CN108060228B - 一种检测brca1和brca2基因变异的检测引物、试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测brca1和brca2基因变异的检测引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物、试剂盒及方法，涉及生物检测领域，包括用于富集BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的富集引物组合；以及用于标记BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的标记引物组合；所述富集引物组合利用五个富集引物组，就实现了待测样品中的BRCA1和BRCA2基因目标区域的100％富集，测序后即可获得序列突变信息；所述标记引物组合利用五个标记引物组实现了BRCA1和BRCA2基因的所有外显子所在区域的特征片段的扩增，通过判断特征片段的大小和峰高，判断各外显子在基因组中的拷贝数和相应区域的大片段重组情况。本发明所提供的检测方法具有操作简单，成本低廉的优点。

Description

一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物、试剂盒及方法。
背景技术
BRCA1和BRCA2是重要的抑癌基因，参与染色体损伤修复过程。BRCA1和BRCA2的突变可能造成基因功能的降低或缺失，进而增加细胞癌变的风险。现有的数据显示，这两个基因的胚系突变是造成遗传性乳腺及卵巢癌的最重要因素，突变携带者一生中罹患乳腺癌的几率可高达87％，卵巢癌的几率可高达44％。因此，对高危人群进行BRCA1/2基因突变检测，对于癌症的预防，发现和治疗有着重要的指导意义。
BRCA1/2的突变分为两种。第一种是单个碱基的突变或少量碱基的缺失和插入，可以造成氨基酸序列的改变，翻译提前终止，或信使RNA加工的异常，进而影响蛋白的功能。第二种是大片段DNA重组，可以造成一个或多个外显子的缺失或重复，从而扰乱基因功能。这两种突变中，第一种占大部分，并且可通过基因片段PCR扩增和Sanger测序相结合的常规方法进行检测。第二种占少部分，需要通过Southern杂交，MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)，定量PCR或CGH(comparative genomichybridization)等较为复杂的方法来检测。第二代高通量测序技术也被运用到了BRCA1/2突变的检测中。通过高通量测序，两种类型的突变可以被同时检测。但是，利用二代测序技术进行大片段DNA重组的检测，对基因组目的区域的富集方式、测序深度和信息分析等都有特定的要求，对于很多实验室现有的检测平台来说都是非常大的挑战。所以，一种快速有效的BRCA1/2大片段重组检测技术，无论是作为独立的大片段重组检测项目，还是作为常规点突变检测的补充，都有非常重要的应用价值。
BRCA1和BRCA2共有48个外显子。用Southern杂交或实时定量PCR来检测工作量大。CGH可同时检测整个基因区域，但对技术平台有很高的要求。以多重PCR为基础的检测技术操作简单，方便快捷。MLPA技术被广泛用于BRCA1/2及许多其它基因大片段DNA重组的检测，目前还存在数据变异较大的缺点，检测精确度有待提高。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明一方面设计了一套共26对扩增BRCA1和BRCA2所有外显子，和部分内含子区域，互不重叠的扩增引物。它们的扩增子长度在2kb至8kb之间，分组进行多重PCR，每个片段均能通过普通的琼脂糖凝胶电泳进行区分。本发明同时提供了这些引物的一种分组方式及每组引物在多重引物混合物中的浓度。将多重PCR扩增产物混合后，打碎，构建文库，进行高通量测序，结果显示各外显子及附近的内含子区域有均一的覆盖。
另一方面针对BRCA1和BRCA2的各个外显子所在区域开发了一套标记引物，根据扩增产物片段大小分为五组，利用GeXP原理进行多重扩增。只需通用引物中的一条进行5’段荧光修饰。五组多重PCR产物片段大小均分布在180至500bp的范围之间。在3730xl测序仪上进行片段分析后，通过片段大小和峰高判定每个外显子的扩增强度，进而判断各外显子在基因组中的拷贝数和相应区域的大片段重组情况。本发明所提供的检测方法具有操作简单，成本低廉的优点。
为实现本发明的技术目的，本发明第一方面提供一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物，包括：用于富集BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的富集引物组合；以及用于标记BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的标记引物组合。其中，所述富集引物组合包括从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的多对富集引物中得到的五个富集引物组。
其中，所述五个富集引物组是根据所述多对富集引物对BRCA1和BRCA2基因进行扩增得到的扩增片段的大小进行分组得到的，将PCR反应数降低到5个；
