CN104789664A - 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒 - Google Patents
用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒，所述引物组总共18个引物对，其中包含：引物对1：正向引物BR1_P6.1F：5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’，反向引物BR1_P6.1R：5’-TAGCCAGGC ATAGTTGCACA-3’；引物对2：正向引物BR1_P6.2F：5’-CTCCACCTCCCTGGTTCAGT-3’，反向引物BR1_P6.2R：5’-AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG-3’；引物对3：正向引物BR1_P7F：5’-GGCTCAAAGGACCTCCTACC-3’，反向引物BR1_P7R：5’-AGGCAGAGGAACCTCTT GAA -3’。本发明有益效果：该检测方法需要的引物数量少，能够有效的对BRCA1和BRCA2目的区域进行富集，扩增条带清晰、单一。该技术明显缩短时间，成本也大大降低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种PCR扩增方法，尤其涉及一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和 BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒。
背景技术
乳腺癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌而位居第二位。BRCA(breast
cancer susceptibility gene)是遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其与乳腺癌密切相关。自BRCA1和 BRCA2基因成功地定位、分离后，国内外学者对其进行了广泛、深入的研究。在我国的许多大中城市，乳腺癌已占妇女恶性肿瘤死因的首位，严重威胁着女性健康。
早诊断早发现，乳腺癌病情的治愈还是相当乐观的。在第Ⅳ期得到诊断的乳腺癌患者只有20%能够存活到5年之后，而在第Ⅰ期就诊的患者100%活到5年之后。因此乳腺癌的早期诊断是目前亟待解决的问题。
BRCA1和BRCA2为乳腺癌遗传性主要的风险因子。二者都是抑癌基因，均呈常染色体显性遗传，且容易引发早年发病。BRCA1基因定位于17q21，编码BRCA1蛋白含1863个氨基酸，在维持细胞正常增殖、分化中发挥重要作用，并参与DNA损伤修复功能，是第一个被证实和克隆的BRCA。BRCA1基因突变会引发DNA修复功能障碍，使细胞代谢和增殖紊乱，促进细胞恶变和肿瘤发生。
BRCA2基因位于13q12，编码BRCA2蛋白含3418个氨基酸，对细胞生长的调节有重要作用。BRCA2变异范围达整个基因的编码区，目前尚未发现非编码区的变异。BRCA2基因发生突变后表达的蛋白质失去了修复DNA损伤的功能，导致染色体不稳定，促进肿瘤发生。总之，BRCA1和BRCA2突变、功能缺失，造成基因不稳定，逃避集体防御体系监视，使细胞非控制性增殖，导致肿瘤的发生[1]。
有研究表明，有5%~10%的乳腺癌和10%~15%的卵巢癌是由BRCA1/2突变引起的,而在乳腺癌和卵巢癌高发家族中80%的患者BRCA1/2基因存在突变。与正常女性相比，携带BRCA1或BRCA2基因突变的女性，患乳腺癌或卵巢癌的风险高5-20倍，一生中可能有45%-65%的概率患乳腺癌，11%-40%的概率患卵巢癌，且易早年发病[2,3]。
据报道，乳腺癌的BRCA1和BRCA2基因检测方法有很多，Ozcelik H等曾利用Long-range
PCR扩增BRCA1和BRCA2两个基因全基因，设计17对引物，采用invitrogen公司的SequalPrep Long PCR体系扩增，由于扩增片段长度太长，引物设计区域不恰当，导致出现扩增产物中非特异带型较多，干扰BRCA1和BRCA2目标区域富集[4]。利用多重PCR技术将BRCA1和BRCA2外显子区域扩增富集，需设计200多对引物分到不同PCR体系中。同样扩增片段、引物设计、退火温度和延伸时间优化不恰当，会导致非特异性条带的增多，可能有10几对引物混合在一个反应中，经常会导致交互配对或增加错配产物，影响目标区域扩增效率及产物量。
因此本领域迫切需要建立新的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测技术，而通过对样本的BRCA1和BRCA2的Long-range PCR扩增，可更全面准确的评估患乳腺癌的风险。能够早期客观、灵敏和稳定的检测BRCA1和BRCA2基因突变，以便进行及时、有针对性的治疗或预防乳腺癌，降低医疗成本，节约社会资源。
参考文献：
[1] 登云特,王国平.乳腺癌易感基因BRCA1/2的研究进展[J/CN].中国乳腺病杂志:电子版,2013,7(5)：374-378.
