CN113943791B

CN113943791B - UC002yug.2-rs2246640作为女性肥胖生物标志物的应用

Info

Publication number: CN113943791B
Application number: CN202111252168.8A
Authority: CN
Inventors: 徐宏; 苟梦洋; 熊超鹏; 杨博文; 龚成欣; 王亚群
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2041-10-27
Also published as: CN113943791A

Abstract

UC002yug.2‑rs2246640作为女性肥胖生物标志物的应用。本发明通过建立等位基因特异性PCR技术，联合在线数据库和文献筛选出UC002yug.2单核苷酸多态性rs2246640作为肥胖生物标志物，并进一步通过实验验证的方法，分析得出rs2246640位点检测可作为女性肥胖患病风险的预测指标。本发明所述的生物标志物，可在制备女性肥胖诊断产品中应用，并可用作药物设计的分子靶标的筛选，促进肥胖新药开发。本发明建立的检测该生物标志物的方法，可高灵敏度、特异性地应用于rs2246640的检测。

Description

UC002yug.2-rs2246640作为女性肥胖生物标志物的应用

技术领域

本项发明属生物医学领域，具体涉及UC002yug.2基因单核苷酸多态性rs2246640作为女性肥胖的生物标志物的应用。

背景技术

肥胖是一种常见的营养代谢性疾病，是造成人类疾病负担的全球一级风险因素之一。肥胖可引起高血脂、脂肪肝、高血压、心脏病、糖尿病等多种并发症，从而大大增加死亡的风险。此外，肥胖对肿瘤、阻塞性睡眠呼吸暂停和呼吸系统疾病、胆囊疾病、骨关节炎、非酒精性脂肪肝病等疾病的发展也很重要。随着人口老龄化进程的加速，肥胖将日益成为严重危害身体健康的疾病之一，预防肥胖症的流行也是世纪前年世界各国面临的最大公共卫生挑战之一，因此肥胖的早期诊断、及时防治显得尤为重要，亟待寻找一种敏感性高、准确度高且价格合理的诊断肥胖的方法。家系分析和双生子研究表明遗传因素在肥胖发生中起着非常重要的作用。过去有关候选基因的大量研究已经表明，大多数基因与人类脂肪组织中肥胖的发生相关。与人体体质量相关的基因变异可以产生遗传差异。碱基序列多样性(Polymorphism)是指频率超过1％的碱基序列的变异，其中，90％是单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）。人类基因序列99.9％是相同的，大约250～1000bp出现1次SNP，人类基因组里存在约2百万个SNP，其中，基因里存在约21,000个。并且，频率为1％以下的其他单碱基的变异通常被称作突变(mutation)。SNP是个体间最简单的DNA变异形式，是由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP可影响启动子活性（基因表达）、mRNA的稳定性以及mRNA和/或蛋白的亚细胞定位、改变编码的氨基酸或沉默基因的表达等，从而与疾病易感性关联。

人类基因组计划的完成使研究者清楚地了解到仅2%人类基因组产生的转录本具有编码蛋白的功能，98%基因转录本无蛋白编码功能，被称为非编码RNA（Non-coding RNA，ncRNA）。长非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于200个核苷酸的ncRNA，广泛参与到包括染色质修饰、转录调控、转录后调控等过程。长非编码RNA 上SNP可作为标志物，在挖掘肥胖的引发基因或者判定与肥胖之间的相关性方面起到重要作用。因此，分析单碱基多态性，有助于早期鉴定发生肥胖的高危人群。因此，建立简单、快速的肥胖易感人群的筛查方法，能够检测出肥胖相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患肥胖的高危人群，从而提早预防和治疗。这对于降低女性肥胖的发病率有非常重要的意义。

发明内容

为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供了一种筛选与肥胖相关基因分子标志物及检测方法，该标志物为UC002yug.2单核苷酸多态性位点为rs2246640，同时提供了检测该位点的方法，开发了其特异性扩增引物。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案。

