CN107338285B

CN107338285B - 一种用于检测brca1和brca2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒

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Publication number: CN107338285B
Application number: CN201710412529.8A
Authority: CN
Inventors: 刘建云; 汪彪
Original assignee: Beijing Mingdi Bio Pharmaceutical Science & Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Mingdi Bio Pharmaceutical Science & Technology Co ltd
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2017-06-05
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2037-06-05
Also published as: CN107338285A

Abstract

本发明公开了一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒，本发明的引物组合中的每对引物均可从BRCA1或BRCA2基因至少一个外显子所在区域扩增得到一个特征片段，特征片段长度各不相同，经过优化后，引物分为5组，进行多重PCR扩增，每组扩增产物的长度均具有差异。多重PCR以GeXP‑PCR方式进行，PCR反应前期为特征片段的线性特异扩增，后期以通用引物对特征片段进行无差别扩增。通用引物中的一条带上适宜的荧光修饰基团，即可于相应的毛细管电泳分析仪器上进行分析，获得各特征片段的相对含量信息，进而获得相应基因区域的大片段重组突变信息。本发明所提供的检测方法具有操作简单，成本低廉的优点，与普通的终点法多重PCR相比，解决了多重扩增偏好性问题，提高了可靠性。

Description

一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒。

背景技术

BRCA1和BRCA2是重要的抑癌基因，参与染色体损伤修复过程。BRCA1和BRCA2的突变可能造成基因功能的降低或缺失，进而增加细胞癌变的风险。现有的数据显示，这两个基因的胚系突变是造成遗传性乳腺及卵巢癌的最重要因素，突变携带者一生中罹患乳腺癌的几率可高达87％，卵巢癌的几率可高达44％。因此，对高危人群进行BRCA1/2基因突变检测，对于癌症的预防，发现和治疗有着重要的指导意义。

BRCA1/2的突变分为两种。第一种是单个碱基的突变或少量碱基的缺失和插入，可以造成氨基酸序列的改变，翻译提前终止，或信使RNA加工的异常，进而影响蛋白的功能。第二种是大片段DNA重组，可以造成一个或多个外显子的缺失或重复，从而扰乱基因功能。这两种突变中，第一种占大部分，并且可通过基因片段PCR扩增和Sanger测序相结合的常规方法进行检测。第二种占少部分，需要通过Southern杂交，多重连接探针扩增技术MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)，定量PCR或CGH(comparativegenomic hybridization)等较为复杂的方法来检测。第二代高通量测序技术也被运用到了BRCA1/2突变的检测中。通过高通量测序，两种类型的突变可以被同时检测。但是，利用二代测序技术进行大片段DNA重组的检测，对基因组目的区域的富集方式、测序深度和信息分析等都有特定的要求，对于很多实验室现有的检测平台来说都是非常大的挑战。所以，一种快速有效的BRCA1/2大片段重组检测技术，无论是作为独立的大片段重组检测项目，还是作为常规点突变检测的补充，都有非常重要的应用价值。

BRCA1和BRCA2共有48个外显子。用Southern杂交或实时定量PCR来检测工作量大。CGH可同时检测整个基因区域，但对技术平台有很高的要求。以多重PCR为基础的检测技术操作简单，方便快捷。MLPA技术被广泛用于BRCA1/2及许多其它基因大片段DNA重组的检测，目前还存在数据变异较大的缺点，检测精确度有待提高。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明针对BRCA1和BRCA2的所有外显子开发了一套引物，根据产物片段大小，将一套引物分为五组，利用GeXP原理，通过五组引物对待测样本进行多重扩增。利用五组引物进行多重PCR的产物片段大小分布在180至500bp的范围之间。利用一条通用引物上的荧光修饰使所有扩增片段一端带上荧光基团，通过毛细管电泳DNA分析仪进行片段分析后，通过片段大小识别特征片段，通过峰高判定每个外显子所在区域的扩增强度，进而判断各外显子在基因组中的拷贝数和相应区域的大片段重组情况。本发明所提供的检测方法具有操作简单，成本低廉的优点。

为实现本发明的技术目的，本发明第一方面提供一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合，所述引物组合包括：

