
图1为Long-range PCR扩增结果凝胶电泳图,Maker为1kb DNA ladder。图2为现有技术的扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图。由图可知本发明电泳图目的条带清晰,单一,特异性较强,与预期结果一致。图3为LabChip GX(Caliper)检测文库片段大小分布图,如图所示该片段长度为330bp(加接头后),片段浓度为238.6nmol/L,其峰单一,片段长度及浓度符合文库构建的标准。图4是利用Illumina HiSeq™ 2500进行测序结果,测序的覆盖度达到99.86%,BRCA1和BRCA2全长与目标序列比对发现相似度高达98.47%。测序发现BRCA1没有发现SNP位点,BRCA2发现3个SNP位点,分别位于13号染色体第32906729、32929387、32890572个碱基上。NCBI登陆号为rs144848、rs169547、rs1799943。根据已有资料信息比对发现,该三个SNP位点为无害突变。结果该样品为阴性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安诺优达基因科技(北京)有限公司
<120> 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒
<160> 18
<170> patentin 3.3
<210> Brca1.1L
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.1L
ACCCCAACAT TGATTCCTTT C 21
<210> Brca1.1R
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.1R
CACAGGGAGA AAGTCTGCAA G 21
<210> Brca1.2L
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.2L
GGGAGCTGAG AAAGCAGCCA GC 22
<210> Brca1.2R
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.2R
TCGGCAGGAA TCCATGTGCA GC 22
<210> Brca1.3L
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.3L
AGCAGAAGAA CGTGCTCTTT TCACGG 26
<210> Brca1.3R
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.3R
ACAGTCTTCA ATGTGGAGGC AGTAGGG 27
<210> Brca1.4L
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.4L
CTGGATTGAA GATGGGTGAG A 21
<210> Brca1.4R
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.4R
TTTCCTGTAC CTTGCCAACA C 21
<210> Brca1.5L
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.5L
GGCAATCCTG AAGAAGTGGA 20
<210> Brca1.5R
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.5R
ACAAAGCAGC GGATACAACC 20
<210> BR1_P6.1F
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P6.1F
ACGTTGCGGA GAGGTGAG 18
<210> BR1_P6.1R
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P6.1R
TAGCCAGGCA TAGTTGCACA 20
<210> BR1_P6.2F
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P6.2F
CTCCACCTCC CTGGTTCAGT 20
<210> BR1_P6.2R
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P6.2R
AGCTTTGTGG TGAGGTGTTG 20
<210> BR1_P7F
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P7F
GGCTCAAAGG ACCTCCTACC 20
<210> BR1_P7R
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P7R
AGGCAGAGGA ACCTCTTGAA 20
<210> Brca1.8L
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.8L
GCCATGAAAA GATAATCTCA CAACTGC 27
<210> Brca1.8R
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.8R
GGTGGCTCTG CTTATATACA CAACTGG 27
<210> Brca1.9L
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.9L
TCACCCTGGT CCAACAACCA 20
<210> Brca1.9R
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.9R
TGTTCGTTCC TCCCGTCTGG 20
<210> Brca2.1L.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.1L.RS
CTCCCCCACA AAAAGGGGAC AAAGC 25
<210> Brca2.1R.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.1R.RS
ACAAACTCCC ACATACCACT GGGGG 25
<210> Brca2.2L.RS
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.2L.RS
CTCGGGGCAT CCTTTTTGGG GG 22
<210> Brca2.2R.RS
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.2R.RS
TGACATGCTG CAGCCAAGAC CT 22
<210> Brca2.3L.RS
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.3L.RS
GCCACTGTGC CCAAACACTA CC 22
<210> Brca2.3R.RS
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.3R.RS
TGTGCCTGGC CTCAATTCAC CA 22
<210> Brca2.4L.RS
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.4L.RS
TGACCCACAG TAAGGCACAT C 21
<210> Brca2.4R.RS
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.4R.RS
GCCCTCTTCT ACCATTTGTG C 21
<210> Brca2.5L.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.5L.RS
GGCCTTATGG TAGATTCCTC CCCCG 25
<210> 反向引物Brca2.5R.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.5R.RS
TGGGCCTCCA CATATTTTGC TGCTT 25
<210> Brca2.6L.RS
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.6L.RS
GGAGGCCCAA CAAAAGAGAC 20
<210> Brca2.6R.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.6R.RS
GTGGTTTAGC CGGACTCCTC 20
<210> Brca2.7L.RS
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.7L.RS
CAGAAGGGGA ATCAGGATCA 20
<210> Brca2.7R.RS
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.7R.RS
GCTGATAGGG AGAGGGGAAC 20
<210> Brca2.8L.RS
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.8L.RS
TTAATTGCCC ATGAACCTCA G 21
<210> Brca2.8R.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.8R.RS
TATTGACTTG TATTGTGTTC GCTGT 25

