CN114164271B - 一种基于长片段pcr检测乳腺癌易感基因变异的引物对，试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的引物对，试剂盒及其方法。本发明通过设计特定的乳腺癌易感基因变异长片段PCR检测引物对，结合PCR反应和基因测序，实现了对乳腺癌易感基因变异的快速和低成本检测，检出率高达100%，特异性为100%，可以用于临床检测乳腺癌易感基因变异。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2变异的引物对，试剂盒及其应用。
背景技术
从世界卫生组织国际癌症研究机构公布的2020年全球最新癌症负担数据来看，被称为"粉红杀手"的乳腺癌新发病例高达226万例，超过了肺癌的220万例，成为全球第一大癌。在我国，乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，每年有30余万女性被诊断出乳腺癌，在东部沿海地区及经济发达的大城市，乳腺癌发病率上升尤其明显；从发病年龄来看，我国乳腺癌发病年龄呈现年轻化，从20岁以后开始逐渐上升，45～50岁达到高值。因此，乳腺癌的高发病率已经严重威胁我国女性健康。随着精准医疗和靶向治疗的进展，人们发现对乳腺癌患者血液或组织进行乳腺癌易感基因（BRCA1和BRCA2）突变检测有助于患者的预后和治疗。但是，由于BRCA1/2基因序列较长，变异形式多样，变异位点分散遍布于2个基因的全长，所以，除了BRCA基因编码区发生变异之外，其内含子也会发生变异。换句话说，要获得BRCA基因体细胞突变的准确信息，对 BRCA的检测必须同时覆盖编码区和相邻边界区，即尽可能获取完整的BRCA基因序列。但普通PCR只能扩增2-3kb的片段，而对于5kb以上的长片段基因很难有效的扩增。因此，非常有必要开发一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的方法及试剂盒，可以快速简单、低成本的完成乳腺癌易感基因BRCA1和 BRCA2变异的检测，有助于对乳腺癌易感基因相关的肿瘤预后进行风险评估，用药建议以及为数据库的建立提供基因检测技术支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2变异的引物对，试剂盒及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种可以长片段PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的引物对，包括如下核酸序列：
(1) 长片段扩增BRCA1的上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 1/SEQ ID2，SEQ ID 3/ SEQ ID 4，SEQ ID 5/SEQ ID 6，SEQ ID 7/ SEQ ID 8，SEQ ID 9/SEQ ID 10，SEQ ID 11/SEQ ID 12，SEQ ID 13/SEQ ID 14，SEQ ID 15/SEQ ID 16和SEQ ID 17/SEQ ID18所示；
(2) 长片段扩增BRCA2的上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 19/SEQ ID20，SEQ ID 21/ SEQ ID 22，SEQ ID 23/SEQ ID 24，SEQ ID 25/ SEQ ID 26，SEQ ID 27/SEQ ID 28，SEQ ID 29/SEQ ID 30，SEQ ID 31/SEQ ID 32，SEQ ID 33/SEQ ID 34和SEQ ID35/SEQ ID 36所示；
(3) 使用具有S1所述核苷酸序列SEQ ID 1/SEQ ID 2，SEQ ID 5/SEQ ID 6 , SEQID 15和SEQ ID 16的所示引物对混合物，或具有S1所述核苷酸序列SEQ ID 3/ SEQ ID 4，SEQ ID 7/ SEQ ID 8，SEQ ID 9/SEQ ID 10和SEQ ID 11/SEQ ID 12的所示引物对混合物，或具有S1所述核苷酸序列SEQ ID 13/SEQ ID 14和SEQ ID 17/SEQ ID 18的所示引物对混合物，检测乳腺癌易感基因BRCA1；
(4) 使用具有S2所述核苷酸序列SEQ ID 19/ SEQ ID 20，SEQ ID 23/SEQ ID 24，SEQ ID 27/SEQ ID 28，SEQ ID 29/SEQ ID 30 , SEQ ID 31/SEQ ID 32和SEQ ID 35/SEQID 36的所示引物混合物，或具有S2所述核苷酸序列SEQ ID 21/SEQ ID 22 , SEQ ID 25/SEQ ID 26和SEQ ID 33/SEQ ID 34的所示引物对混合物，检测乳腺癌易感基因BRCA2。
上述一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2变异的引物对序列在本发明的保护范围之内。
本发明的另一种技术方案为：一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2变异的试剂盒，包含上述所示引物对SEQ ID 1/ SEQ ID 2，SEQ ID 3/ SEQ ID 4，SEQID 5/ SEQ ID 6，SEQ ID 7/SEQ ID 8，SEQ ID 9/ SEQ ID 10，SEQ ID 11/SEQ ID 12，SEQID13/SEQ ID 14，SEQ ID 15/ SEQ ID 16，SEQ ID 17/SEQ ID 18，SEQ ID 19/SEQ ID 20，SEQ ID 21/SEQ ID 22，SEQ ID 23/ SEQ ID 24，SEQ ID 25/SEQ ID 26，SEQ ID 27/SEQ ID28，SEQ ID 29/SEQ ID 30，SEQ ID 31/SEQ ID 32，SEQ ID 33/SEQ ID 34和SEQ ID 35/SEQID 36，长片段PCR扩增的缓冲液，长片段扩增酶，dNTP。
一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2变异的方法，包括如下步骤：(1)提取人外周血或新鲜组织基因组DNA；(2)以提取的人外周血或新鲜组织基因组DNA、质粒或病毒DNA或cDNA中的其中一种为模板、上述所示引物对SEQ ID 1/ SEQ ID 2，SEQ ID3/ SEQ ID 4，SEQ ID 5/ SEQ ID 6，SEQ ID 7/SEQ ID 8，SEQ ID 9/ SEQ ID 10，SEQ ID11/SEQ ID 12，SEQ ID13/SEQ ID 14，SEQ ID 15/ SEQ ID 16，SEQ ID 17/SEQ ID 18，SEQID 19/SEQ ID 20，SEQ ID 21/SEQ ID 22 , SEQ ID 23/ SEQ ID 24，SEQ ID 25/ SEQ ID26，SEQ ID 27/SEQ ID 28，SEQ ID 29/SEQ ID 30 , SEQ ID 31/SEQ ID 32，SEQ ID 33/SEQ ID 34和SEQ ID 35/SEQ ID 36中合适的混合引物对，长片段PCR扩增缓冲液，长片段扩增酶，dNTP，进行乳腺癌易感基因BRCA1和 BRCA2的长片段PCR扩增反应；(3) 采用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，判定长片段PCR扩增是否成功；（4）对步骤(3)中纯化后的长片段PCR扩增产物依次进行DNA片段化/末端修复/dA尾添加，接头连接，接头产物纯化，文库扩增，文库扩增产物纯化，文库质控，上机测序和对测序结果进行分析。
作为优选，所述步骤(2)中，BRCA1的9个长片段PCR扩增和BRCA2的9个长片段PCR扩增，每个扩增的体系为：总体积50微升，包含1微升Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13，SEQ ID 15，SEQ ID 17，SEQ ID 19，SEQ ID 21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31，SEQ ID33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2 ，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQ ID 8，SEQ ID 10，SEQ ID 12，SEQ ID 14，SEQ ID 16，SEQ ID 18，SEQ ID 20，SEQ ID22，SEQ ID 24，SEQ ID 26，SEQ ID 28，SEQ ID 30，SEQ ID 32，SEQ ID 34，SEQ ID 36)，适量的合适模板DNA及去离子水。