其中，在对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行扩增时，利用所述5个富集引物组中的每个富集引物组分别对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR处理，得到五组扩增产物，实现待测样品中的BRCA1和BRCA2基因目标区域的100％富集。
其中，所述每组扩增产物的扩增片段之间长度有明显区别，使得扩增产物质量易于监控。
其中，所述标记引物组合包括从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的多对引物中获得五个标记引物组；
其中，所述五个标记引物组是根据混合所述多对引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，并根据扩增所得的对应于BRCA1和BRCA2基因的各个外显子的不同长度的扩增子进行分组得到的；
其中，所述五个标记引物组中，每组标记引物中的每个标记引物所扩增的扩增子长度均不相同，且每个长度不同的扩增子均对应BRCA1和BRCA2基因上的不同外显子所在的基因区域，从而通过检测扩增子的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。
其中，所述富集引物组合具有如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.52所示的序列。
特别是，所述富集引物组合包括五个富集引物组，分别为：
如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44所示的第一富集引物组，其中，所述SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44为五对互为上下游组成的富集引物；如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.38所示的第二富集引物组，其中，所述SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11和SEQID NO.12、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38为五对互为上下游组成的富集引物；如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50所示的第三富集引物组，其中，所述SEQID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.49和SEQ IDNO.50为六对互为上下游组成的富集引物；如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示的第四富集引物组，其中，所述SEQID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ IDNO.48为六对互为上下游组成的富集引物；如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52所示的第五富集引物组，其中，所述SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52为四对互为上下游组成的富集引物。其中，所述标记引物组合具有如SEQ ID NO.53-SEQ ID NO.156所示的序列。
特别是，所述标记引物组合包括五个标记引物组，分别为：
如SEQ ID NO.53-SEQ ID NO.72所示序列的第一标记引物组；如SEQ ID NO.73-SEQ ID NO.96所示序列的第二标记引物组；如SEQ ID NO.97-SEQ ID NO.116所示序列的第三标记引物组；如SEQ ID NO.117-SEQ ID NO.136所示序列的第四标记引物组；如SEQ IDNO.137-SEQ ID NO.153所示序列的第五标记引物组。
其中，每个标记引物组中从第一个序列开始，每相邻的两个序列为一个互为上下游的引物，例如SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54为一对互为上下游的引物、SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56为一对互为上下游的引物、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58为一对互为上下游的引物。
特别是，所述标记引物组合中的每个引物均嵌有低退火温度的通用引物序列。
其中，所述通用引物序列如SEQ ID NO.157-SEQ ID NO.158所示
为实现本发明的技术目的，本发明第二方面提供一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的试剂盒，包括第一方面所述的检测引物，还包括：用于配合富集引物组合对待测样本进行多重PCR扩增的具有长片段扩增能力的DNA聚合酶；用于配合标记引物组合对待测样本进行多重PCR处理的低退火温度的通用引物。
尤其是，所述富集引物组合中的每个富集引物的浓度都不完全相同，所述标记引物组合中的每个标记引物的浓度都不完全相同。