Claims (3)

1.一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组,共有18个引物对,其特征在于,包含以下3个引物对:
(1)引物对1:
正向引物BR1_P6.1F:5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R:5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
(2)引物对2:
正向引物BR1_P6.2F:5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R:5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
(3)引物对3:
正向引物BR1_P7F:5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R:5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’ 。
2.一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的方法,其特征在于,包括以下步骤:
A.利用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织DNA提取试剂盒(DP304)对采集
的样本进行DNA提取;
B.利用总共18个引物对分别进行目标序列的Long- range PCR扩增,其中所述引物对中包含下述3个引物对:
(1)引物对1:
正向引物BR1_P6.1F:5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R:5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
(2)引物对2:
正向引物BR1_P6.2F:5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R:5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
(3)引物对3:
正向引物BR1_P7F:5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R:5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’,
BRCA2需要8个引物对进行8个片段的扩增;
C. QIAquick Gel Extraction Kit回收纯化扩增产物,invitrogen Qubit2.0测定PCR产物浓度;
D.将纯化后的扩增子等摩尔混合后按照1ug起始量进行小片段文库构建;
E.PCR产物的回收纯化;
F.对测序文库进行Agilent 2100及QPCR检测,利用Illumina HiSeq™ 2500对文库进行测序。
3.一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的试剂盒,包括:溶液A:SequalPrep 10×反应缓冲液,包括Mg 2+和dNTPs;溶液B:SequalPrep PCR增强剂;溶液C:二甲基亚砜DMSO;溶液D:引物对,2.5umol/L;溶液E:SequalPrep Long 聚合酶;溶液F:ddH2O,其中,溶液D的引物对包括用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对和用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA2的8个引物对,其中,用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对中包含以下3个引物对:
(1)引物对1:
正向引物BR1_P6.1F:5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R:5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
(2)引物对2:
正向引物BR1_P6.2F:5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R:5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
(3)引物对3:
正向引物BR1_P7F:5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R:5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’。
CN201510154947.2A 2015-04-02 2015-04-02 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒 Pending CN104789664A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510154947.2A CN104789664A (zh) 2015-04-02 2015-04-02 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510154947.2A CN104789664A (zh) 2015-04-02 2015-04-02 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104789664A true CN104789664A (zh) 2015-07-22