作为又以优选，所述步骤(2)中，基因组DNA，质粒或病毒DNA或cDNA模板的量分别为50-400纳克，10皮克-30纳克及1-5微升。
作为又以优选，所述步骤(2)中，长片段PCR的扩增程序为：在95摄氏度下预变性合适时间；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为25-35；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
作为又以优选，所述步骤(2)中，所述基因组DNA，质粒或病毒DNA及cDNA的预变性时间分别为3分钟，30秒及3分钟。
作为优选，所述步骤(4)中，DNA片段化/末端修复/dA尾添加反应体系的配制程序为：取步骤3中50纳克纯化的PCR扩增产物进行等摩尔混合，然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。
作为又以优选，所述步骤(4)中，DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置。
作为优选，所述步骤(4)中，接头连接反应的程序为：在DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应完成后的反应体系中，依次加入2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升Quick T4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，然后置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。最后将反应体系在4摄氏度进行放置。
作为优选，所述步骤(4)中，接头产物纯化反应的程序为：依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤对所述接头产物进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
作为优选，所述步骤(4)中，文库扩增反应的程序为：将纯化后的接头产物与25微升2×Super Canace® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。
作为又以优选，所述步骤(4)中，文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置。
作为优选，所述步骤(4)中，文库扩增产物纯化的程序为：将获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
本发明的积极效果如下：
本发明提供了一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的试剂盒，可以促进乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2变异的检测高效完成。此外，相比于国内已上市艾德生物（维汝健）的人类BRCA1基因和BRCA2基因突变检测试剂盒而言，本发明试剂盒的检测样本范围从外周血拓展到了新鲜组织样本，可以更有效地完成乳腺癌易感基因BRCA1和 BRCA2变异的检测，有助于对乳腺癌易感基因相关的肿瘤预后进行风险评估，用药建议以及为数据库的建立提供基因检测技术支持，同时可以为病患和医院带来临床检测收益。
附图说明
图1 实施例1中BRCA1和BRCA2扩增结果琼脂糖凝胶电泳图：M为DL 15000 DNAmarker；1-5分别对应引物池1-5所扩增出来的长片段产物。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
步骤1：DNA提取
取200微升外周血，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自天根生化科技（北京）有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1) 将核苷酸序列SEQ ID 1-36所示的BRCA1和BRCA2上下游引物对按照混合比例预先混合好；
(2)在PCR管中，配制如下反应体系：
总体积50微升，包含1微升Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13，SEQ ID 15，SEQ ID 17，SEQ ID 19，SEQ ID21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31，SEQ ID 33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2 , SEQ ID 4 , SEQ ID 6 , SEQ ID 8 ,SEQ ID 10 , SEQ ID 12 , SEQ ID 14 , SEQ ID 16 , SEQ ID 18 , SEQ ID 20 , SEQID 22 , SEQ ID 24 , SEQ ID 26 , SEQ ID 28 , SEQ ID 30 , SEQ ID 32 , SEQ ID 34, SEQ ID 36)，50纳克基因组DNA，去离子水补足体积至50微升。PCR反应中的扩增程序依次为：在95摄氏度下预变性3分钟；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为25；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
步骤3：琼脂糖凝胶电泳检测并纯化
反应结束后，如附图1所示，采用琼脂糖凝胶电泳检测，判定PCR扩增是否成功。对扩增成功的PCR产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及30微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的PCR产物浓度。
步骤4：DNA片段化/末端修复/dA尾添加
取步骤3中纯化的PCR产物进行等摩尔混合，总量为50纳克。然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤5的后续实验。
步骤5：接头连接
在步骤4中获得的用于步骤5后续实验的反应体系中，依次加入购自翌圣生物科技（上海）有限公司的Hieff NGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 试剂盒中的2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升QuickT4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤6的后续实验。
步骤6：接头产物的纯化
在步骤5中获得的用于步骤6后续实验反应体系中的接头产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
步骤7：文库扩增
取23微升步骤6中纯化的接头产物，与购自翌圣生物科技（上海）有限公司的HieffNGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 配套试剂盒中的25微升2×SuperCanace ® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤8的后续实验。
步骤8：文库扩增产物的纯化
将步骤8获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
步骤9：上机测序
通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。
步骤10：数据分析
采用生物信息软件对测序结果进行分析。
实施例2
步骤1：DNA提取