从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的多对引物中获得五个引物组；

其中，所述五个引物组是根据混合所述多对引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，并根据扩增片段长度差异及其在BRCA1和BRCA2基因上的分布优化分组得到的；

其中，所述五个引物组中，每组引物中的每对引物所扩增的扩增产物片段长度均不相同，且每个扩增产物均代表BRCA1和BRCA2基因上的至少一个外显子所在的区域，从而通过检测扩增产物的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。

其中，所述五组引物对为：

如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20所示的第一组引物对；

如SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.44所示的第二组引物对；

如SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.64所示的第三组引物对；

如SEQ ID NO.65-SEQ ID NO.84所示的第四组引物对；

如SEQ ID NO.85-SEQ ID NO.104所示的第五组引物对。

其中，所述五组引物组＝对中的每对引物上均嵌有低退火温度的通用引物序列。

其中，所述通用引物序列如SEQ ID NO.105-SEQ ID NO.106所示。

其中，所述通用引物中的一条5’端是经过荧光修饰的。

为实现本发明的技术目的，本发明第二方面提供一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的方法，包括：

设计用来分别特异扩增BRCA1和BRCA2基因各个外显子所在区域特征片段的多对引物；

通过将所述多对引物混合进行多重PCR扩增，得到包括从各个外显子所在基因区域扩增来的多个扩增片段；

根据所得到多个扩增片段长度，对所述多对引物进行分组，使每组引物对中的所有引物分别对应于不同长度的扩增片段，从而得到五组引物对；

利用所述五个引物组中的每组引物对分别对待测样本进行多重PCR处理，获得每组均有多个有明显长度差异的BRCA1和BRCA2基因的扩增产物的五组产物；

根据所获得的每组中的多个有明显长度差异的BRCA1和BRCA2基因的扩增产物的峰高，获得BRCA1和BRCA2基因各个外显子所在区域的大片段重组突变信息。

其中，每组扩增产物中的各个片段间至少存在10bp的长度差异。

本发明的引物所扩增出的每个片段长度均具有10bp以上的差异，因此利用每组多重扩增产物中各片段的长度可以识别这一片段所代表的外显子区域，利用毛细管电泳所获得每个片段的峰高数据就可以反映出得BRCA1和BRCA2基因各个外显子的信息，通过对峰高数据进行归一化后，即可获得各个片段的相对含量信息，从而得到基因区域在基因组中的相对含量，进而判断各个外显子所在区域的大片段重组突变信息。

其中，所述五个引物组为：

如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20所示的第一引物组；

如SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.44所示的第二引物组；

如SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.64所示的第三引物组；

如SEQ ID NO.65-SEQ ID NO.84所示的第四引物组；

如SEQ ID NO.85-SEQ ID NO.104所示的第五引物组。

其中，所述五个引物组中的每一个引物上均嵌有低退火温度的通用引物序列。

其中，所述通用引物序列如SEQ ID NO.105-SEQ ID NO.106所示。

其中，所述利用所述五个引物组对待测样本进行多重PCR处理时还包括如SEQ IDNO.105-SEQ ID NO.106所示通用引物。

其中，所述通用引物的5’端具有荧光修饰。

其中，所述利用五个引物组中的每组引物对分别对待测样本进行多重PCR处理的反应体系为：

特别是，所述多重PCR处理包括三个阶段。

其中，第一阶段的退火温度低于第二个阶段的退火温度，第二阶段的退火温度高于第三阶段的退火温度。

特别是，第一阶段的循环数低于第三阶段的循环数，第二阶段的循环数低于第三阶段的循环数。

尤其是，所述第一阶段的退火温度为56℃，第二阶段的退火温度为65℃，第三阶段的退火温度为48℃。

特别是，所述多重PCR处理的第一个阶段是，5℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，十个循环。

特别是，所述多重PCR处理的第二个阶段是，5℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s，十个循环。