Family

ID=53554853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510154947.2A Pending CN104789664A (zh) 2015-04-02 2015-04-02 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104789664A (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950774A (zh) * 2016-07-11 2016-09-21 江苏医诺万细胞诊疗有限公司 一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因SNP位点的试剂盒及其检测方法
CN106636430A (zh) * 2017-01-26 2017-05-10 湖南圣维基因科技有限公司 用于预测乳腺癌的生物标记物组合、试剂盒及使用方法
CN106929564A (zh) * 2015-12-30 2017-07-07 安诺优达基因科技(北京)有限公司 乳腺癌易感基因检测试剂盒
CN107267600A (zh) * 2016-12-29 2017-10-20 北京明谛生物医药科技有限公司 一种富集brca1和brca2基因目标区域的引物、方法、试剂盒及其应用
CN107760771A (zh) * 2017-11-16 2018-03-06 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种乳腺癌易感基因brca1和brca2全基因捕获引物、试剂盒及其方法
CN108060227A (zh) * 2018-02-22 2018-05-22 南京市妇幼保健院 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法
CN108060228A (zh) * 2016-12-29 2018-05-22 北京明谛生物医药科技有限公司 一种检测brca1和brca2基因变异的检测引物、试剂盒及方法
CN113151467A (zh) * 2021-04-19 2021-07-23 中南大学湘雅医院 一种检测乳腺癌风险基因rs169547多态性位点的方法及试剂盒
CN114164271A (zh) * 2021-12-13 2022-03-11 奥明(杭州)基因科技有限公司 一种基于长片段pcr检测乳腺癌易感基因变异的引物对,试剂盒及其方法
CN116144743A (zh) * 2022-12-16 2023-05-23 东华大学 基于多重长pcr结合高通量测序同时实现多个同源序列snp分型的引物、试剂盒及方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1169753A (zh) * 1994-08-12 1998-01-07 亿万遗传股份有限公司 诊断乳房癌和卵巢癌倾向性的方法
CN1172502A (zh) * 1994-08-12 1998-02-04 亿万遗传股份有限公司 17q连锁的乳房癌和卵巢癌易患性基因的体内突变和多态性
CN101608225A (zh) * 2008-06-20 2009-12-23 上海主健生物工程有限公司 乳腺癌遗传检测试剂盒
CN104017870A (zh) * 2014-05-28 2014-09-03 杭州美中疾病基因研究院有限公司 乳腺癌易感基因brca1/brca2突变检测试剂盒及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1169753A (zh) * 1994-08-12 1998-01-07 亿万遗传股份有限公司 诊断乳房癌和卵巢癌倾向性的方法
CN1172502A (zh) * 1994-08-12 1998-02-04 亿万遗传股份有限公司 17q连锁的乳房癌和卵巢癌易患性基因的体内突变和多态性
CN101608225A (zh) * 2008-06-20 2009-12-23 上海主健生物工程有限公司 乳腺癌遗传检测试剂盒
CN104017870A (zh) * 2014-05-28 2014-09-03 杭州美中疾病基因研究院有限公司 乳腺癌易感基因brca1/brca2突变检测试剂盒及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HILMI OZCELIK等: "Long-Range PCR and Next-Generation Sequencing of BRCA1 and BRCA2 in Breast Cancer", 《THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106929564A (zh) * 2015-12-30 2017-07-07 安诺优达基因科技(北京)有限公司 乳腺癌易感基因检测试剂盒
CN106929564B (zh) * 2015-12-30 2021-04-02 浙江安诺优达生物科技有限公司 乳腺癌易感基因检测试剂盒
CN105950774A (zh) * 2016-07-11 2016-09-21 江苏医诺万细胞诊疗有限公司 一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因SNP位点的试剂盒及其检测方法
CN108060228B (zh) * 2016-12-29 2021-02-09 北京明谛生物医药科技有限公司 一种检测brca1和brca2基因变异的检测引物、试剂盒及方法
CN107267600A (zh) * 2016-12-29 2017-10-20 北京明谛生物医药科技有限公司 一种富集brca1和brca2基因目标区域的引物、方法、试剂盒及其应用
CN108060228A (zh) * 2016-12-29 2018-05-22 北京明谛生物医药科技有限公司 一种检测brca1和brca2基因变异的检测引物、试剂盒及方法
CN107267600B (zh) * 2016-12-29 2020-10-30 北京明谛生物医药科技有限公司 一种富集brca1和brca2基因目标区域的引物、方法、试剂盒及其应用
CN106636430A (zh) * 2017-01-26 2017-05-10 湖南圣维基因科技有限公司 用于预测乳腺癌的生物标记物组合、试剂盒及使用方法
CN106636430B (zh) * 2017-01-26 2020-06-16 湖南圣维基因科技有限公司 用于预测乳腺癌的生物标记物组合、试剂盒及使用方法
CN107760771A (zh) * 2017-11-16 2018-03-06 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种乳腺癌易感基因brca1和brca2全基因捕获引物、试剂盒及其方法
CN108060227A (zh) * 2018-02-22 2018-05-22 南京市妇幼保健院 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法
