JP5904501B2 - 2型糖尿病の検出方法 - Google Patents
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Description
ヨーロッパ人集団で行われたゲノムワイド関連解析(GWAS)により、ゲノムワイド水準の有意差を示す、26のT2D感受性遺伝子座が同定されている。近年、日本人集団においても2つのGWASの結果が同時に報告された。これらの解析規模は比較的小さく、一方の研究では、187人のT2Dに罹患した人(症例)、および752人の罹患していない対照において、82,343のSNPマーカーを(非特許文献1)、もう一方の研究では、194人の症例および1,558人の対照において、207,097のSNPマーカーを解析している(非特許文献2)。両方のGWASは、同じT2D感受性遺伝子座(KCNQ1内)を同定し、さらに、この結果は、東アジア人集団およびヨーロッパ人集団においても確認された(非特許文献1および非特許文献2)。T2Dの臨床像は、人種により様々であるが、ゲノムワイド水準を示すリスク遺伝子座が異なる人種間でどの程度異なっているかは、殆ど明らかにされていない。
UBE2E2遺伝子座またはC2CD4A−C2CD4B遺伝子座の一塩基多型を解析すること、および
この解析結果に基づいて、2型糖尿病を検出すること。
本発明の別の態様は、上述する方法であって、UBE2E2遺伝子座の一塩基多型が、配列番号1、配列番号2、もしくは配列番号3の61番目の塩基に相当する塩基の多型、または、該塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型である、方法である。
本発明の別の態様は、上述する方法であって、C2CD4A−C2CD4B遺伝子座の一塩基多型が、配列番号4、配列番号5、もしくは配列番号6の61番目の塩基に相当する塩基の多型、または、該塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型である、方法である。
本発明の別の態様は、2型糖尿病を検出するためのプローブであって、配列番号1、2、3、4、5もしくは6において61番目の塩基を含む10以上の連続する塩基配列、またはその相補配列を含む、プローブである。
本発明の別の態様は、2型糖尿病を検出するためのプライマーであって、配列番号1、2、3、4、5または6の61番目の塩基を含む領域を増幅することができる、プライマーである。
本発明の方法は、UBE2E2遺伝子座またはC2CD4A−C2CD4B遺伝子座において、2型糖尿病に関連する一塩基多型を解析し、この解析結果に基づいて2型糖尿病を検出することを含む。本発明において、「検出」という用語には、2型糖尿病の発症の危険性の検出、および、発症の存在の有無の検出が含まれる。
C2CD4A−C2CD4B遺伝子座としては、ヒト15番染色体上のC2CD4A−C2CD4B遺伝子座が好ましい。例えば、C2CD4A−C2CD4B遺伝子座は、NCBIのデータベースの登録番号NT_010194.17で登録された配列を含む、遺伝子座であってもよい。
さらに、遺伝子において人種差等があり、置換、欠失等が、2型糖尿病に関連する塩基以外の塩基に生じ得るので、UBE2E2遺伝子座およびC2CD4A−C2CD4B遺伝子座は、上述の配列を含む遺伝子に限定されない。
UBE2E2 ユビキチン結合酵素E2E 2(UBC4/5ホモログ、酵母)[ヒト]
ゲノム NT_022517.18 23184783..23572295
mRNA NP_689866.1
C2CD4Aに関する例示的な情報を以下に示す。
C2CD4A 4Aを含むC2カルシウム依存性ドメイン(C2CD4A C2 calcium-dependent domain containing 4A)[ヒト]
ゲノム NT_010194.17 33149732..33153672
mRNA NP_997205.2
C2CD4B 4Bを含むC2カルシウム依存性ドメイン(C2CD4B C2 calcium-dependent domain containing 4B)[ヒト]
ゲノム NT_010194.17 33246293..33248038、相補鎖
mRNA NP_001007596.2
配列番号1
TCGATTAGCA TGTAATGATT TTGACATTGG CAGGGTGATA AAAGGGAGAA TTGAGAGTAT
R