取200微升外周血，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自天根生化科技（北京）有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1) 将核苷酸序列SEQ ID 01-36所示的BRCA1和BRCA2上下游引物对按照混合比例预先混合好；
(2)在PCR管中，配制如下反应体系：
总体积50微升，包含1微升Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13，SEQ ID 15，SEQ ID 17，SEQ ID 19，SEQ ID21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31，SEQ ID 33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQ ID 8，SEQ ID 10，SEQ ID 12，SEQ ID 14，SEQ ID 16，SEQ ID 18，SEQ ID 20，SEQ ID 22，SEQ ID 24，SEQ ID26，SEQ ID 28，SEQ ID 30，SEQ ID 32，SEQ ID 34，SEQ ID 36)，50纳克基因组DNA，去离子水补足体积至50微升。PCR反应中的扩增程序依次为：在95摄氏度下预变性3分钟；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为27；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
步骤3：琼脂糖凝胶电泳检测并纯化
反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测，判定PCR扩增是否成功。对扩增成功的PCR产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及30微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的PCR产物浓度。
步骤4：DNA 片段化/末端修复/dA尾添加
取步骤3中纯化的PCR产物进行等摩尔混合，总量为50纳克。然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤5的后续实验。
步骤5：接头连接
在步骤4中获得的用于步骤5后续实验的反应体系中，依次加入购自翌圣生物科技（上海）有限公司的Hieff NGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 试剂盒中的2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升QuickT4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤6的后续实验。
步骤6：接头产物的纯化
在步骤5中获得的用于步骤6后续实验反应体系中的接头产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
步骤7：文库扩增
取23微升步骤6中纯化的接头产物，与购自翌圣生物科技（上海）有限公司的HieffNGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 配套试剂盒中的25微升2×SuperCanace ® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤8的后续实验。
步骤8：文库扩增产物的纯化
将步骤8获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
步骤9：上机测序
通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。
步骤10：数据分析
采用生物信息软件对测序结果进行分析。
实施例3
步骤1：DNA提取
取适量组织，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自天根生化科技（北京）有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1) 将核苷酸序列SEQ ID 01-36所示的BRCA1和BRCA2上下游引物对按照混合比例预先混合好； (2)在PCR管中，配制如下反应体系： 总体积50微升，包含1微升Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13，SEQID 15，SEQ ID 17，SEQ ID 19，SEQ ID 21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31，SEQ ID 33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2，SEQID 4，SEQ ID 6，SEQ ID 8，SEQ ID 10，SEQ ID 12，SEQ ID 14，SEQ ID 16，SEQ ID 18，SEQID 20，SEQ ID 22，SEQ ID 24，SEQ ID 26，SEQ ID 28，SEQ ID 30，SEQ ID 32，SEQ ID 34，SEQ ID 36)，50纳克基因组DNA，去离子水补足体积至50微升。PCR反应中的扩增程序依次为：在95摄氏度下预变性3分钟；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为29；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
步骤3：琼脂糖凝胶电泳检测并纯化
反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测，判定PCR扩增是否成功。对扩增成功的PCR产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及30微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的PCR产物浓度。
步骤4：DNA 片段化/末端修复/dA尾添加
取步骤3中纯化的PCR产物进行等摩尔混合，总量为50纳克。然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤5的后续实验。
步骤5：接头连接
在步骤4中获得的用于步骤5后续实验的反应体系中，依次加入购自翌圣生物科技（上海）有限公司的Hieff NGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 试剂盒中的2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升QuickT4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤6的后续实验。
步骤6：接头产物的纯化
在步骤5中获得的用于步骤6后续实验反应体系中的接头产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
步骤7：文库扩增
取23微升步骤6中纯化的接头产物，与购自翌圣生物科技（上海）有限公司的HieffNGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 配套试剂盒中的25微升2×SuperCanace ® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤8的后续实验。
步骤8：文库扩增产物的纯化
将步骤8获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
步骤9：上机测序
通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。
步骤10：数据分析
采用生物信息软件对测序结果进行分析。
实施例4
步骤1：DNA提取
取适量组织，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自天根生化科技（北京）有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1) 将核苷酸序列SEQ ID 01-36所示的BRCA1和BRCA2上下游引物对按照混合比例预先混合好；