其中，所述富集引物组合包括五组富集引物组，每组富集引物组中的每个富集引物浓度如表1所示：
表1富集引物组合浓度
Figure BSA0000145547450000041
其中，所述标记引物组合包括五组标记引物组，每组标记引物组中的每对标记引物浓度如表2所示：
表2标记引物组浓度
Figure BSA0000145547450000042
Figure BSA0000145547450000051
特别是，使用所述富集引物组合的退火温度为62-64℃。
尤其是，所述多重PCR处理包括三个阶段。
其中，第一阶段的退火温度低于第二个阶段的退火温度，第二阶段的退火温度高于第三阶段的退火温度。
其中，所述第一阶段的退火温度为56℃，第二阶段的退火温度为65℃，第三阶段的退火温度为48℃。
特别是，第一阶段的循环数低于第三阶段的循环数，第二阶段的循环数低于第三阶段的循环数。
其中，所述第一阶段的循环数为十个，第二阶段的循环数为十个，第三阶段的循环数为二十个。
为实现本发明的技术目的，本发明第三方面提供一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的方法，包括：
利用扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的富集引物组合对待测样本进行检测，获得基因序列突变的检测结果；
利用扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的标记引物组合对待测样本进行检测，获得基因大片段重组的检测结果；
根据所述基因序列突变的检查结果和基因大片段重组的检测结果获得BRCA1和BRCA2基因的变异信息；
其中，所述富集引物组合是从扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的多对引物中得到的五个富集引物组，利用所述五个富集引物组中的每个引物组对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR处理时，实现待测样品中的BRCA1和BRCA2基因目标区域的100％富集。
其中，所述标记引物组合是从扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的多对引物中获得五个标记引物组，利用五个标记引物组中的每个引物组对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增所获得的扩增子长度均不相同，且每个长度不同的扩增子均对应BRCA1和BRCA2基因上的不同的外显子所在基因区域，从而通过获得每个扩增子的峰高即可得到BRCA1和BRCA2基因上各个外显子所在区域的大片段重组突变信息。
其中，所述富集引物组合具有如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.52所示的序列；
其中，所述标记引物组合具有如SEQ ID NO.53-SEQ ID NO.156所示的序列。
其中，所述利用扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的富集引物组合对待测样本进行检测，获得基因序列突变的检测结果包括：
利用富集引物组合中的每个富集引物组合分别对待测样本进行BRCA1和BRCA2基因目标区域富集处理，获得100％富集了BRCA1和BRCA2基因目标区域的扩增子；
对纯化后的所述扩增子进行文库构建，经测序后，将测序结果与数据库比对分析，获得得BRCA1和BRCA2基因序列突变信息。
特别是，所述利用富集引物组合中的每个富集引物组合分别对待测样本进行BRCA1和BRCA2基因目标区域富集处理是利用包含长片段DNA聚合酶的混合液，并以待测样本的DNA为模板，以所述五个富集引物组中的每个引物组为扩增引物分组进行。
其中，所述多重PCR处理的反应退火温度为62-64℃。延伸时间以最长的扩增子(8kb)为基准。
具体的，所述多重PCR处理的优选反应条件是：95℃预变性5分钟，32个循环98℃变性10秒，62℃退火15秒，68℃延伸9分钟。
特别是，所述长片段DNA聚合酶是指具有长片段扩增能力的DNA聚合酶。
其中，所述包含长片段DNA聚合酶的混合液，为现有技术中常用的DNA聚合酶试剂盒，可以通过市售得到，例如Takara公司的PrimeStar GXL产品，其中包含了缓冲液、dNTP、DNA聚合酶等成分。
其中，所述利用扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的标记引物组合对待测样本进行检测，获得基因大片段重组的检测结果包括：
利用标记引物组合中的每个标记引物组合分别对待测样本进行多重PCR处理，获得每组均有多个有明显长度差异的BRCA1和BRCA2基因的扩增子的五组产物；
根据所获得的每组中的多个有明显长度差异的BRCA1和BRCA2基因的扩增子的峰高，获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。
其中，所述利用标记引物组合中的每个标记引物组分别对待测样本进行多重PCR处理时还使用了用于配合所述每个标记引物组的低退火温度的通用引物。
其中，所述通用引物序列如SEQ ID NO.105-SEQ ID NO.106所示。
尤其是，所述每个标记引物组中的每个标记引物的5’端均嵌有所述低退火温度的通用引物。