特别是，所述所述多重PCR处理的第三个阶段是，5℃变性30s、48℃退火30s、72℃延伸30s，二十个循环。

采用多重PCR及毛细管电泳进行大片段重组检测时，为使PCR维持线性扩增，需要严格控制PCR反应的模板量和PCR循环数，但是这样的控制会降低检测的效率和可信度的冗余，因此本发明采用了低退火温度的通用引物，一方面将通用引物添加到每对引物的5’端，另一方面将通用引物与每组引物对配合进行PCR，并将PCR的反应条件控制为三个阶段，第一、二个阶段的扩增仅为10个循环数，使每对引物为主导进行PCR扩增，然后在第三个阶段降低退火温度，以通用引物为主导进行PCR扩增，保证了扩增产物中各片段的相对浓度不会偏离原始模板DNA中各区段相对浓度，后期的通用引物的扩增为无差别扩增，也不会造成偏差，并且循环数要求不再严格，使毛细管电泳检测可以准确获得峰高信息。

为实现本发明的技术目的，本发明第三方面提供一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的试剂盒，包括第一方面所述的引物组合。

其中，所述引物组合中的每组引物对包括多个引物，每对引物的浓度不完全相同。

其中，所述第一组引物对包括10对引物，其中至少有两对以上的引物的浓度不完全相同，从而实现每个目的片段的高效扩增。

其中，所述第组引物对如表1所示，包括：

表1第一组引物对的引物信息

优选地，所述每组引物对的浓度如表2所示，为：

表2第一组引物对的优选浓度

引物对编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											浓度(uM)	0.36	0.23	0.24	0.2	0.5	0.27	0.21	0.3	0.46	0.31

其中，所述第二组引物对包括12对引物，其中至少有两对以上的引物对的浓度不完全相同，从而实现每个目的片段的高效扩增，如表3所示，包括：

表3第二组引物对的引物信息

优选地，所述每对引物的浓度如表4所示，为：

表4第二组引物对优选浓度

其中，所述第三组引物对包括10对引物，其中至少有两对以上的引物对的浓度不完全相同，从而实现每个目的片段的高效扩增，如表5所示，包括：

表5第三组引物对的引物信息

优选地，所述第三组引物对中的每对引物的浓度如表6所示，为：

表6第三组引物对的优选浓度

其中，所述第四组引物对包括10对引物，其中至少有两对以上的引物对的浓度不完全相同，从而实现每个目的片段的高效扩增，如表7所示，包括：

表7第四组引物对的引物信息

优选地，所述第四组引物对中每对引物的浓度如表8所示，为：

表8第四组引物对的优选浓度

其中，所述第五组引物对中包括10对引物，其中至少有两对以上的引物对的浓度不完全相同，从而实现每个目的片段的高效扩增，如表9所示，包括：

表9第五组引物对的引物信息

优选地，所述第五组引物对中每对引物的浓度如表10所示，为：

表10第五组引物对的优选浓度

其中，所述每组引物对的用量为：在25μL的PCR反应体系中，其用量为2.5μL。

其中，所述试剂盒还包括用于配合所述多个引物组合的通用引物，所述通用引物序列如SEQ ID NO.105-SEQ ID NO.106所示。

其中，所述通用引物的用量为，在25μL的PCR反应体系中，其用量为0.5μL。

特别是，本发明所称的待测样本不包括甲醛固定石蜡包埋组织。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的引物组中每对引物特异性好，其所扩增出的每个基因片段大小都不相同，均分布在180至500bp的范围之间，不会发生引物与模板的非特异性结合，扩增结果可以真实准确反映BRCA1和BRCA2基因的遗传信息，为判断各外显子在基因组中的拷贝数和相应区域的大片段重组情况提供基础。

2、本发明提供的引物、方法或试剂盒利用GeXP原理对待测样本进行多重扩增，根据片段大小和峰高就可以直观的判定每个外显子的扩增强度，判断各外显子在基因组中的拷贝数和相应区域的大片段重组情况，可见，本发明所提供的方法操作简单，成本低廉，普适性广。

附图说明

图1是本发明实施例3的电泳图；

图2是本发明在对引物进行浓度分组时的采用其他浓度分组进行多重PCR获得电泳图；

图3是本发明实施例3的扩增产物所扩增的位置及分布图，图中，圆点表示扩增产物。

图4是本发明实施例3的各扩增片段相对含量对比图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。

在下面的描述中阐述了很多具体的细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，下面公开的具体实施例的限制并非用于限定本发明。