CN108060227B (zh) * 2018-02-22 2022-03-08 南京市妇幼保健院 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法
CN113151467A (zh) * 2021-04-19 2021-07-23 中南大学湘雅医院 一种检测乳腺癌风险基因rs169547多态性位点的方法及试剂盒
CN114164271A (zh) * 2021-12-13 2022-03-11 奥明(杭州)基因科技有限公司 一种基于长片段pcr检测乳腺癌易感基因变异的引物对,试剂盒及其方法
CN114164271B (zh) * 2021-12-13 2024-04-26 奥明(杭州)基因科技有限公司 一种基于长片段pcr检测乳腺癌易感基因变异的引物对,试剂盒及其方法
CN116144743A (zh) * 2022-12-16 2023-05-23 东华大学 基于多重长pcr结合高通量测序同时实现多个同源序列snp分型的引物、试剂盒及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104789664A (zh) 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒
US20230046649A1 (en) Microrna assay for detection and management of pancreatic cancer precursors
CA2852850C (en) Plasma micrornas for the detection of early colorectal cancer
Danielson et al. High throughput sequencing of extracellular RNA from human plasma
Gao et al. Circular RNA profiling reveals circRNA1656 as a novel biomarker in high grade serous ovarian cancer
JP5750710B2 (ja) 癌マーカー、それを用いた癌の評価方法および評価試薬
CN109609650B (zh) 用于诊断和治疗肝细胞癌的生物标志物
CN106978492A (zh) 一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光pcr检测试剂盒
CN112210605B (zh) 用于评估组织免疫反应和诊断预后的dna甲基化检测试剂盒
WO2017147593A2 (en) Long intergenic non-coding rna as pan-cancer biomarker
Gong et al. High expression of C10orf91 and LINC01224 in hepatocellular carcinoma and poor prognosis
Han et al. Up-regulation of serum miR-4262 predicts clinical outcome of patients with acute myeloid leukemia
Lee et al. MicroRNA-23a: a novel serum based diagnostic biomarker for lung adenocarcinoma
CA2811744A1 (en) Signatures of clinical outcome in gastro intestinal stromal tumors and method of treatment of gastroinstestinal stromal tumors
CN107858427B (zh) miR-429在制备乳腺癌诊断和检测试剂盒中的应用
KR20130098669A (ko) 위암의 림프절 전이 진단 마커로서의 혈청 miRNA
CN110656162A (zh) 一种循环miR-1290的检测方法
CN111440867B (zh) 生物标志物在肝癌诊断和治疗中的应用
WO2016106643A1 (zh) 检测非小细胞肺癌用药相关基因突变的引物及检测方法
AU2015201072B2 (en) Plasma microRNAs for the detection of early colorectal cancer
Perillo et al. Liquid biopsy in NSCLC: a new challenge in radiation therapy
Domingo Sabugo Establishing methods for analysis of DNA methylation in breast cancer and cell-free circulating DNA
Smit Looking Beyond Genetic Alterations in Metastatic Uveal Melanoma
Wang et al. Decreased expression of microRNA-433 is associated with the prognosis of epithelial ovarian cancer
KANDEL et al. Brain and Acute Leukemia Cytoplasmic (BAALC) Gene Expression in Acute Myeloid Leukemia: A Study of an Egyptian Cohort

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180116

Address after: 100176 Beijing branch of Beijing economic and Technological Development Zone Street 88 Hospital No. 8 Building 2 unit 701 room

Applicant after: Annoroad Genetic Technology (Beijing) Co., Ltd.

Applicant after: Zhejiang Annuo uni-data Biotechnology Co. Ltd.

Applicant after: Annuo uni-data (Yiwu) Medical Inspection Co. Ltd.

Address before: 100176 Beijing City Branch Daxing District Yizhuang Economic Development Zone No. 88 unit 2 street

Applicant before: Annoroad Genetic Technology (Beijing) Co., Ltd.