CN105483262B - 一种基于高通量测序的10个str位点的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于高通量测序的10个STR位点的检测试剂盒。该试剂盒可同时扩增的10个基因座，具体为：D1S1656、D3S1358、D5S818、D6S477、D18S535、D19S433、DYS393、DYS460、DYS570和Amel。

Description

一种基于高通量测序的10个STR位点的检测试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于高通量测序的10个STR位点的检测试剂盒。

背景技术

重复系列是真核基因组序列的重要组成部分，目前作为遗传标记的序列都属于基因组的重复区，在众多的重复序列中,短串联重复(STR)是目前被广泛应用的遗传标记，尤其是在法医学领域。STR是由2-6bp的核酸序列组成的串联重复单元组成，其长度一般在几十到几百的碱基之间。STR在整个人类基因组中分布非常广泛，平均10000个碱基就会出现一个STR。STR序列短，易于扩增，对于两个等位基因之间没有差异扩增存在，因此适用于微量和降解检材，由于其在不同个体中的高度多态性，能够有效识别不同的人类个体。

传统STR检验基于毛细管电泳技术根据电泳后片段大小的多态性进行分型，存在很大的局限性。一是所含信息量有限，对于混合样本检验，复杂亲缘关系检验等无法准确区分。二是无法解决STR内部的变异情况，比如有些重复单元发生了突变，仅通过电泳无法区分。三是传统的STR检验技术只能通过DNA分子的荧光强度判断分型，只能做到定性分析，无法准确的定量。

基于二代测序进行STR分析相比传毛细管STR检测平台具有显著优势：第一，毛细管电泳仅区分等位基因的片段大小，核苷酸数量相等的所有等位基因被认为是同一个等位基因；二代测序技术可明辨DNA序列，展示出STR等位基因重复单元和侧翼序列的真实差异。第二，二代测序对降解检材进行STR分析具有优势。毛细管电泳采用多色荧光复合扩增技术，为在各色荧光中安置更多的基因座，设计引物时经常有意保留较长的侧翼序列，导致扩增效率降低，不利于降解检材分型。利用二代测序技术进行STR分型，各基因座片段长度完全可以重叠在小片段区域且互不干扰，相当于将更多的常规STR基因座作为Mini-STR基因座使用，对降解检材分型效果自然更好。第三，基于二代测序的STR分型在现有数据输出方式基础上，允许进一步关注STR的序列多态性，对STR基因座进行精细化分型，显著提升STR基因座的个体识别能力。由于目前新一代测序技术(NGS)已经广泛应用于基因组测序的各个领域，基于新一代测序技术的优势，开发基于NGS的STR法医试剂盒将比传统的试剂盒更有优势。

发明内容

本发明的一个目的是一种基于高通量测序的10个STR位点的检测试剂盒，该试剂盒可同时扩增的10个基因座为：D1S1656、D3S1358、D5S818、D6S477、D18S535、D19S433、DYS393、DYS460、DYS570和Amel。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒包含扩增基因座的引物，具体如下：

在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒还包含FastStart DNA PolymerasePCR buffer(Roche)，dNTP(Roche)，FastStart DNA Polymerase(Roche)和BSA。

本发明所述检测试剂盒可以检测多种人体DNA样本，例如源于人血液、唾液、毛发或精斑等DNA样本。

根据对中国人群具有高度遗传多态性和良好的等位基因频率分布分析，本发明检测试剂盒选择D1S1656、D3S1358、D5S818、D6S477、D18S535、D19S433、DYS393、DYS460、DYS570和Amel共10个STR基因座进行扩增，其中Amel为性别鉴定基因座。通过分析，特别是D6S477、D18S535和DYS460基因座在中国人群中遗传多态性远高于其他STR试剂盒所选择的基因座，提高了整个试剂盒的个体识别能力，非常适合在中国人群的个体识别鉴定中应用。

在检测DNA样本时，本发明试剂盒的具体扩增体系如下：

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的检测方法，所述检测方法仅用于个体鉴别；具体步骤如下：

1)取人源DNA样本，加入到所述试剂盒中进行PCR混合扩增，扩增程序如下：95℃变性5min；94℃变性30s；60℃退火1min；70℃延伸1min；60℃最后延伸60min；共28个循环；

2)用磁珠纯化上述PCR产物，洗脱；

3)建DNA文库并定量；

4)Miseq测序，软件分析结果。

本发明提供一种利用新一代MiSeq测序技术对人类的10个STR位点进行高通量测序的试剂盒，包括扩增体系，测序的读长的统计，以及测序结果分析最终提供每个STR点的分型结果。本发明利用了新一代的MiSeq测序技术对STR进行测序，相比于传统的毛细管电泳，此技术能够提供更深的覆盖，能够分辨出STR内部的碱基突变情况，另外的一个优点是可以将不同的引物进行混合扩增，一次性得到所有STR的扩增产物，然后进行测序。另一个优势是此发明不依赖于测序仪进行最终的STR分型，只需要将测序的原始读长和每个STR的标准ladder分型通过生物信息学手段进行比较，即可确定最终的分型结果。

附图说明

图1：实施例1检测DNA样本结果。

具体实施方式

下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1

本发明试剂盒组成：

引物混合物组成如下：

检测方法：

1)取人源DNA样本1ng/μl，加入到所述试剂盒中进行PCR混合扩增，扩增程序如下：95℃变性5min；94℃变性30s；60℃退火1min；70℃延伸1min；60℃最后延伸60min；共28个循环；