实施例1引物组

1、本发明采用常规的引物设计方法设计扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的引物，筛选出扩增效率高，特异性强的，获得52对引物，52对引物如SEQ ID NO.：001-SEQ ID NO.：104所示，具体如表11所示：

表11引物组信息表

其中，表11中“f”表示上游引物，“r”表示下游引物。

2、将筛选获得的52对引物对BRCA1和BRCA2基因扩增处理得到大小不完全相同的扩增片段，根据扩增片段的大小分成五组，根据不同扩增片段所对应的不同引物，将52对引物分为5组，获得5组引物对，其中，每组引物对中的每对引物浓度都不完全相同。

由于利用本发明的五个引物组对待测样本进行扩增后，每组引物中的每对引物所扩增的扩增产物长度均不相同，且每个扩增产物均对应BRCA1和BRCA2基因上的至少一个外显子区域，因此，只需通过检测扩增产物的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因上所有区域的大片段重组的信息。

实施例2试剂盒

本发明提供的试剂盒包括了实施例1的5组引物对，还包括低退火温度的通用引物，以及EX Taq酶体系。

其中，通用引物的具有如SEQ ID NO.：159-SEQ ID NO.：160所示的序列。

其中，本发明所使用的EX Taq酶为市售的EX Taq酶试剂盒，其中包含了缓冲液、dNTP以及EX Taq酶等成分，在本发明的一个实施例中，采用的是例如Takara公司的EX Taq酶试剂盒。

1、五组引物对的配制

将所有引物按照表12所示的每组引物对的每对引物浓度配比进行配制：

表12.五组多重引物混合物中各条引物的浓度

发明人根据筛选获得的引物进行分组过程中，进行过大量的浓度配比试验，试验发现，除表12所示浓度以外，其它浓度配比均不能获得如图1所示的五组均具有多条明亮的条带，而是如图2所示的当每个引物浓度相同时，每组只有几条没有明确边界区分的条带。

2、向每组引物对配制EX Taq酶体系、通用引物以及扩增模板，其中，每组引物对与酶体系、通用引物、模板的浓度比例为：

3、使用试剂盒的反应条件：

采用如表13所示的温度转变PCR(temperature-switch PCR)的反应条件进行扩增：

表13反应条件

以下，结合具体的实施步骤进一步说明本发明的特点。

本发明采用中科院肿瘤医院保留的已知的5个核酸样本作为待测样本，分别为LR0、LR1、LR2、LR3、LR4，其相关信息如表14所示：

其中LR0为无大片段重组的样本，LR1、LR2、LR3、LR4为发生了大片段重组的已知阳性样本，经荧光定量PCR检测发现LR突变，并以长片段扩增技术验证。四个样本突变情况如下表14：

表14样本信息

样品编号	突变情况	DNA浓度(ng/μL)
			LR0	无突变	67.2
LR1	BRCA1第8至第9外显子区段缺失	43.5
			LR2	BRCA1第14至第21外显子区段缺失	20.9
LR3	BRCA2第1至第2外显子区段缺失	45.1
			LR4	BRCA1第14至第15外显子区段重复	63.2

实施例3 BRCA1和BRCA2基因检测

BRCA1和BRCA2的大片段重组突变表现为基因区段的缺失或重复，本发明通过从基因各区段上扩增特征片段，并分析特征片段含量变化的方式检测各区段是否存在大片段重组突变。

利用本发明提供的引物及方法对样本进行检测，具体方法如下：

1、目的片段的扩增

将5个核酸样本作为扩增模板，建立扩增反应体系，扩增目的基因片段：

并将上述反应体系按照以下反应条件进行多重PCR扩增，获得扩增产物：

第一阶段十个循环：95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s；

第二阶段十个循环：95℃ 30s、65℃ 30s、72℃ 30s；

第三阶段二十个循环：95℃ 30s、48℃ 30s、72℃ 30s。

将所得产物经琼脂糖凝胶电泳后，发现到每个样品均可以获得如图1所示的具有5组条带分明的电泳图，每组条带中的每个条带大小都不相同，每个条带大小均在180至500bp的范围内。