GAGGGAAGAA AATAAATGCA AGGAGGGAGA AAAAAGAGGA AATAAACAAC AAAGGAAGGA
配列番号2
CAAACCACCC GTCGACTGAC AAATTTAGAT AAGCAAATGT GGTACGGACA CATAGCGAAA
Y
ATTATCTGAC CATAAAAAGG AGTGGAGTGC TGATAAACAC TACAACATGG ATAGACCTTG
配列番号3
TTAAAATTAC TTTCTAAAGC CAATCATTCT GCCTAATACA GGGTCTTCAT TTATTTTTAG
M
TACCTGAAAC TGAGTCTAAA ACCACTTCTC TCTACTTCCT CTTGTCTTTT TCATTTAAAC
配列番号4
GCTGGGCTAC CTCCTTTGGG AGATAGGTTC TGCCCTGTCA CTGTCTACAA AATTGTTAAT
R
TTCCCAAAGA AACTGTCTGG GCCCCCAAGC CCTCTTTTAA GCCAGGAATT GTGACATTTT
配列番号5
GGGCAATTCG GCTGTGGATC CAAATATGTA CACTCCACTC AGCAAAGTGA AACTCCAAAG
R
CAGCCAAGGT ATTTATTACC TGTTGTTACC AGAGCACATC CCTTGGCGTT TTACACCCCA
配列番号5では、SNPをR(G(リスクアレル)>A)と示すように、アンチセンス鎖の配列を示す。
配列番号6
TGGGCCCTCT ACAGCTGTCT TGGGGCTAAA GGGAAGAAGA GGAAATGACA CCTCTGCTGG
Y
GGAATTATAG CCTGCCAGAG TTGGAAAGGA CCTCAGAGAT GATCACTCAA GCCCACCCCC
配列番号6では、SNPをY(C(リスクアレル)>T)と示すように、アンチセンス鎖の配列を示す。
または、増幅産物の有無は、LAMP法(日本国特許第3313358号)、核酸配列に基づく増幅法(NASBA法;日本国特許2843586号)、およびICAN法(特開2002−233379号)を用いて決定してもよい。また、一本鎖増幅法等の他の方法のいずれかを使用してもよい。
例えば、UBE2E2遺伝子座の配列番号1の61番目の塩基に相当する塩基に基づいて、2型糖尿病を検出する場合には、塩基がGである場合、2型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、2型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。さらに、対立遺伝子の多型を考慮することによって、2型糖尿病を検出することができる。例えば、遺伝子
型が、GG対立遺伝子またはAG対立遺伝子である場合、AA対立遺伝子と比較して、2型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、2型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。
本発明では、2型糖尿病を検出するためのプライマーおよびプローブ等の検出試薬を提供する。プローブの例には、配列番号1、2、3、4、5もしくは6において61番目の塩基を含む連続する配列、またはその相補配列を含む、プローブが含まれる。
さらに、プライマーの例には、配列番号1、2、3、4、5または6の61番目の塩基の多型を識別することができるプライマー、例えば、配列番号1、2、3、4、5または6の61番目の塩基を含む領域を増幅することができるプライマーが含まれる。プライマーは、多型部位を含む領域(好ましくは、50から1,000塩基の長さを有する領域)
の両側で設計された、1組の順方向プライマーと逆方向プライマーであってもよい。さらに、シークエンス解析または一本鎖増幅に使用する場合、プライマーの例は、上述の多型塩基の5’側領域、好ましくは、多型部位から30から100塩基上流の領域の配列を有するプライマー、または、上述の多型塩基から3’側の領域に相補的な配列を有するプライマー、好ましくは、30から100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーであってもよい。PCRにおける増幅の有無に基づいて多型を決定するのに使用するプライマーには、配列番号1、2、3、4、5または6において連続する配列を含み、上述の多型塩基を3’側に含むプライマー、および、配列番号1、2、3、4、5または6において連続する配列の相補配列を含み、上述の多型塩基に相補的な塩基を3’側に含むプライマーが含まれる。