(2)在PCR管中，配制如下反应体系：
总体积50微升，包含1微升Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7 ，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13， SEQ ID 15，SEQ ID 17，SEQ ID 19，SEQ ID21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31 ，SEQ ID 33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQ ID 8，SEQ ID10，SEQ ID 12，SEQ ID 14，SEQ ID 16，SEQ ID 18，SEQ ID 20，SEQ ID 22，SEQ ID 24，SEQID 26，SEQ ID 28，SEQ ID 30，SEQ ID 32，SEQ ID 34，SEQ ID 36)，50纳克基因组DNA，去离子水补足体积至50微升。PCR反应中的扩增程序依次为：在95摄氏度下预变性3分钟；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为31；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
步骤3：琼脂糖凝胶电泳检测并纯化
反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测，判定PCR扩增是否成功。对扩增成功的PCR产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及30微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的PCR产物浓度。
步骤4：DNA 片段化/末端修复/dA尾添加
取步骤3中纯化的PCR产物进行等摩尔混合，总量为50纳克。然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤5的后续实验。
步骤5：接头连接
在步骤4中获得的用于步骤5后续实验的反应体系中，依次加入购自翌圣生物科技（上海）有限公司的Hieff NGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 试剂盒中的2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升QuickT4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤6的后续实验。
步骤6：接头产物的纯化
在步骤5中获得的用于步骤6后续实验反应体系中的接头产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
步骤7：文库扩增
取23微升步骤6中纯化的接头产物，与购自翌圣生物科技（上海）有限公司的HieffNGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 配套试剂盒中的25微升2×SuperCanace ® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤8的后续实验。
步骤8：文库扩增产物的纯化
将步骤8获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
步骤9：上机测序
通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。
步骤10：数据分析
采用生物信息软件对测序结果进行分析。
实施例5
步骤1：DNA提取
取200微升外周血，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自天根生化科技（北京）有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1) 将核苷酸序列SEQ ID 01-36所示的BRCA1和BRCA2上下游引物对按照混合比例预先混合好；
(2)在PCR管中，配制如下反应体系：
总体积50微升，包含1微升Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13，SEQ ID 15， SEQ ID 17，SEQ ID 19， SEQ ID21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31，SEQ ID 33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQ ID 8，SEQ ID 10，SEQ ID 12，SEQ ID 14，SEQ ID 16，SEQ ID 18，SEQ ID 20 ，SEQ ID 22，SEQ ID 24，SEQ ID26，SEQ ID 28，SEQ ID 30，SEQ ID 32，SEQ ID 34，SEQ ID 36)，50纳克基因组DNA，去离子水补足体积至50微升。PCR反应中的扩增程序依次为：在95摄氏度下预变性3分钟；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为33；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
步骤3：琼脂糖凝胶电泳检测并纯化
反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测，判定PCR扩增是否成功。对扩增成功的PCR产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及30微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的PCR产物浓度。
步骤4：DNA 片段化/末端修复/dA尾添加
取步骤3中纯化的PCR产物进行等摩尔混合，总量为50纳克。然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤5的后续实验。
步骤5：接头连接
在步骤4中获得的用于步骤5后续实验的反应体系中，依次加入购自翌圣生物科技（上海）有限公司的Hieff NGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 试剂盒中的2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升QuickT4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤6的后续实验。
步骤6：接头产物的纯化
在步骤5中获得的用于步骤6后续实验反应体系中的接头产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
步骤7：文库扩增
取23微升步骤6中纯化的接头产物，与购自翌圣生物科技（上海）有限公司的HieffNGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 配套试剂盒中的25微升2×SuperCanace ® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤8的后续实验。
步骤8：文库扩增产物的纯化
将步骤8获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
步骤9：上机测序
通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。
步骤10：数据分析
采用生物信息软件对测序结果进行分析。
实施例6
步骤1：DNA提取
取适量组织，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自天根生化科技（北京）有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1)将核苷酸序列SEQ ID 01-36所示的BRCA1和BRCA2上下游引物对按照混合比例预先混合好；