其中，所述利用五个标记引物组中的每个引物组分别对待测样本进行多重PCR处理的反应体系为：10x Ex Taq HS buffer 2.5μL；dNTP(2.5mM each)2μL；uni_f(10μM)0.5μL；uni_r(10μM)0.5μL；多重引物2.5μL；TaKaRa Ex Taq HS(5units/μl)0.125μL；模板50ng；水至25μL。
特别是，所述多重PCR处理包括三个阶段。
其中，第一阶段的退火温度低于第二个阶段的退火温度，第二阶段的退火温度高于第三阶段的退火温度。
特别是，第一阶段的循环数低于第三阶段的循环数，第二阶段的循环数低于第三阶段的循环数。
尤其是，所述第一阶段的退火温度为56℃，第二阶段的退火温度为65℃，第三阶段的退火温度为48℃。
特别是，所述多重PCR处理的第一个阶段是，5℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，十个循环。
特别是，所述多重PCR处理的第二个阶段是，5℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s，十个循环。
特别是，所述所述多重PCR处理的第三个阶段是，5℃变性30s、48℃退火30s、72℃延伸30s，二十个循环。
采用多重PCR及毛细管电泳进行大片段重组检测时，为使PCR维持线性扩增，严格控制PCR反应的模板量和PCR循环数，但是这样的控制会降低检测的效率和可信度的冗余，因此本发明采用了低退火温度的通用引物，一方面将通用引物添加到每个引物的5’端，另一方面将通用引物与每个引物组配合进行PCR，并将PCR的反应条件控制为三个阶段，第一、二个阶段的扩增仅为10个循环数，使每个引物为主导进行PCR扩增，然后在第三个阶段降低退火温度，以通用引物为主导进行PCR扩增，保证了扩增产物中各片段的相对浓度不会偏离原始模板DNA中各区段相对浓度，后期的通用引物的扩增为无差别扩增，也不会造成偏差，并且循环数要求不再严格，使毛细管电泳检测可以准确获得峰高信息。
有益效果：
1、本发明提供的富集引物组合可以与BRCA1和BRCA2基因的目标区域特异性结合，扩增出BRCA1和BRCA2基因的所有外显子及外显子侧翼的内含子，覆盖了具有临床意义的突变位点，实现BRCA1和BRCA2基因的目标区域的富集，简化了序列突变检测步骤；本发明提供的标记引物组合中每个引物的特异性好，其所扩增出的每个基因片段大小都不相同，均分布在180至500bp的范围之间，不会发生引物与模板的非特异性结合，扩增结果可以真实准确反映BRCA1和BRCA2基因的遗传信息，为判断各外显子在基因组中的拷贝数和相应区域的大片段重组情况提供基础。
2、由于本发明提供的富集引物组合和标记引物组合均为五个引物组，因此对BRCA1和BRCA2基因进行序列突变检测或大片段重组检测都仅需要5个反应数(即，使用5个反应管)就可以实现，远低于相对于现有技术采用的需要17个反应数进行富集再进行序列突变检测，因此，本发明的提供引物成本低，效率高；而且利用本发明的每个引物组对待测样本进行检测，所获得的扩增产物中的每个扩增子均可利用琼脂糖凝胶电泳进行分离，每个扩增子大小均不相同，其分别可以反应BRCA1和BRCA2基因上不同位置的外显子及外显子侧翼内含子区域的编码信息，因此，利用本发明提供的引物可靠性好。
3、本发明提供的变异检测方法简单、结果可靠、效率高、成本低廉，普适性广，有利于本领域技术人员对BRCA基因进行多态性分析或序列突变检测或其他研究；并且利用该方法获得的扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳直接观察，就可以直观的获得基因信息，因此还可以将其用于检测过程的质控。
4、本发明提供的试剂盒成本低廉、富集效率高，可靠性好。
附图说明
图1是扩增后获得的电泳图；图2是磁珠纯化后的电泳图；图3是26对BRCA1和BRCA2引物扩增区域示意图；图4是BRCA1与BRCA2各外显子的平均覆盖率图；图5是本发明实施例3的电泳图；图6是本发明实施例3的扩增子所扩增的位置及分布图，图中，圆点表示扩增子；图7是本发明实施例3的各扩增片段相对含量对比图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。
在下面的描述中阐述了很多具体的细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
本发明所称的待测样本为血液，唾液，口腔拭子，新鲜组织，培养细胞等，不适用于甲醛固定石蜡包埋组织。
实施例1 检测引物
1、本发明采用常规的引物设计方法分别设计扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼内含子区域的富集引物，以及扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的标记引物。富集引物与标记引物均有多个，经过常规筛选，获得26个富集引物，52个标记引物，其中，26个富集引物如SEQ ID NO.：001-SEQ ID NO.：52所示，52个标记引物如SEQ ID NO.：53-SEQ ID NO.：158所示。