2)用0.9×SPRI磁珠纯化上述PCR产物，20μl洗脱。Qubit定量浓度。

3)用KAPA Hyper Prep Kit试剂盒建库，建库起始模板定量5ng。

4)用KAPA Library Quantification Kit文库定量。

5)用MiSeq测序，150SE 10M reads。

6)Miseq测序数据统计，采用Miseq 2x150bp的pair-end双末端测序，测序后的原始读长序列分为正向读长和反向的读长，通过FLASH软件将正反向的读长序列进行合并，合并的参数是100％的相似性，两端至少重叠10bp，命令为

./flash--max-mismatch-density＝0str_1.fastq str_2.fastq

数据结果如下：原始结果一共有215,299对测序的读长，能够合并的读长为186,815对，占比86.7％。

7)利用STRait_razor软件2.0版本对9个STR基因座的分型进行统计，软件原始配置文件共包括88个STR位点的分型结果，但是并没有完全包含此次的9个位点，因此首先修改软件的配置文件，使配置文件中包含对9个STR基因座的分型统计，此文件定义为locus_config.txt，然后运行程序：./STRaitRazor.pl–dir OUT–fastq STRmerge.fastq-sampleNum one-typeselection ALL

9个STR得到分型的结果，分型结果如图1.此分型结果和样本自身的分型结果相同，证明通过Miseq测序可以得到预期的结果。

8)对于Amel位点，通过BLAST将测序的读长比对到模板序列，长度覆盖和比对的相似度都设定与95％。

实施例2

以D3S1358为例说明实施例1试剂盒引物筛选，本领域公知STR分型检测中，在扩增步骤的引物序列至关重要，合适的引物会极大地降低影子带的形成(即sutter带)。本发明的研发过程中对引物进行了大量筛选，从而得到实施例1中引物混合物。具体方法是设计不同引物对同一DNA样本的D3S1358基因座进行扩增，扩增体系及扩增条件参见实施例1；然后按照实施例1的方法对扩增产物进行分析，重复测定10次，具体结果如下：

	实施例1	对比例1	对比例2	对比例3
					影子带出现频率(次)	0	5	8	4

对比例1和对比例2除下表引物序列外，其他均同实施例1，具体引物序列如下：

对比例3为引物序列及检测方法与实施例1相同，区别仅在于PCR扩增体系中没有添加BSA。

需要说明的是，本发明对试剂盒中所有引物均进行了类似的筛选，在多次重复试验中，实施例1的引物组合物均无明显影子带形成，并且不存在引物二聚体，数据在此不一一列出。

实施例3

对来自10个家庭的父母和子女分别进行STR分析，检测试剂盒和检测方法参见实施例1；结果表明：上述STR位点均符合孟德尔遗传定律，RCP值均大于99.9999％。还需要说明的是，所检测的样本分别为唾液、头发和指甲，均得到了一致的分析结果。并且每个样本经PCR扩增和软件分析后均无影子峰出现。

实施例4

对50个自然人分别取其头发、唾液、血液、皮屑和指甲样本，按照实施例1的方法进行STR分析并进行个体鉴定，结果表明：来自同一人的不同样本均可以进行有效的PCR扩增，在同一扩增体系中，10个STR位点均可以有效扩增；来自同一个体的不同样本之间的偶合率低于1×10^-18。

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (2)

1.一种基于高通量测序的10个STR位点的检测试剂盒，其特征在于:

所述试剂盒可同时扩增的10个基因座为：D1S1656、D3S1358、D5S818、D6S477、D18S535、D19S433、DYS393、DYS460、DYS570和Amel；

所述试剂盒包含扩增基因座的引物，具体如下：

D1S1656正向：AGTCAGAGAAATAGAATCACTAGGG，

D1S1656反向：GCTGTGTTGCTCAAGGGTCAACTGCA；

D3S1358正向：GCTAATGATTCCCCCACTGCAGTCC，

D3S1358反向：ATGAAATCAACAGAGGCTTGCTTG；

D5S818正向：ACGGTGATTTTCCTCTTTGGTATCC，

D5S818反向：GTGCTTTTTAGCCAAGTGATTCCTG；

D6S477正向：CAGAGGTGAAATATTTGCAAAACAAT，

D6S477反向：CTCAAACAACCTCAACAACAACACGA；

D18S535正向：GCGTTTGCAAACTTCATGTGACAAA，

D18S535反向：GGCAGGCTAAGAGTTACCCATATG；

D19S433正向：AGGTGCGAATAAGATTCTGTTGAAG，

D19S433反向：CCGAATAAAAATCTTCTCTCTTTCTG；

DYS393正向：CAGTGGTCTTCTACTTGTGTCAATA，

DYS393反向：AACTCAAGTCCAAAAAATGAGGCG；

DYS460正向：GCAAGGAATCTGACACCTCTGACAT，

DYS460反向：ATCTATCCTCTGCCTATCATTTATTGT；

DYS570正向：TGATGAAACGTAAAATGAATGATGAC，

DYS570反向：GAAACCAGACAACTGGTGGCATG；

AMEL正向：GACCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG，

AMEL反向：CAGAGCTTAAACTGGGAAGCTGGT；

所述试剂盒还包含FastStartDNA PolymerasePCRbuffer，dNTP，FastStartDNAPolymerase和BSA；

所述试剂盒中，dNTP的浓度为0.2mM；每条引物的浓度为0.2mM，FastStartDNAPolymerase为1U，BSA的浓度为0.16mg/ml。

2.一种权利要求1所述试剂盒的检测方法，所述检测方法仅用于个体鉴别；具体步骤如下：

1)取人源DNA样本，加入到所述试剂盒中进行PCR混合扩增，扩增程序如下：95℃变性5min；94℃变性30s；60℃退火1min；70℃延伸1min；60℃最后延伸60min；共28个循环；

2)用磁珠纯化上述PCR产物，洗脱；

3)建DNA文库并定量；

4)Miseq测序，软件分析结果。