(2)在PCR管中，配制如下反应体系：
总体积50微升，包含1微升Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13，SEQ ID 15，SEQ ID 17，SEQ ID 19，SEQ ID21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31，SEQ ID 33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQ ID 8，SEQ ID 10，SEQ ID 12，SEQ ID 14，SEQ ID 16，SEQ ID 18，SEQ ID 20，SEQ ID 22，SEQ ID 24，SEQ ID26，SEQ ID 28，SEQ ID 30，SEQ ID 32，SEQ ID 34，SEQ ID 36)，50纳克基因组DNA，去离子水补足体积至50微升。PCR反应中的扩增程序依次为：在95摄氏度下预变性3分钟；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为35；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
步骤3：琼脂糖凝胶电泳检测并纯化
反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测，判定PCR扩增是否成功。对扩增成功的PCR产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及30微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的PCR产物浓度。
步骤4：DNA 片段化/末端修复/dA尾添加
取步骤3中纯化的PCR产物进行等摩尔混合，总量为50纳克。然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤5的后续实验。
步骤5：接头连接
在步骤4中获得的用于步骤5后续实验的反应体系中，依次加入购自翌圣生物科技（上海）有限公司的Hieff NGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 试剂盒中的2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升QuickT4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤6的后续实验。
步骤6：接头产物的纯化
在步骤5中获得的用于步骤6后续实验反应体系中的接头产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
步骤7：文库扩增
取23微升步骤6中纯化的接头产物，与购自翌圣生物科技（上海）有限公司的HieffNGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 配套试剂盒中的25微升2×SuperCanace ® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤8的后续实验。
步骤8：文库扩增产物的纯化
将步骤8获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
步骤9：上机测序
通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。
步骤10：数据分析
采用生物信息软件对测序结果进行分析。
实施例7 临床样品1的检测
步骤1：DNA提取
取200微升外周血，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自天根生化科技（北京）有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1) 将核苷酸序列SEQ ID 01-36所示的BRCA1和BRCA2上下游引物对按照混合比例预先混合好；
(2)在PCR管中，配制如下反应体系：
总体积50微升，包含1微升Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13，SEQ ID 15，SEQ ID 17，SEQ ID 19，SEQ ID21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31，SEQ ID 33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQ ID 8，SEQ ID 10，SEQ ID 12，SEQ ID 14，SEQ ID 16，SEQ ID 18，SEQ ID 20，SEQ ID 22，SEQ ID 24，SEQ ID26，SEQ ID 28，SEQ ID 30，SEQ ID 32，SEQ ID 34，SEQ ID 36)，50纳克基因组DNA，去离子水补足体积至50微升。PCR反应中的扩增程序依次为：在95摄氏度下预变性3分钟；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为26；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
步骤3：琼脂糖凝胶电泳检测并纯化
反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测，判定PCR扩增是否成功。对扩增成功的PCR产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及30微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的PCR产物浓度。
步骤4：DNA 片段化/末端修复/dA尾添加
取步骤3中纯化的PCR产物进行等摩尔混合，总量为50纳克。然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤5的后续实验。
步骤5：接头连接
在步骤4中获得的用于步骤5后续实验的反应体系中，依次加入购自翌圣生物科技（上海）有限公司的Hieff NGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 试剂盒中的2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升QuickT4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤6的后续实验。
步骤6：接头产物的纯化
在步骤5中获得的用于步骤6后续实验反应体系中的接头产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
步骤7：文库扩增
取23微升步骤6中纯化的接头产物，与购自翌圣生物科技（上海）有限公司的HieffNGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 配套试剂盒中的25微升2×SuperCanace ® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤8的后续实验。
步骤8：文库扩增产物的纯化
将步骤8获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
步骤9：上机测序
通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。
步骤10：数据分析
采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。
实施例8 临床样品2的检测
步骤1：DNA提取
取适量组织，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自天根生化科技（北京）有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1) 将核苷酸序列SEQ ID 01-36所示的BRCA1和BRCA2上下游引物对按照混合比例预先混合好；
(2)在PCR管中，配制如下反应体系：