[2] 黄清丰,李茹捧,付倩,吕晶,张兰.基因导向的乳腺癌治疗进展研究[J].中国医药指南.2014,12(6):39.
[3] Antoniou A, Pharoah P D, Narod S, et al: Average risks of breast and
ovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in case series
unselected for family history: A combined analysis of 22 studies. Am J Hum
Genet, 2003,72:1117-1130.
[4] Ozcelik H, Shi X, Chang MC, et al. Long-range PCR and next-generation
sequencing of BRCA1 and BRCA2 in breast cancer. J Mol Diagn. 2012;14:467–475。
发明内容
本发明的首要目的是提供用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组，以及提供一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的方法和试剂盒，以优化的Long-range PCR方法代替其他PCR方法进行检测分析。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组，包括用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对和用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA2的8个引物对，其中，用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对中包含以下3个引物对：
（1）引物对1：
正向引物BR1_P6.1F：5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R：5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
（2）引物对2：
正向引物BR1_P6.2F：5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R：5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
（3）引物对3：
正向引物BR1_P7F：5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R：5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’
。
本发明的另一种目的是提供一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的方法，包括以下步骤：
A.利用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织DNA提取试剂盒（DP304）对采集的样本进行DNA提取；
B.利用总共18个引物对分别进行目标序列的Long-range
PCR扩增，其中BRCA1需要10个引物对进行10个片段的扩增，所述10个引物对中包含下述3个引物对：
（1）引物对1：
正向引物BR1_P6.1F：5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R：5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
（2）引物对2：
正向引物BR1_P6.2F：5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R：5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
（3）引物对3：
正向引物BR1_P7F：5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R：5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’
，
BRCA2需要8个引物对进行8个片段的扩增；
C. QIAquick Gel Extraction Kit回收纯化扩增产物，Invitrogen
Qubit2.0测定PCR产物浓度；
D.将纯化后的扩增子等摩尔混合；
E.以1ug混合后的扩增子进行小片段文库构建；
F.对测序文库进行 2100 Bioanalyzer(Agilent)/LabChip GX(Caliper)及QPCR检测，利用Illumina HiSeq™ 2500对文库进行测序。
进一步的，所述的Long-range PCR扩增体系如下：
SequalPrep 10×反应缓冲液（包括Mg 2+和dNTPs）
2ul
SequalPrep PCR增强剂
2ul
二甲基亚砜DMSO
0.4ul
引物对（2.5umol/L）
1ul
SequalPrep Long 聚合酶
0.25ul
DNA模板
50ng
ddH2O
加至20ul 。
进一步的，所述的Long-range PCR扩增的条件为：
94℃预变性2分钟；
然后进入循环：94℃变性10秒，55-65℃退火30秒，68℃延伸9-14分钟，进行10个循环；
然后再进行25个循环，每个循环延伸的时间增加20秒；
最后72℃延伸10分钟，4℃保存。
本发明的再一目的是提供一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的试剂盒，包括：溶液A：SequalPrep 10×反应缓冲液（包括Mg 2+和dNTPs）；溶液B：SequalPrep PCR增强剂；溶液C：二甲基亚砜DMSO；溶液D：引物对（2.5umol/L）；溶液E：SequalPrep Long 聚合酶；溶液F：ddH2O，其中，溶液D的引物对包括用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对和用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA2的8个引物对，其中，用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对中包含以下3个引物对：
（1）引物对1：
正向引物BR1_P6.1F：5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R：5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