可见，本发明提供的引物组中52对引物都具有非常好的特异性，可以与模板不同位置的外显子特异性结合，获得不同大小的扩增产物，从而反映BRCA1和BRCA2基因的所有外显子所在区段的信息。

其中，扩增产物所扩增的位置及分布如图3所示，图中，圆点表示扩增产物。

2.扩增产物片段分析

取扩增产物1μL，与0.5μL LIZ-500及8.5μL去离子甲酰胺混合后，95℃变性3分钟，冰浴2分钟，放置在3730xl DNA分析仪上进行毛细管电泳分析，获得生成.FSA文件的电泳分析数据。

3.数据分析

将得到的分析数据导入GeneMapper软件进行DNA片段分析，获得峰高信息。

将各组片段的峰高分别进行归一化，使总峰高为1，每个片段的相对含量为此片段峰高占总峰高的比例，然后参照已知野生型样本的峰高值，将每个样本的5组片段分别进行归一化，获得表15所示的峰高相对含量值，以及如图3所示的各扩增片段相对含量对比图，当归一化之后的值小于0.75判断为缺失，大于1.3判断为重复。

表15峰高相对含量值

根据表15的数据可以得到如表16的判断结果：

表16判断结果：

由于本发明的引物可以准确的扩增出BRCA1和BRCA2基因上所有外显子所在区域的特征片段，因此本发明的引物及方法不但可以准确检测出大片段重组，而且成本低廉，检测结果可以经过直观的判断得出。

需要说明的是，本发明将引物组合应用于BRCA1和BRCA2大片段重组的检测，虽然在某些情况下，对这些基因的检测对于相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的辅助意义，但这些突变不是必然导致所述疾病的发生，因此对这些基因的检测并不一定涉及疾病的诊断或治疗方法。

Claims

1.一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：

从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的多对引物中获得五组引物；

其中，所述五组引物为：

如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20所示序列的第一组引物；

如SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.44所示序列的第二组引物；

如SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.64所示序列的第三组引物；

如SEQ ID NO.65-SEQ ID NO.84所示序列的第四组引物；

如SEQ ID NO.85-SEQ ID NO.104所示序列的第五组引物；

其中，每组引物中从第一个序列开始，每相邻的两个序列为一对互为上下游的引物；

其中，所述五组引物是根据混合所述多对引物对BRCA1和BRCA2基因进行多重PCR扩增，并根据扩增片段长度差异及其在BRCA1和BRCA2基因上的分布优化；

其中，所述五组引物中，每组引物中的每对引物所扩增的扩增产物长度均不相同，且每个扩增产物均对应BRCA1和BRCA2基因上的至少一个外显子区域，从而通过检测扩增产物的峰高即可获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述五组引物中的每一个引物上均嵌有低退火温度的通用引物序列。

3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述通用引物序列如SEQ ID NO.105-SEQ IDNO.106所示。

4.一种应用权利要求1所述的引物组合去检测非诊断目的的BRCA1和BRCA2基因大片段重组的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1所述的引物组合中的每组引物分别对待测样本进行多重PCR处理，获得每组均有多个有明显长度差异的BRCA1和BRCA2基因的扩增产物的五组产物；

根据所获得的每组中的多个有明显长度差异的BRCA1和BRCA2基因的扩增产物的峰高，获得BRCA1和BRCA2基因大片段重组的信息；

其中，所述权利要求1所述的引物组合通过以下方式获得：

根据所得到多个扩增片段长度，对所述多对引物进行分组，使每组引物中的所有引物对分别对应于不同长度的扩增片段，从而得到五组引物。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述利用五组引物对待测样本进行多重PCR处理时还使用了低退火温度的通用引物，如SEQ ID NO.105-SEQ ID NO.106所示。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述通用引物的5’端具有荧光修饰。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多重PCR处理包括三个阶段，其中，第二个阶段的退火温度均高于第一阶段及第三阶段的退火温度，第一阶段的循环数低于第三阶段的循环数。

8.一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合；

其中，所述引物组合中的每组引物包含多对引物，每对引物的浓度不完全相同。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，其还包括用于配合所述引物组合的通用引物，所述通用引物序列如SEQ ID NO.105-SEQ ID NO.106所示。