总体积50微升，包含1微升Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13，SEQ ID 15，SEQ ID 17，SEQ ID 19，SEQ ID21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31，SEQ ID 33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQ ID 8，SEQ ID 10，SEQ ID 12，SEQ ID 14，SEQ ID 16，SEQ ID 18，SEQ ID 20，SEQ ID 22，SEQ ID 24，SEQ ID26，SEQ ID 28，SEQ ID 30，SEQ ID 32，SEQ ID 34，SEQ ID 36)，50纳克基因组DNA，去离子水补足体积至50微升。PCR反应中的扩增程序依次为：在95摄氏度下预变性3分钟；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为26；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
步骤3：琼脂糖凝胶电泳检测并纯化
反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测，判定PCR扩增是否成功。对扩增成功的PCR产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及30微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的PCR产物浓度。
步骤4：DNA 片段化/末端修复/dA尾添加
取步骤3中纯化的PCR产物进行等摩尔混合，总量为50纳克。然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤5的后续实验。
步骤5：接头连接
在步骤4中获得的用于步骤5后续实验的反应体系中，依次加入购自翌圣生物科技（上海）有限公司的Hieff NGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 试剂盒中的2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升QuickT4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤6的后续实验。
步骤6：接头产物的纯化
在步骤5中获得的用于步骤6后续实验反应体系中的接头产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
步骤7：文库扩增
取23微升步骤6中纯化的接头产物，与购自翌圣生物科技（上海）有限公司的HieffNGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 配套试剂盒中的25微升2×SuperCanace ® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤8的后续实验。
步骤8：文库扩增产物的纯化
将步骤8获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
步骤9：上机测序
通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。
步骤10：数据分析
采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。
实施例9 临床样品3的检测
步骤1：DNA提取
取200微升外周血，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自天根生化科技（北京）有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1) 将核苷酸序列SEQ ID 01-36所示的BRCA1和BRCA2上下游引物对按照混合比例预先混合好；
(2)在PCR管中，配制如下反应体系：
总体积50微升，包含1微升Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13，SEQ ID 15，SEQ ID 17，SEQ ID 19，SEQ ID21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31，SEQ ID 33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQ ID 8，SEQ ID 10，SEQ ID 12，SEQ ID 14，SEQ ID 16，SEQ ID 18，SEQ ID 20，SEQ ID 22，SEQ ID 24，SEQ ID26，SEQ ID 28，SEQ ID 30，SEQ ID 32，SEQ ID 34，SEQ ID 36)，50纳克基因组DNA，去离子水补足体积至50微升。PCR反应中的扩增程序依次为：在95摄氏度下预变性3分钟；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为30；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
步骤3：琼脂糖凝胶电泳检测并纯化
反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测，判定PCR扩增是否成功。对扩增成功的PCR产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及30微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的PCR产物浓度。
步骤4：DNA片段化/末端修复/dA尾添加
取步骤3中纯化的PCR产物进行等摩尔混合，总量为50纳克。然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤5的后续实验。
步骤5：接头连接
在步骤4中获得的用于步骤5后续实验的反应体系中，依次加入购自翌圣生物科技（上海）有限公司的Hieff NGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 试剂盒中的2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升QuickT4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤6的后续实验。
步骤6：接头产物的纯化
在步骤5中获得的用于步骤6后续实验反应体系中的接头产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
步骤7：文库扩增
取23微升步骤6中纯化的接头产物，与购自翌圣生物科技（上海）有限公司的HieffNGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 配套试剂盒中的25微升2×SuperCanace ® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤8的后续实验。
步骤8：文库扩增产物的纯化
将步骤8获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
步骤9：上机测序
通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。
步骤10：数据分析
采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。
实施例10 临床样品4的检测
步骤1：DNA提取
取适量组织，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自天根生化科技（北京）有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：PCR扩增和检测
(1)将核苷酸序列SEQ ID 01-36所示的BRCA1和BRCA2上下游引物对按照混合比例预先混合好；
(2)在PCR管中，配制如下反应体系：