2、将筛选获得的26个富集引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，根据得到的扩增片段的大小，将所述26个引物分成5个引物组，同时使PCR的反应数降低到5个。发明人经过大量的试验调整，将26个引物分成了5个引物组，通过使每个引物组中的每个引物浓度都不完全相同，获得每组引物的扩增子大小均不相同。
同理，将筛选获得的52个标记引物将筛选获得的52个引物对BRCA1和BRCA2基因扩增处理得到大小不完全相同的扩增片段，根据扩增片段的大小分成五组，根据不同扩增片段所对应的不同引物，将52个引物分为5组，获得5个引物组，其中，每个引物组中的每个引物浓度都不完全相同。由于五个标记引物组对待测样本进行扩增后，每组引物中的每个引物所扩增的扩增子长度均不相同，且每个扩增子均对应BRCA1和BRCA2基因上的至少一个外显子区域，因此，只需通过检测扩增子的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因上所有区域的大片段重组的信息。
实施例2 试剂盒
本发明提供的试剂盒包括了上述5个富集引物组和5个标记引物组，还包括了用于配合5个富集引物组进行多重PCR扩增的具有长片段扩增能力的DNA聚合酶，以及用于配合5个标记引物组进行多重PCR扩增的低退火温度的通用引物，其具有如SEQ ID NO.：159-SEQID NO.：160所示的序列。
其中，所述具有长片段扩增能力的DNA聚合酶为市售的长片段DNA聚合酶试剂盒，在本发明的一个实施例中，采用的是例如Takara公司的PrimeStar GXL产品，其中包含了缓冲液、dNTP、DNA聚合酶等成分。所使用的EXTaq酶为市售的EX Taq酶试剂盒，其中包含了缓冲液、dNTP以及EX Taq酶等成分，在本发明的一个实施例中，采用的是例如Takara公司的EXTaq酶试剂盒。
1、按照表1所示的富集引物浓度进行五组富集引物组的配制，按照表2所示的标记引物浓度进行五组标记引物组的配制。
2、向每个富集引物组配制包括长片段扩增能力的酶，其中，配制的每个引物组、酶与模板的浓度比例为：
Figure BSA0000145547450000101
向每个标记引物组配制EX Taq酶体系、通用引物，其中，配制的每个引物组、酶体系、通用引物与模板的浓度比例为：10x Ex Taq HS buffer 2.5μL；dNTP(2.5mM each)2μL；uni_f(10μM)0.5μL；uni_r(10μM)0.5μL；多重引物2.5μL；TaKaRa Ex Taq HS(5units/μl)0.125μL；模板50ng；水至25μL。
其中，使用富集引物的多重PCR条件为：95℃预变性5分钟，32个循环98℃变性10秒，62℃退火15秒，68℃延伸9分钟；使用标记引物的多重PCR条件为：
Figure BSA0000145547450000102
以下，结合具体的实施步骤进一步说明本发明的特点。
本发明采用已知的5株乳腺癌细胞系作为待测样本I，分别为BT-474，HCC1395，HCC1569，MDA-MB-361，MDA-MB-436，HCC1937，其相关信息如表3所示：
表3样本I信息
Figure BSA0000145547450000103
表3中已知突变信息来源为CCLE，检测方法为杂交捕获测序。
采用中科院肿瘤医院保留的已知的5个核酸样本作为待测样本II，分别为LR0、LR1、LR2、LR3、LR4，其相关信息如表4所示：
其中，LR0为无大片段重组的样本，LR1、LR2、LR3、LR4为发生了大片段重组的已知阳性样本，经荧光定量PCR检测发现LR突变，并以长片段扩增技术验证，四个样本突变情况如下表4：
表4样本II信息
样品编号 突变情况 DNA浓度(ng/μL)
LR0 无突变 67.2
LR1 BRCA1第8至第9外显子区段缺失 43.5
LR2 BRCA1第14至第21外显子区段缺失 20.9
LR3 BRCA2第1至第2外显子区段缺失 45.1
LR4 BRCA1第14至第15外显子区段重复 63.2
实施例3 BRCA1和BRCA2基因序列突变的检测
1、样品的处理和基因组DNA提取
将样本I经过培养后，采用全式金公司的离心柱式基因组DNA提取试剂盒EasyPureMicroGenomicDNA Kit提取样本I的基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明进行提取，得到样本I的DNA提取液，将样本I的DNA提取液分别以100微升洗脱缓冲液洗脱，并经nanodrop 2000检测提取质量，并确定浓度，得到最终260/280值大于1.8，浓度均在30至60ng/μl之间的DNA溶液。
2、序列突变的检测
2.1扩增目的基因片段
分别以步骤1提取的DNA溶液和样本II的核酸样本为模板按照下述扩增反应体系分别建立样本I和样本II的反应体系：
Figure BSA0000145547450000111
将样本I和样本II反应体系分别在反应条件为95℃预变性5分钟，32个循环98℃变性10秒，62℃退火15秒，68℃延伸9分钟中进行扩增，分别得到样本I和样本II中每个样品的五组扩增产物，每组扩增产物均各取5μl，在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，样本I和样本II的样品均获得如图1所示的具有五组明亮分明条带的电泳图，根据电泳图确认条带，图中以样本I中所有样品的电泳图为例。
根据如图1所示的电泳图可知，每个样品的每个片段均能表现出明亮的条带，可见，使用本发明提供的引物特异性好，通过普通的琼脂糖凝胶电泳就可以对每个DNA片段进行确认。