（2）引物对2：
正向引物BR1_P6.2F：5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R：5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
（3）引物对3：
正向引物BR1_P7F：5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R：5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’
本发明的有益效果：相对于多重PCR检测，该检测方法无需设计特别多对的引物，而且在PCR过程中减少非特异性条带的扩增，有效的对BRCA1和BRCA2条带进行了富集。相对于其他的Long-range PCR检测方法，在该引物扩增条件下，扩增出结果的条带清晰、单一。与定制化芯片杂交捕获技术相比，Long-range
PCR可以明显缩短时间，时间缩短了60%以上，成本也大大降低了。
附图说明
图 1为本发明所述Long-range PCR 扩增BRCA1和BRCA2全长检测电泳图；
图2为现有技术的扩增BRCA1和BRCA2全长检测电泳图；
图3是LabChip
GX(Caliper)检测文库片段大小分布图；
图4是利用Illumina
HiSeq™ 2500进行测序的结果。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于进一步说明本发明，并不用于限制本发明的范围。任何与所记载内容相似或相等的方法及材料均可应用于本发明中。所述的较佳实施例仅作示范之用。实施例中未注明具体条件的实验方法，按本技术领域常规方法进行或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.引物设计
BRCA1（chr17:38447840-385339940）和BRCA2（chr13:31784617-31873809）全基因组区域作为long-range PCR扩增区域，合成18对引物（10对BRCA1引物和8对BRCA2引物）。这些扩增子长度从4.2kb-14kb。引物信息详见下表1：
表1：10对BRCA1引物和8对BRCA2引物
2. DNA提取
DNA提取采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织DNA提取试剂盒（DP304）。
3.
Long-PCR扩增体系20ul反应体系
SequalPrep 10×反应缓冲液（包括Mg 2+和dNTPs）
2ul
SequalPrep PCR增强剂
2ul
二甲基亚砜DMSO
0.4ul
引物对（2.5umol/L）
1ul
SequalPrep Long 聚合酶
0.25ul
DNA模板
50ng
ddH2O
加至20ul 。
其中，Long-PCR扩增反应程序如下：
Long-PCR扩增条件为：94℃预变性2分钟；然后进入循环：94℃变性10秒，55-65℃退火30秒，68℃延伸9-14分钟，进行10个循环；后续进行25个循环，每个循环延伸时间增加20秒；最后72℃延伸10分钟；4℃ 保存。
4.琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化
切胶纯化按照QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen,
Valencia, CA)试剂盒实验流程进行。纯化后Qubit2.0(Invitrogen)测定PCR产物浓度（按照199:1的比例配制预混液，然后将预混液以199ul分装至Qubit
EP管中，扣盖写好标记，再加入1ul相应的PCR产物，振荡混匀，室温暗室2分钟后，测定浓度）。浓度见表2。
5.将纯化后的18个扩增子等摩尔混合后按照1ug起始量进行文库构建。DNA小片段文库构建-Illumina’s protocols(Ilumina, San Diego, CA)
5.1样本打断：
取上述总量1μg等摩尔混合的PCR产物作为起始样本，采用80μl打断体系，不足的部分用TE 缓冲液补齐。使用Biorupter Sonication System将样品DNA打断至200bp。具体操作方法见《Bioruptor
Sonication System UCD-600标准操作流程》。
5.2.末端修复(End Repair)
配制末端修复Mix：预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，将其置于冰上化冻并充分混匀。单个样本配制量参见表3，多样本可按比例配制Mix。将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。
末端修复反应：向1.5 ml离心管中分装25ul Mix，根据建库任务单向相应管中加入DNA样本。将反应体系置于Thermomixer中20℃温浴30 分钟。反应结束后使用1.8× Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于32μl EB。
5.3.末端加“A”（A-Tailing）
配制末端加“A”Mix：预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，将其置于冰上化冻并充分混匀。单个样本配制量参见表4，多样本可按比例配制Mix，将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。
末端加“A”反应：向1.5 ml的离心管中分装18ul Mix，根据建库任务单向相应管中加入DNA。将样本置于Thermomixer中37℃温浴30分钟。使用1.8× Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于18μl EB中。
5.4.
Adapter的连接（Adapter Ligation）
配制Adapter的连接Mix：预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，将其置于冰上化冻并充分混匀。单个样本配制量参见表5，多样本可按比例配制Mix，将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。
Adapter的连接反应：向1.5 ml的离心管中分装好32ul Mix，根据建库任务单向相应管中加入DNA。将样本置于Thermo mixer中20℃温浴15分钟。使用1.8× Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于30μl EB中。
5.5.