总体积50微升，包含1微升Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，25微升浓度为2毫摩尔每升的2×Phanta Max Buffer，1微升浓度为10毫摩尔每升的dNTP Mix，1微升2%二甲基亚砜，2微升浓度为10毫摩尔每升的上游引物(SEQ ID 1，SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQ ID 7，SEQ ID 9，SEQ ID 11，SEQ ID 13，SEQ ID 15，SEQ ID 17，SEQ ID 19，SEQ ID21，SEQ ID 23，SEQ ID 25，SEQ ID 27，SEQ ID 29，SEQ ID 31，SEQ ID 33，SEQ ID 35)，2微升浓度为10毫摩尔每升的下游引物(SEQ ID 2，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQ ID 8，SEQ ID 10，SEQ ID 12，SEQ ID 14，SEQ ID 16，SEQ ID 18，SEQ ID 20，SEQ ID 22，SEQ ID 24，SEQ ID26，SEQ ID 28，SEQ ID 30，SEQ ID 32，SEQ ID 34，SEQ ID 36)，50纳克基因组DNA，去离子水补足体积至50微升。PCR反应中的扩增程序依次为：在95摄氏度下预变性3分钟；在95摄氏度变性15秒；在62.5摄氏度退火15秒，循环数为32；在72摄氏度延伸5分钟；在72摄氏度彻底延伸10分钟。
步骤3：琼脂糖凝胶电泳检测并纯化
反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测，判定PCR扩增是否成功。对扩增成功的PCR产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及30微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的PCR产物浓度。
步骤4：DNA 片段化/末端修复/dA尾添加
取步骤3中纯化的PCR产物进行等摩尔混合，总量为50纳克。然后加入5微升片段化/末端修复/A尾添加模块试剂和适量双蒸水进行混合，使混合液的最终体积为30微升。DNA片段化、末端修复以及dA尾添加反应的程序依次为：在4摄氏度反应3分钟，循环数为1；在30摄氏度反应20分钟，循环数为1；在72摄氏度反应20分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤5的后续实验。
步骤5：接头连接
在步骤4中获得的用于步骤5后续实验的反应体系中，依次加入购自翌圣生物科技（上海）有限公司的Hieff NGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 试剂盒中的2.5微升浓度为4微摩尔每升的Adapter，15微升Ligation Enhancer和2.5微升QuickT4 DNA Ligase，轻柔吸打混匀，置于热循环仪内20摄氏度反应15分钟。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤6的后续实验。
步骤6：接头产物的纯化
在步骤5中获得的用于步骤6后续实验反应体系中的接头产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇漂洗及25微升去离子水洗脱的步骤进行纯化，然后检测纯化后的接头产物浓度。
步骤7：文库扩增
取23微升步骤6中纯化的接头产物，与购自翌圣生物科技（上海）有限公司的HieffNGS ® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina ® 配套试剂盒中的25微升2×SuperCanace ® II High-Fidelity，1微升Primer I7和1微升Primer I5进行充分混匀，然后在PCR仪器中进行文库扩增。文库扩增程序依次为：在98摄氏度下反应1分钟，循环数为1；在98摄氏度反应15秒，61摄氏度反应30秒，72摄氏度反应30秒，循环数为7；在72摄氏度反应5分钟，循环数为1。然后将反应体系在4摄氏度进行放置，用于步骤8的后续实验。
步骤8：文库扩增产物的纯化
将步骤8获得的文库扩增产物依次通过Yeasen磁珠吸附，80%乙醇，30微升去离子水进行洗脱进行纯化，然后检测纯化后的文库扩增产物浓度。
步骤9：上机测序
通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。
步骤10：数据分析
采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。
实施例11 与商用乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒比较
本发明实例1-10中的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测结果与商用乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒的检测结果非常一致，但本发明相比商用乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒检测样本的时间缩短了30分钟，大大提高了检测效率。此外，本发明相比商用乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒，把样本检出率提高到了100%。
实施例12 本发明试剂盒检测标样的情况
将实施例1-10中所述的引物对组合，长片段PCR扩增的缓冲液，长片段扩增酶，dNTP反应体系，与内部质控和阳性质控进行组合，分别构建10个乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒，用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2标准样品检测。结果表明所构建得10个乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒均能准确地检出乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2标准样品，检出率和特异性分别为100%。
实施例13 本发明试剂盒检测样本的情况
将实施例12中所构建的10个乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒对所采集的外周血和组织等样本进行检测，结果表明实施例12中所构建的10个乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒检测地结果均能准确地反应样本中乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的情况。与商品化乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒比较，实施例12中所构建的10个乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒不仅检出率和特异性分别高达100%，而且检测时间短，检测条件温和。按成本价计算，每个样本的检测费平均节省80元，不仅利于医院医保的采购使用，而且给检测者节省了不少检测费用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 奥明（杭州）基因科技有限公司
<120> 一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的引物对，试剂盒及其方法
<141> 2021-11-30