2.2、测序
2.2.1、纯化处理
将样本I和样本II中的每个样品的5组扩增产物等体积混合成一管，组合成一个完整的待测样本。取30μl，加入24μl磁珠(AxyPrep PCR Clean-up Kit)，按说明书进行纯化。纯化后，用nanodrop2000测定浓度，并稀释到10ng/μl。
2.2.2、高通量测序文库构建
采用诺唯赞公司的TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina试剂盒构建文库。该试剂盒构建文库包含两个主要步骤，首先是利用转座酶将步骤2.2.1获得的目的基因片段打断，然后在打断后的片段两端加上适用于Illumina Hiseq测序平台的接头，并富集文库，具体步骤遵循试剂盒操作说明，得到构建后的测序文库。
向构建的文库中加入0.6倍体积的磁珠(AxyPrep PCR Clean-up Kit)进行磁珠纯化，去除小于300bp的片段，得到如图2所示的电泳图。
2.3、高通量测序
在Illumina Hiseq 2000平台上对步骤2.2建立的文库测序，获得每个文库的数据，与样本的已知序列信息比对，发现所的序列覆盖了BRCA1和BRCA2基因上的所有外显子及外显子侧翼的内含子，如图3所示。
根据图3所示的26对BRCA1和BRCA2引物扩增区域示意图可知，扩增子完全覆盖了BRCA1和BRCA2基因上的所有外显子，有些甚至覆盖了外显子之间的内含子。
由此可见，本发明提供的方法可以实现BRCA1和BRCA2基因所有外显子及外显子侧翼内含子的富集。
2.4、数据分析
采用bcbio-nextgen流程对高通量测序结果数据进行分析。高通量测序得到的reads通过bwa工具与人类基因组hg19数据库比对，通过freebayes工具进行多态位点预测，并以snpEff或VariantEffectPredictor(VEP)对多态进行注释。最后生成的vcf文件，在NCBI网站上与ClinVar数据库交叉对比，得到样本测序结果的总read数、GC含量％、文库插入片段中间值、PCR重复、PCR重复比例％、成功比对read数、成功比对比例％、脱靶read数、脱靶比例％，得到如表5所示的样本测序结果指标以及图4所示的BRCA1与BRCA2各外显子的平均覆盖率图。
表5样本测定指标结果
细胞系 hcc1937 hcc1596 hcc1395 bt474 mda mb 436
总read数 3189625 2867942 2990662 2588157 3244069
GC含量％ 40 40 39 40 39
文库插入片段中间值 302 308 310 311 301
PCR重复 1191329 1017587 1116907 869514 1242019
PCR重复比例％ 37.35 35.48 37.35 33.60 38.29
成功比对read数 3181017 2858305 2971290 2582873 3235904
成功比对比例％ 99.73 99.66 99.35 99.80 99.75
脱靶read数 108164 116308 110884 101443 103678
脱靶比例％ 3.40 4.10 3.70 3.90％ 3.20％
根据表5所示的测定结果中的“总read数”与“成功比对read数”的比例计算值可知，超过99％的read可以比对到hg19基因组上，可见，本发明获得样本生物信息准确。文库插入片段大小中间值差异较小，说明文库构建方法稳定。PCR重复比例，符合预期，脱靶比例最高仅为4.1％，说明目的基因片段的多重扩增特异性满足要求。
图4为BRCA1与BRCA2各外显子的平均覆盖率。纵轴表示覆盖乘数，以2的对数展示。横轴1-27依次对应BRCA2的1-27号外显子，28-50依次对应BRCA1的23-1号外显子(依据两基因在染色体上的位置和方向依次排列)。在各个外显子上，获得了较为均匀的覆盖，可见，本发明提供的引物组合实现了BRCA1和BRCA2基因外显子的富集，图4中仅以样本I为例。
5、序列突变分析
将测序结果与人类基因组hg19数据库比对，获得分析结果，其中，只有样本I的五个细胞系中检测到的有临床意义的突变，如表6所示，样本II中未检测到序列突变。表6中包括了可能对蛋白氨基酸序列产生影响，或临床致病性有文献报道的基因突变，其中可能存在临床致病性的突变黑体标出。
Figure BSA0000145547450000141
Figure BSA0000145547450000151
如表6所示得突变检测结果可知，五个细胞系中已知的致病性突变均成功检出，与样本的突变信息结果一致，符合率100％。
4、大片段重组检测
4.1、建立检测大片段重组的扩增反应体系：10x Ex Taq HS buffer 2.5μL；dNTP(2.5mM each)2μL；uni_f(10μM)0.5μL；uni_r(10μM)0.5μL；多重引物2.5μL；TaKaRa Ex TaqHS(5units/μl)0.125μL；模板50ng；水至25μL。
并将上述反应体系按照以下反应条件进行多重PCR扩增，获得扩增产物：
第一阶段十个循环：95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s；
第二阶段十个循环：95℃ 30s、65℃ 30s、72℃ 30s；