UC002yug.2单核苷酸多态性rs2246640作为生物标志物在制备肥胖诊断产品中的应用，所述的诊断产品包括试剂盒、芯片或试纸。

进一步地，所述的诊断试剂盒为PCR检测试剂盒。

进一步地，所述的PCR检测试剂盒包含检测UC002yug.2单核苷酸多态性rs2246640的检测试剂，所述的检测试剂包括检测UC002yug.2单核苷酸多态性rs2246640的上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了所述的生物标志物用作分子靶标进行药物设计筛选的应用。

本发明通过以下方式来实现。

(1)基于等位基因特异性PCR（Allele Specific-PCR，AS-PCR）技术，根据在线数据库和文献选择目标SNP，从受试者的血样中，确定人群中与肥胖发生风险显著相关的SNP分子标记。

(2)全血基因组DNA提取：对血液DNA的提取及纯化按照天根血液基因组DNA抽提及纯化试剂盒说明书进行，质量及浓度检测在NaNoDrop 1000 (Thermo公司)分光光度计上进行，要求OD260/OD280在1.8-2.0之间。筛选SNP：基于文献、HyperGen-GWAS研究及OMIM数据库选择目标SNP。基因分型：我们采用AS-PCR方法进行受试者基因组DNA基因分型，结果筛选出的高风险SNP rs2246640位点。

(3)设计UC002yug.2 SNP rs2246640的上下游引物，对该位点进行检测，验证该位点作为肥胖的生物标志物的可行性。

本发明所述的一种UC002yug.2单核苷酸多态性rs2246640作为肥胖的生物标志物的应用，其具有以下优势。

（1）本发明建立的AS-PCR技术，联合在线数据库和文献选择筛选高风险SNP方法，可用于相关致病基因多态性分子标志物筛选。

（2）本发明的UC002yug.2 rs2246640单核苷酸多态性的检测方法，可用于分析UC002yug.2上的常见SNP的C等位位点，应用对个体是否与肥胖有关系进行考察，以利于开展早期干预和生活习惯的改进。

（3）利用本发明阐述UC002yug.2 rs2246640碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，促进肥胖新药开发。

（4）本发明建立的检测UC002yug.2 rs2246640单核苷酸多态性的核酸序列和相关位点，可高灵敏度，特异性地应用于UC002yug.2检测。

因此，UC002yug.2 rs2246640多态性与肥胖具显著相关性。

附图说明

图1为rs2246640位点的位置分析图。

图2为rs2246640位点在多个重要的enhancer区的分析图。

图3为PCR产物的凝胶电泳图。

图4为rs2246640在正常人和肥胖中变异频率图。

图5为rs2246640与脂肪组织中UC002yug.2表达水平的关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1。 SNP位点的筛选。

建立等位基因特异性PCR（Allele specific-PCR，AS-PCR）方法对受试者基因组DNA基因分型，结合LncRNA、UCSC、Ensembl和Refseq在线数据库，对已报道的与肥胖显著相关的重要染色体区域（21q22）及其上游和下游各1MB范围内的基因间非编码RNA进行筛查。我们筛选出的患病高风险SNP位点。

1、等位基因特异性PCR对420例女性受试者进行基因分型检测，通过基因分型数据分析证实其统计学差异显著，增强人罹患肥胖的风险分别为2.087 (表1)。

表1 rs2246640基因型分布与女性肥胖易感性的logistic回归分析

2、利用rSNPBase (http://rsnp.psych.ac.cn/)、SNPinfo (https://manticore.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.html)和Epigenome(http://epigenomegateway.wustl.edu/browser/)等在线分析工具对rs2246640位点进行了生物信息学分析，发现该位点位于lncRNA UC002yug.2（NR_038885）又名 linc01426，位于21 号染色体 36118272。全长 2564nt，由 3 个外显子组成，分别为 exon1：1-192，exon2：293-258，exon3：259-2546，rs2246640位点位于基因外显子1区域，rSNPBase分析表明rs2246640位点C>T的突变与Distal transcriptional regulation调控有关(图1)。对rs2246640进行分析，发现该SNP位于多个重要enhancer区(图2)。