かかるプライマーおよびプローブの長さは、特に限定されず、例えば、10から100塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが好ましく、15から50塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドがより好ましく、また、20から35塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドがより好ましい。さらに、本発明の検出試薬は、これらのプライマーおよびプローブの他に、PCRポリメラーゼおよびバッファーをさらに含むものであってもよい。
本発明のスクリーニング方法は、次に示すステップを含む、2型糖尿病の治療法をスクリーニングするための方法である:UBE2E2またはC2CD4Aおよび/またはC2CD4Bを含むスクリーニング系に、医薬候補物質を加えること;UBE2E2またはC2CD4Aおよび/またはC2CD4Bの活性を測定すること;ならびに、活性を変化させる物質を選択すること。
a HumanHap610-Quad)、および550Kビーズチップ(BeadChip)をそれぞれ使用して、バイオバンクジャパン(BioBank Japan) (//biobankjp.org/)から収集した、4,878人のT2Dに罹患した人(ここで、この群を症例1と称する)、および3,345人の対照(対照1と称する)の遺伝子型を解析した。主成分解析(principal component analysis)を最初に行った結果、過去の報告と同様に(Am. J. Hum. Genet. 83, 445-456 (2008))、日本人集団では、本土および琉球の2つの主なクラスターが存在した。そこで、第1段階のゲノムスキャンでは、T2Dとの関連解析のために、本土クラスターに属する7,541人(4,470人の症例および3,071人の対照)を選択した(図1)。我々は、相加的関連モデルを用いたアーミテージトレンド検定により、459,359個の良好に判定されたSNPの遺伝子型頻度を比較した(ゲノムインフレーションスコア(genomic inflation score)λ=1.10、レファレンスλ1,000=1.03)(Nat. Genet. 36, 388-393 (2004))。その結果、16のゲノムワイド水準(P<5×10−8)の関連を示す、KCNQ1内の1個のSNPを同定した。
パク質の機能的役割は十分に解明されていない。またC2CD4A−C2CD4B遺伝子発現は、ヒトの膵臓、肝臓、筋肉、および脂肪組織、ならびに培養インスリン分泌細胞系で認められ、炎症誘発サイトカインによる処理によって増加することが報告されている(Gene 342, 85-95 (2004))が、T2D疾患感受性の付与におけるC2CD4A−C2CD4Bの関与を示す証拠は、これまで報告されていない。
Claims (3)
- 2型糖尿病を検出する方法であって、
UBE2E2遺伝子座の配列番号1、配列番号2もしくは配列番号3の61番目の塩基に相当する一塩基多型またはC2CD4A−C2CD4B遺伝子座の配列番号4、配列番号5もしくは配列番号6の61番目の塩基に相当する一塩基多型を解析すること、および
該解析結果に基づいて、
配列番号1の61番目の塩基に相当する塩基がGの場合;
配列番号2の61番目の塩基に相当する塩基がTの場合;
配列番号3の61番目の塩基に相当する塩基がCの場合;
配列番号4の61番目の塩基に相当する塩基がAの場合;
配列番号5の61番目の塩基に相当する塩基がGの場合;または、
配列番号6の61番目の塩基に相当する塩基がCの場合、
2型糖尿病の発症の危険性が高い、または、2型糖尿病に罹患する可能性が高いと判定されることにより2型糖尿病を検出することを含む、方法。 - 2型糖尿病を検出するためのプローブであって、
配列番号1、2、3、4、5もしくは6において61番目の塩基を含む10以上の連続する塩基配列、または、その相補配列を含む、プローブ。 - 2型糖尿病を検出するためのプライマーであって、
配列番号1、2、3、4、5または6の61番目の塩基を含む領域を増幅することができる、プライマー。
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