第三阶段二十个循环：95℃ 30s、48℃ 30s、72℃ 30s。
将所得产物经琼脂糖凝胶电泳后，发现到样本I和样本II中每个样品均可以获得如图5所示的具有5组条带分明的电泳图，每组条带中的每个条带大小都不相同，每个条带大小均在180至500bp的范围内。
可见，本发明提供的引物组中52对引物都具有非常好的特异性，可以与模板不同位置的外显子特异性结合，获得不同大小的扩增子，从而反映BRCA1和BRCA2基因的所有外显子所在区段的特征片段信息。
其中，扩增子所扩增的位置及分布如图6所示，图中，圆点表示扩增子。
4.2.扩增产物片段分析
取扩增产物1μL，与0.5μL LIZ-500及8.5μL去离子甲酰胺混合后，95℃变性3分钟，冰浴2分钟，放置在3730xl DNA分析仪上进行毛细管电泳分析，获得生成.FSA文件的电泳分析数据。
4.3.数据分析
将得到的分析数据导入GeneMapper软件进行DNA片段分析，获得峰高信息。
将各组片段的峰高分别进行归一化，使总峰高为1，每个片段的相对含量为此片段峰高占总峰高的比例，然后参照已知野生型样本的峰高值，将每个样本的5组片段分别进行归一化，获得峰高相对含量值，当归一化之后的值小于0.75判断为缺失，大于1.3判断为重复，经分析得知，样本I不存在大片段重组，其归一化前后的相对含量值与LR0样品相近，而样本II中的部分样品存在大片段重组情况，其归一化前后的峰高相对含量值如表7所示，各扩增片段相对含量对比如图7所示。
表7峰高相对含量值
Figure BSA0000145547450000161
Figure BSA0000145547450000171
Figure BSA0000145547450000181
根据表7的数据可以得到如表8的判断结果：
表8判断结果：
Figure BSA0000145547450000182
由于本发明的引物可以准确的扩增出BRCA1和BRCA2基因上所有外显子所在区域的特征片段，因此本发明的引物及方法不但可以准确检测出大片段重组，而且成本低廉，检测结果可以经过直观的判断得出。
利用本发明提供的富集引物对待测样本进行多重PCR，不仅可以在低成本的条件下(仅建立5个反应体系)实现待测样本的BRCA1和BRCA2基因所有外显子和毗邻的内含子区域的富集，一次性检测所有可能存在临床意义的BRCA1和BRCA2点突变，还可以直观的对待测样本的BRCA1和BRCA2基因进行质控；利用本发明提供的标记引物对待测样本进行多重PCR，同样是在极低成本条件下，获得待测样本的BRCA1和BRCA2基因所有外显子所在区域的情况，通过毛细管电泳就可以判断待测样本的BRCA1和BRCA2基因是否发生了大片段重组。
需要说明的是，本发明将引物组合应用于BRCA1和BRCA2突变的检测，虽然在某些情况下，对这些基因的检测对于相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的辅助意义，但这些突变不是必然导致所述疾病的发生，如表6所示的检测结果，因此对这些基因的检测并不一定涉及疾病的诊断或治疗方法。
Figure ISA0000145547470000011
Figure ISA0000145547470000021
Figure ISA0000145547470000031
Figure ISA0000145547470000041
Figure ISA0000145547470000051
Figure ISA0000145547470000061
Figure ISA0000145547470000071
Figure ISA0000145547470000081
Figure ISA0000145547470000091

Claims (5)

1.一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的检测引物，其特征在于，所述检测引物包括：
用于富集BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的富集引物组合，如SEQ ID NO.1-SEQID NO.52所示的序列；以及
用于标记BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的标记引物组合，如SEQ ID NO.53-SEQ ID NO.156所示的序列；
其中，所述富集引物组合从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的多对富集引物中得到的五个富集引物组；
其中，所述五个富集引物组是根据所述多对富集引物对BRCA1和BRCA2基因进行扩增得到的扩增片段的大小进行分组得到的，以便将PCR反应数降低到5个；
其中，在对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行扩增时，利用所述5个富集引物组中的每个富集引物组分别对待测样品中的BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR处理，得到五组的扩增产物，实现待测样品中的BRCA1和BRCA2基因目标区域的100％富集；
其中，所述标记引物组合包括从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的一段序列的多对引物中获得五个标记引物组；