PCR反应
配制PCR反应体系：从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，将其置于冰上化冻并充分混匀。在0.2
ml的PCR管中配制PCR反应体系，单个样本配制量参见表6，多样本可按比例配制混合物（模板量X根据连接产物浓度来决定，用量约50-100ng），将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。
PCR反应：设置PCR程序，使用前需要与任务单再次核对。PCR反应的程序如下，反应结束后，及时将样品取出放入4℃冰箱保存并按要求退出程序或关闭仪器。
5.6. PCR产物的回收纯化
0.9× Ampure磁珠回收纯化反应体系中的PCR产物，溶于30μl EB中。
5.7.文库定量
对文库进行2100 Bioanalyzer(Agilent)/LabChip
GX(Caliper)及QPCR 检测，记录文库浓度。构建好的文库用Illumina
HiSeq™ 2500进行测序。
图1为Long-range PCR扩增结果凝胶电泳图，Maker为1kb
DNA ladder。图2为现有技术的扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图。由图可知本发明电泳图目的条带清晰，单一，特异性较强，与预期结果一致。图3为LabChip GX（Caliper）检测文库片段大小分布图，如图所示该片段长度为330bp（加接头后），片段浓度为238.6nmol/L，其峰单一，片段长度及浓度符合文库构建的标准。图4是利用Illumina
HiSeq™ 2500进行测序结果，测序的覆盖度达到99.86%，BRCA1和BRCA2全长与目标序列比对发现相似度高达98.47%。测序发现BRCA1没有发现SNP位点，BRCA2发现3个SNP位点，分别位于13号染色体第32906729、32929387、32890572个碱基上。NCBI登陆号为rs144848、rs169547、rs1799943。根据已有资料信息比对发现，该三个SNP位点为无害突变。结果该样品为阴性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120> 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒
<160> 18
<170> patentin 3.3
<210> Brca1.1L
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.1L
ACCCCAACAT TGATTCCTTT
C
21
<210> Brca1.1R
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.1R
CACAGGGAGA AAGTCTGCAA
G
21
<210> Brca1.2L
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.2L
GGGAGCTGAG AAAGCAGCCA
GC
22
<210> Brca1.2R
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.2R
TCGGCAGGAA TCCATGTGCA
GC
22
<210> Brca1.3L
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.3L
AGCAGAAGAA CGTGCTCTTT
TCACGG
26
<210> Brca1.3R
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.3R
ACAGTCTTCA ATGTGGAGGC
AGTAGGG
27
<210> Brca1.4L
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.4L
CTGGATTGAA GATGGGTGAG
A
21
<210> Brca1.4R
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.4R
TTTCCTGTAC CTTGCCAACA
C
21
<210> Brca1.5L
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.5L
GGCAATCCTG
AAGAAGTGGA
20
<210> Brca1.5R
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.5R
ACAAAGCAGC GGATACAACC
20
<210> BR1_P6.1F
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P6.1F
ACGTTGCGGA
GAGGTGAG
18
<210> BR1_P6.1R
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P6.1R
TAGCCAGGCA TAGTTGCACA
20
<210> BR1_P6.2F
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P6.2F
CTCCACCTCC
CTGGTTCAGT
20
<210> BR1_P6.2R
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P6.2R
AGCTTTGTGG
TGAGGTGTTG
20
<210> BR1_P7F
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P7F
GGCTCAAAGG
ACCTCCTACC
20
<210> BR1_P7R
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> BR1_P7R
AGGCAGAGGA
ACCTCTTGAA
20
<210> Brca1.8L
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.8L
GCCATGAAAA GATAATCTCA
CAACTGC
27
<210> Brca1.8R
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.8R
GGTGGCTCTG CTTATATACA
CAACTGG
27
<210> Brca1.9L
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.9L
TCACCCTGGT
CCAACAACCA
20
<210> Brca1.9R
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca1.9R
TGTTCGTTCC
TCCCGTCTGG
20
<210> Brca2.1L.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.1L.RS
CTCCCCCACA AAAAGGGGAC
AAAGC
25
<210> Brca2.1R.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.1R.RS
ACAAACTCCC ACATACCACT
GGGGG
25
<210> Brca2.2L.RS
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.2L.RS
CTCGGGGCAT CCTTTTTGGG
GG
22
<210> Brca2.2R.RS
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.2R.RS