实施例2。 SNP位点的检测。

建立检测UC002yug.2单核苷酸多态性位点为rs2246640的方法，并开发了其特异性扩增引物。

1、从https://genome-asia.ucsc.edu/cgibin/hgGateway中下载rs2246640位置chr21:36118272(分子标记为C或T)上下游500bp序列(SEQ ID No.2），设计合成引物，检测rs2246640在健康人和肥胖中变异频率。

引物序列如下所示：

上游引物F：5’-CTCTGGGCTTGCCATGAAAG-3’(SEQ ID No.1)，

下游引物R：5’-CAAGGAAGTGCCTGCAAGTG-3’(SEQ ID No.2)。

检测rs2246640分子标记的具体步骤如下。

1)提取样本血中的基因组DNA，使用的试剂盒是天根DP304离心柱型基因组提取试剂盒，提取基因组DNA的来源可以为离体的体液也可以为组织细胞，无具体限定。

2) rs2246640检测：

制备混合液：提取的基因组DNA溶液10ng/mL 1μL、2×Tap^® PCR SuperMix 10μL、10μM前向引物0.4μL、10μM反向引物0.4μL和无核酶水8.2μL，总体积20μL加入PCR管中进行反应，反应条件如下。

3)将制备的PCR产物按5：1的比例与6×的DNA Loading Buffer混合均匀，进行琼脂糖凝胶电泳，在100V恒压条件下电泳1h，然后用Bio-Rad凝胶成像系统进行凝胶结果分析，确认大小335bp (图3)，割胶测序。该测序为常规方法，由上海生工生物工程有限公司提供。

通过结果比对分析得出，其中rs2246640在肥胖病人中T频率为28％，在正常人中T频率为20％ (图4)。rs2246640位点检测将作为肥胖患病风险的预测指标。

2、定量PCR检测不同基因型人脂肪组织中UC002yug.2的表达发现突变型组UC002yug.2显著高于野生型组(图5)。

上述实施例结果验证：

利用PCR-跑胶直接测序法对200例样本进行DNA测序，识别和验证。该测序为常规方法在此不赘述，该测序由上海生物工程有限公司提供。该测序结果证实了本发明分析方法的准确性。

①正常人rs2246640单核苷酸多态性分布。

按实施例的方法测定了100例正常人的基因多态性。20人有T的多态性(20％)。

②肥胖单核苷酸多态性分布。

按实施例的方法测定100例肥胖病人的基因多态性。发现28人有T碱基多态性(28％)。

序列表

<110> 南昌大学

<120> UC002yug.2-rs2246640作为女性肥胖生物标志物的应用

<141> 2021-10-27

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 1

ctctgggctt gccatgaaag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 2

caaggaagtg cctgcaagtg 20

<210> 3

<211> 1001

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

atcaacacag tctgtctagg ttttgactga aaagagaaag gggttgttat gctctaggtt 60

aatattttcc tctctttaag aagtcttggg tatgccagac acttctcgga caaaaacagc 120

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agtcccagcg agtggctcag tcacactggt gcgtgcctct cacccgctct gacctcgtca 720

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atcacctgag gtcaggagtt tgagaccagc ctgaccaaca tggtaaaacc ccgactctac 900

tgaaaataca aaaattagcc aggcgtgaca tcatgcgcct gtaatcccag ctactcggga 960

ggctgaggca ggagaatcgc ttgaacctgg gaggcggatg t 1001

Claims

1.单核苷酸多态性rs2246640的检测试剂在制备肥胖诊断产品中的应用，所述的检测试剂包括检测单核苷酸多态性rs2246640的上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。