其中，所述五个标记引物组是根据混合所述多对引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，并根据扩增的对应于BRCA1和BRCA2基因的各个外显子的不同长度的扩增子进行分组得到的；
其中，所述五个引物组中，每个引物组中的每个引物所扩增的扩增子长度均不相同，且每个扩增子均对应BRCA1和BRCA2基因上的至少一个外显子区域，从而通过检测扩增子的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。
2.如权利要求1所述的检测引物，其特征在于，所述标记引物组合中的每个引物均嵌有低退火温度的通用引物序列，如SEQ ID NO.157-SEQ ID NO.158所示。
3.一种检测BRCA1和BRCA2基因变异的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一所述的检测引物，还包括：
用于配合富集引物组合对待测样本进行多重PCR扩增的具有长片段扩增能力的DNA聚合酶；
用于配合标记引物组合对待测样本进行多重PCR处理的低退火温度的通用引物；
其中，所述富集引物组合中的每个引物的浓度都不完全相同，所述标记引物组合中的每个引物的浓度都不完全相同。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，使用所述富集引物组合的退火温度为58-64℃。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR处理包括三个阶段，其中，第二个阶段的退火温度均高于第一阶段及第三阶段的退火温度，第一阶段及第二阶段的循环数均低于第三阶段的循环数。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113897420A (zh) * 2020-06-22 2022-01-07 上海思路迪生物医学科技有限公司 基于扩增子测序的大片段重排检测的引物组合物、试剂盒和检测方法
CN114164271B (zh) * 2021-12-13 2024-04-26 奥明（杭州）基因科技有限公司 一种基于长片段pcr检测乳腺癌易感基因变异的引物对，试剂盒及其方法
CN116179710B (zh) * 2023-03-14 2023-11-24 成都诺森医学检验有限公司 基于高通量测序平台的brca1/2基因突变检测的引物组、文库构建与环化方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104789664A (zh) * 2015-04-02 2015-07-22 安诺优达基因科技(北京)有限公司 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒
CN105586427A (zh) * 2016-03-10 2016-05-18 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 检测人类brca1和brca2基因突变的引物、试剂盒及方法
CN105779636A (zh) * 2016-05-18 2016-07-20 广州安必平医药科技股份有限公司 用于扩增人乳腺癌易感基因brca1和brca2编码序列的pcr引物及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104789664A (zh) * 2015-04-02 2015-07-22 安诺优达基因科技(北京)有限公司 用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR检测的引物组、方法及试剂盒
CN105586427A (zh) * 2016-03-10 2016-05-18 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 检测人类brca1和brca2基因突变的引物、试剂盒及方法
CN105779636A (zh) * 2016-05-18 2016-07-20 广州安必平医药科技股份有限公司 用于扩增人乳腺癌易感基因brca1和brca2编码序列的pcr引物及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Long-range PCR in next-generation sequencing: comparison of six enzymes and evaluation on the MiSeq sequencer;Haiying Jia等;《Scientific Reports》;20140718;第1-8页 *
Rapid Detection of Novel BRCA1 Rearrangements in High-Risk Breast-Ovarian Cancer Families Using Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments;Federica Casilli等;《Hum. Mutat》;20020930;第218-226页 *

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