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gctttgggtc tccatgtagt ca 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ttgggggtgc ggtttattca ta 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctctcagtgt cttgaccttc cc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cgcaaaccag gatatcctct gt 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tcaagtgatt cttctggctt agct 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cccggcctgt actcttattc ttta 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ccaatggagt actcttcacc ca 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccagttgtgc cttgcagtat tt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atactgggga tgggactctg at 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gtgtgagagt gaaacaagcg tc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cacacgcttt ttacctgagt gg 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tcactctgtt gcttatgctg gt 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
aaattcactt cccaaagctg cc 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tatgatgaga aagctgggag cc 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
agagtagagg cttgtcccag at 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
cacattcttg tcacactgcc ag 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gtgtggtaga cagttgatac gga 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
taacatggcg gacaaagaca gta 23
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gaaagggatg ggggacttgg 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
tggacaggaa acatcatctg ct 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
aagtcttcgc acagtgaaaa ct 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
agttctgtac tgtggtctca cc 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gccacaaaat gagaccttgt cc 22
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
ctggagtgct ttttgaagcc t 21
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
tgtggtatct ggtagcatct gt 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
tgacctccca gatgcatgtg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
ggatgggcga acggataact 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
ttctggggct tcaagaggtg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
ggctctcctg atgcctgtac 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
ccagcgaggc taggagtttt 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
ctgggtgggg tgtctcattc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
cctggccccc ttttcttcat 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
tggccttagc tagcaggaga 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
aggggaagct aggtgaggaa 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
gcctcttcca actccagctt 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
cggcagctca aatgtttggg 20
Claims (2)
1.一种基于长片段 PCR 检测乳腺癌易感基因变异的引物对，其特征在于，所述引物对包括：
S1. 所述乳腺癌易感基因BRCA1长片段扩增的上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQID 1/SEQ ID 2，SEQ ID 3/ SEQ ID 4，SEQ ID 5/SEQ ID 6，SEQ ID 7/ SEQ ID 8，SEQ ID9/SEQ ID 10，SEQ ID 11/SEQ ID 12，SEQ ID 13/SEQ ID 14，SEQ ID 15/SEQ ID 16和SEQID 17/SEQ ID 18所示；
S2. 所述乳腺癌易感基因BRCA2长片段扩增的上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQID 19/SEQ ID 20，SEQ ID 21/ SEQ ID 22，SEQ ID 23/SEQ ID 24，SEQ ID 25/ SEQ ID26，SEQ ID 27/SEQ ID 28，SEQ ID 29/SEQ ID 30，SEQ ID 31/SEQ ID 32，SEQ ID 33/SEQID 34和SEQ ID 35/SEQ ID 36所示。
2.一种基于长片段PCR检测乳腺癌易感基因变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2长片段扩增的引物对。
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Applications Claiming Priority (1)
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| CN106520917A (zh) * | 2016-09-20 | 2017-03-22 | 美因健康科技（北京）有限公司 | 一种基因的大片段缺失/重复检测的方法 |
| CN108060228A (zh) * | 2016-12-29 | 2018-05-22 | 北京明谛生物医药科技有限公司 | 一种检测brca1和brca2基因变异的检测引物、试剂盒及方法 |
-
2021
- 2021-12-13 CN CN202111516190.9A patent/CN114164271B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 陈雨振等.现代实验客观化诊断 下.西安地图出版社,2006,第580-581页. * |
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