TGACATGCTG CAGCCAAGAC
CT
22
<210> Brca2.3L.RS
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.3L.RS
GCCACTGTGC CCAAACACTA
CC
22
<210> Brca2.3R.RS
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.3R.RS
TGTGCCTGGC CTCAATTCAC
CA
22
<210> Brca2.4L.RS
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.4L.RS
TGACCCACAG TAAGGCACAT
C
21
<210> Brca2.4R.RS
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.4R.RS
GCCCTCTTCT ACCATTTGTG
C
21
<210> Brca2.5L.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.5L.RS
GGCCTTATGG TAGATTCCTC
CCCCG
25
<210> 反向引物Brca2.5R.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.5R.RS
TGGGCCTCCA CATATTTTGC
TGCTT
25
<210> Brca2.6L.RS
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.6L.RS
GGAGGCCCAA CAAAAGAGAC
20
<210> Brca2.6R.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.6R.RS
GTGGTTTAGC
CGGACTCCTC
20
<210> Brca2.7L.RS
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.7L.RS
CAGAAGGGGA
ATCAGGATCA
20
<210> Brca2.7R.RS
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.7R.RS
GCTGATAGGG
AGAGGGGAAC
20
<210> Brca2.8L.RS
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.8L.RS
TTAATTGCCC ATGAACCTCA
G
21
<210> Brca2.8R.RS
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> Brca2.8R.RS
TATTGACTTG TATTGTGTTC
GCTGT
25
Claims (3)
1.一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组，共有18个引物对，其特征在于，包含以下3个引物对：
（1）引物对1：
正向引物BR1_P6.1F：5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R：5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
（2）引物对2：
正向引物BR1_P6.2F：5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R：5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
（3）引物对3：
正向引物BR1_P7F：5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R：5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’
。
2.一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.利用TIANamp Genomic
DNA Kit血液/细胞/组织DNA提取试剂盒（DP304）对采集
的样本进行DNA提取；
B.利用总共18个引物对分别进行目标序列的Long-
range PCR扩增，其中所述引物对中包含下述3个引物对：
（1）引物对1：
正向引物BR1_P6.1F：5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R：5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
（2）引物对2：
正向引物BR1_P6.2F：5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R：5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
（3）引物对3：
正向引物BR1_P7F：5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R：5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’，
BRCA2需要8个引物对进行8个片段的扩增；
C. QIAquick Gel
Extraction Kit回收纯化扩增产物，invitrogen Qubit2.0测定PCR产物浓度；
D.将纯化后的扩增子等摩尔混合后按照1ug起始量进行小片段文库构建；
E.PCR产物的回收纯化；
F.对测序文库进行Agilent 2100及QPCR检测，利用Illumina HiSeq™
2500对文库进行测序。
3.一种用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的试剂盒，包括：溶液A：SequalPrep 10×反应缓冲液，包括Mg 2+和dNTPs；溶液B：SequalPrep PCR增强剂；溶液C：二甲基亚砜DMSO；溶液D：引物对，2.5umol/L；溶液E：SequalPrep Long 聚合酶；溶液F：ddH2O，其中，溶液D的引物对包括用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对和用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA2的8个引物对，其中，用于特异性扩增乳腺癌易感基因BRCA1的10个引物对中包含以下3个引物对：
（1）引物对1：
正向引物BR1_P6.1F：5’-ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3’
反向引物BR1_P6.1R：5’-TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3’
（2）引物对2：
正向引物BR1_P6.2F：5’- CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3’
反向引物BR1_P6.2R：5’- AGCTTTGTGGTGAGGTGTTG -3’
（3）引物对3：
正向引物BR1_P7F：5’- GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3’
反向引物BR1_P7R：5’- AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3’。
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